專利名稱：：羊乳及其乳制品中摻入牛乳的快速免疫學檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明為食品質量與安全的免疫學快速檢測技術，具體是一種羊乳及其乳制品中摻入牛乳成分的快速免疫檢測方法。二、技術背景s1.國內羊乳生產的現(xiàn)狀與摻假檢驗技術的需要與牛乳相，羊乳及其制品比由于其更易消化，具有特殊的風味，對一些牛乳過敏者的不良反應較少，是人類重要的特色營養(yǎng)食品。而中國奶羊養(yǎng)殖規(guī)模一般較小，多為高多分散的農戶散養(yǎng)，同時受到季節(jié)波動性影響致使羊乳的價格比牛奶高，在羊乳中摻入牛乳的現(xiàn)象時有發(fā)生[1]，這種摻假不僅在液態(tài)羊乳和羊乳粉等終產品中，更多地會出現(xiàn)在原料乳的收購過程，所以為了保護羊乳加工生產者和消費者的利益，急需建立一種適宜于現(xiàn)場快速檢測羊乳摻入牛乳的方法，以確保羊乳制品的質量和安全。我國羊乳的生產加工與流通領域的快速檢測主要應用于以下三方面①我國奶羊養(yǎng)殖的特點是高度分散，且很容易受到季節(jié)波動的影響，羊乳原料乳的收購主要針對小規(guī)模的千家萬戶，急需一種適應這種生產狀況的原料乳檢驗方法；②羊乳粉原料主要面向國內的羊乳制品生產者及出口貿易，對羊乳粉的要求高，如出口東南亞的羊乳粉貿易對其中牛乳成分的可檢出率必須不大于5%的苛刻要求，也對檢測的靈敏度和方便快速有較高的要求；③個體消費者從市場購買羊乳制品更需要一種快速檢驗方法。綜上所述，國內急需一種不需要特殊的儀器設備的快速檢驗方法。2.羊乳中摻入牛乳檢驗方法研究現(xiàn)狀羊乳中摻入牛乳不同于一般的乳品摻假檢驗(常見的一類是摻入危及人體健康的有害物質，如為了提高摻水比重的尿素，防止牛乳中細菌超標的甲醛、硼酸等有害防腐劑；另一類是摻入無害的價廉物質，包括水、米湯和面湯、豆?jié){、蔗糖、食鹽等，為了應付脂肪指標加入植物油，加入淀粉和糊精提高固形物，以及廉價的明膠、大豆蛋白粉和乳清粉等以提高蛋白質，其目的在于以低值成分充高值成分)，這種針對羊乳中的乳源性慘假檢驗，由于羊乳與牛乳的化學同源性更強，一般的理化性質差別小，僅通過簡單的密度、電導、色度、滋味等，一般的化學分析(總固形物、脂肪通用的蛋白質)測定是難以區(qū)分的，這種需要區(qū)別乳源性的對方法的區(qū)別檢驗要求高。國外對檢測羊乳中摻入牛乳成分的方法的研究綜合起來可分為非免疫學方法和免疫學兩大類:①非免疫學方法:國內外近年用于羊乳的乳源性摻假的非免疫學方法包括色譜技術(高效液相色譜技術等)，電泳技術(聚丙烯酰胺凝膠電泳，等電點聚焦以及毛細管電泳等)，PCR技術。氣相色譜、各種電泳(SDS-PADE、IEF、CF)和PCR技術等，其結果雖然準確可靠，但對儀器技術的依耐性強，試劑種類多，實驗費用高，實驗需要的時間費時長，不適合現(xiàn)場分析檢測。色譜技術，常用的包括氣象和液相色譜技術。氣相色譜法是以牛乳與羊乳中所含脂肪酸含量的不同為依據(jù)進行檢測分析的。液相色譜主要應用高效液相色譜技術(HPLC)、反相色譜技術、離子交換色譜技術，通過將乳中脂肪、蛋白質等成分高效分離進行檢測比較，這種類方法都需要比較專業(yè)化的大型儀器，既耗時又費力，而且只能檢測羊乳中是否含有牛乳成分，較難準確定量。電泳技術，電泳分析是將蛋白質至于一定的電場中，利用不同蛋白質的電荷和分子量所決定的電遷移率不同進行高效分離，實現(xiàn)對乳品多種蛋白質組分同時定性定量分析，多數(shù)實驗室采用凝膠電泳(SDS-PAGE),費時費力，實驗重復性較差，研究最熱的是毛細管電泳(CE)，可以實現(xiàn)自動化速度高效分析，但是需要昂貴的大型儀器，僅海關和質檢部門使用，電泳方法對儀器設備和操作技術有較高要求，不適應現(xiàn)場快速檢測需要。PCR技術，以DNA為基礎的聚合酶鏈式反應(PCR)方法成功地應用于乳品摻假檢測中。它是以牛特異性基因一線粒體12SrRNA基因中的223bp片段為靶基因進行檢測的。PCR方法有較強的專一性更強。但是，PCR所需的專業(yè)技術較強，所需試劑昂貴。但是現(xiàn)在發(fā)展的用于此方面的PCR技術[17]只能用于鑒別，而不能夠檢測出其中牛乳的具體摻入量。②免疫學方法免疫學方法是能夠實現(xiàn)這一要求的分析檢驗方法。傳統(tǒng)的瓊脂擴散試驗、火箭免疫電泳、紅細胞凝集抑制試驗和免疫印跡法]雖然從方法的精確靈敏度反面能滿足，但是這些方法存在的缺點明顯，一是需要的實驗時間較長，二是要求很高的抗血清濃度。酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)在乳品鑒定摻假方面具有很大的應用潛力。它與其他現(xiàn)代分析方法不同之處在于其高科技建立于試劑而不是設備，無需高昂的設備或者專業(yè)的操作人員，就能實現(xiàn)明確、可靠的成分探索分析。Rodriguez,E.，Martin,R等(1990)用牛乳清蛋白(BWP)作為抗原免疫兔，抗血清經過親和色譜純化用生物素標記后建立ELISA檢測方法。Beer等(1995)利用牛乳中的0-乳球蛋白作為抗原免疫雞，將獲得的雞抗血清純化后得到雞抗牛e-乳球蛋白抗體，同時將羊抗雞堿性磷酸酶結合物作為競爭物建立間接競爭型ELISA檢測方法。Richter，W和Krause，I等(1997)用牛乳中的Y-酪蛋白作為抗原免疫注射兔和雞得到抗血清，將抗血清通過以牛酪蛋白作為配基的親和色譜柱純化獲得抗牛P-CN的特異性多克隆抗體建立間接競爭型ELISA檢測方法。Martin，R等(1995-2005)用牛乳中的P-CN為抗原，通過雜交瘤技術制備了單克隆抗體，并且結合酶標兔抗鼠抗體建立了間接ELISA方法。Hurley等(2004)用牛乳中的IgG為抗原制備單克隆抗體建立了間接競爭和夾心IgGELISA方法檢測羊乳中摻入的牛乳含量。單克隆抗體具有非常高的專一性，方法檢測最低限度為百分之一以下，但是單克隆抗體研發(fā)技術路線復雜，成本高，針對原料乳收購等底端市場在國內還難以應用，國外針對羊乳摻假檢驗不同于中國，主要是針對山羊乳中摻入綿羊乳(以羊奶酪制品為多)，目前國內缺乏一種有效簡捷的方法來定量檢測羊乳及其乳制品中摻入的牛乳成分。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是要提供一種羊乳及其乳制品中摻入牛乳的快速免疫學檢測方法，以克服現(xiàn)有技術存在的技術路線復雜、不易于操作、成本高且需時長的問題。本發(fā)明的設計路線是以牛乳的一種代表性酪蛋白作為抗原產生哺乳動物血清抗體，將抗體采用特殊的選擇性處理，再將待測羊乳(疑是摻假樣品)進行脫脂處理，應用制備的抗體建立了適合現(xiàn)場快速檢測的檢測羊乳中摻入牛乳含量的ELISA方法。本發(fā)明所提供的技術方案是一種羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于包括下述步驟(1)選擇牛乳酪蛋白的特異穩(wěn)定組分為抗原免疫哺乳動物產生抗體(2)處理兔血清抗體，制備得到檢測用高特異性抗體將免疫血清抗體稀釋于PBST緩沖液中(抗體濃度2.0mg/ml)，然后與羊乳P-酪蛋白混合(按1.0mg/ml凍干蛋白加入，置37。C培養(yǎng)2小時，再于4'C下過夜，目的是免疫吸收消除多克隆血清抗體與羊乳中存在的交叉抗原的非特異反應(交叉反應)，從而得到特異性高的檢測用抗體；(3)用免疫學檢測方法進行檢測。上述步驟(1)的具體步驟包括①選擇牛乳中含量高，組成穩(wěn)定的P-酪蛋白作為抗原牛e-酪蛋白的制備是將干酪素5g溶于100mlpH12.0的3.3mol/L的尿素中，調節(jié)PH4.6，3000r/min離心10分鐘得到沉淀和上清液。向上清液加水使尿素濃度稀釋至0.5mol/L，再一次離心得到沉淀，后者得到e-酪蛋白，P-酪蛋白作為抗原用于免疫及抗體檢測的標準；②兔抗牛酪蛋白多克隆抗體的制備用牛e-酪蛋白免疫新西蘭白兔。以2mg/只為免疫劑量，初次注射用弗式完全佐劑混合，充分乳化后于背部皮下多點注射，IO天后，與等量弗式不全佐劑充分乳化后，進行第一次加強免疫。以后間隔7天再加強三次，到第35天效價達到最高1:104以上并維持一周后，對兔進行頸脈放血，室溫放置l小時后，800Xg離心分離并收集血清，存放于-20。C冰箱備用。血清的純化采用飽和硫酸銨分級沉淀法，依次以50%、40%、33%的飽和硫酸銨純化一次；上述步驟(2)中羊乳e-酪蛋白的制備方法是將干酪素5g溶于100mlpH12.0的3.3mol/L的尿素中，調節(jié)pH4.6，3000r/min離心10分鐘得到沉淀和上清液。向上清液加水使尿素濃度稀釋至0.5mol/L，再一次離心得到沉淀，后者得到e-酪蛋白。上述步驟(3)中的檢測方法是應用得到的特異抗體應用間接ELISA定量檢測羊乳及其乳制品中摻入的牛乳成分，上述步驟(3)中檢測應用時最適抗原包被濃度，抗體最佳工作濃度可根據(jù)棋盤滴定法來確定，樣品的最佳包被濃度為l:128，免疫吸收后的抗體稀釋為1:40，酶標二抗稀釋度為1:1000。上述步驟(3)中用包被緩沖液將待測樣品適當稀釋包被酶標板，100u1/孔，4t過夜，用PBST洗板3次，加入100yl1%明膠封閉1小時，洗板；加入免疫吸收后的兔抗牛e-酪蛋白多抗100ul/孔，37'C孵育2小時。洗板5次后，將殘留的異種抗原以及為吸附的抗體除去；加100iil/孔體積比為1:1000稀釋的酶標羊抗兔IgG，37-C孵育l小時，洗板；加入服？的底物緩沖液01^+H202)100u1/孔，室溫下避光孵育20分鐘后，用濃度為2mol/L的硫酸終止反應，50p1/孔；酶聯(lián)檢測儀上450nm處讀取吸光度(A45。)。上述步驟(3)中在定量時，使用標準的陰性(脫脂純山羊乳)和陽性(羊乳中摻入一定量牛乳)樣品作控制，陽性樣品采用脫脂羊乳中摻入牛乳的不同梯度含量(V/V)為:0，1，2,3，4,5,6，7，8，9，10%,以此濃度梯度樣品制作標準曲線，或作為目視比色標準樣品；抗原抗體反應結合后使用酶標二抗在進行間接的顯色測定，定量測定可以采用酶標儀在450nm波長下測定吸光值，也可在現(xiàn)場采用與相應的系列陽性標準顯色的酶標板直接目視比色判斷。上述步驟(3)中的檢測方法是競爭性ELISA檢測方法。上述方法的具體步驟包括①對抗體的純化將本發(fā)明方法處理兔血清抗體采用凝膠過濾(S印hadexG-100)純化，制得的純化抗體用于競爭法檢測；②抗原的酶標將純化的牛酪蛋白使用辣根過氧化物酶(HRP)酶標(采用過碘酸鈉氧化法，透析后再用S印hadexG-100凝膠過濾純化)，冷凍干燥；③建立競爭ELISA用于羊乳中摻入的牛乳成分的快速檢測A、用以上純化的抗體包被酶標板(濃度由棋盤法確定)；B、設測定管和對照管測定管加待測羊乳樣品和一定量的酶標抗原，溫育使二者與固相抗體競爭結合；對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合；分別充分洗滌，除去未結合的成分；C、加底物顯色，分別測定兩管的光密度(OD)值，根據(jù)對照管與測定管OD值之比，計算標本中待測抗原含量。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是1、檢測效果好本發(fā)明特異性與靈敏度高，檢測時間短，該法檢測羊乳中所摻入牛乳含量的最低限為1-2%(V/V)。2、成本低本發(fā)明中提供的試劑價格低廉，實驗操作方便，不需特殊的儀器設備，適合現(xiàn)場快速檢測需要，可以滿足有關研究單位，質檢部門批量檢測相關乳品質量的需要。3、適用范圍廣可用于新鮮的羊乳原料、羊乳粉及液態(tài)滅菌羊乳(復原羊乳)等羊乳產品中摻入牛乳的快速檢測。四、說明書附圖圖1羊乳及其乳制品中摻入牛乳成分的免疫學檢測流程；圖2新西蘭白兔免疫后抗體效價變化(4表示加強免疫時)。五具體實施例方式下面將通過具體實施例對本發(fā)明做詳細的說明。一種羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，包括下述步驟(1)選擇牛乳酪蛋白的特異穩(wěn)定組分為抗原免疫哺乳動物產生抗體；①選擇牛乳中含量高，組成穩(wěn)定的e-酪蛋白作為抗原。牛P-酪蛋白的制備將干酪素5g溶于100mlpH12.0的3.3mol/L的尿素中，調節(jié)pH4.6,3000r/min離心10分鐘得到沉淀和上清液。向上清液加水使尿素濃度稀釋至0.5mol/L,再一次離心得到沉淀，后者得到e-酪蛋白。3-酪蛋白作為抗原用于免疫及抗體檢測的標準。②兔抗牛0-酪蛋白多克隆抗體的制備。用牛3-酪蛋白免疫新西蘭白兔。以2mg/只為免疫劑量，初次注射用弗式完全佐劑混合，充分乳化后于背部皮下多點注射。IO天后，與等量弗式不全佐劑充分乳化后，進行第一次加強免疫。以后間隔7天再加強三次，到第35天效價達到最高1:104以上并維持一周后，對兔進行頸脈放血。室溫放置l小時后，800Xg離心分離并收集血清，存放于-20'C冰箱備用；血清的純化釆用飽和硫酸銨分級沉淀法，依次以50%、40%、33%的飽和硫酸銨純化一次。選用牛乳3-酪蛋白作為抗原制備動物多克隆抗體是本發(fā)明重要部分，由于酪蛋白是乳中含最量高的蛋白質，約占總乳蛋白質的80%85%，而牛乳中的e-酪蛋白又是酪蛋白中含量最穩(wěn)定的一種，同時牛乳e-酪蛋白具有良好的免疫原性，從其免疫血清抗體的效價變化曲線已明確顯示。(參見圖2)(2)處理兔血清抗體，制備得到檢測用高特異性抗體。將免疫血清抗體稀釋于PBST緩沖液中(抗體濃度2.0mg/ml),然后與羊乳e-酪蛋白混合(按1.0mg/ml凍干蛋白加入，羊乳e-酪蛋白的制備與1.牛e-酪蛋白的制備方法相同)，置37'C培養(yǎng)2小時，再于4-C下過夜，目的是免疫吸收消除多克隆血清抗體與羊乳中存在的交叉抗原的非特異反應(交叉反應)，從而得到特異性高的檢測用抗體。這一步是本發(fā)明的核心內容，通過用羊乳中存在的共同抗原對多克隆抗體的充分反應(羊乳8-酪蛋白凍干粉混合)，如此可將與羊乳酪蛋白產生交叉反應的抗體封堵(blocking)，從而去除非專一的抗體而得到種源專一性的抗體，該方法可稱為抗體的區(qū)分特異化技術(Rending),不需要通過復雜的(親和層析的方法)純化消除抗體的交叉反應，本實驗方法操作簡單，反應混和液不需專門的純化分離步驟(在其后的間接ELISA洗滌步驟可將殘留的羊乳抗原以及交叉反應后的產物除去，不影響檢測反應)。通過本步驟操作可以大大提高多克隆抗體免疫反應的專一性(實驗結果見表，可以提高檢測方法的靈敏度實現(xiàn)，而血清多克隆抗體的制備方便，成本低廉，使用能滿足要求，這是本發(fā)明最大的特點)。表l原抗體與牛乳、羊乳酪蛋白的間接ELISA結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2抗體經免疫吸附后與牛乳、羊乳酪蛋白的間接ELISA結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3)用免疫學檢測方法進行檢測下面提供了兩種方法第一種方法建立間接酶聯(lián)免疫吸附(間接ELISA)測定方法，即直接使用處理的抗體應用間接ELISA檢測應用得到的特異抗體應用間接ELISA定量檢測羊乳及其乳制品中摻入的牛乳成分，其操作程序見圖1，具體步驟是用包被緩沖液將待測樣品適當稀釋包被酶標板，100nl/孔，4"C過夜。用PBST洗板3次。加入100^11%明膠封閉1小時，洗板；加入免疫吸收后的兔抗牛e-酪蛋白多抗100ul/孔，37°C孵育2小時。洗板5次后，將殘留的異種抗原以及為吸附的抗體除去；加100lU/孔體積比為1:1000稀釋的酶標羊抗兔IgG，37°〇孵育1小時，洗板；加入HRP的底物緩沖液0￥8+HA)100u1/孔，室溫下避光孵育20分鐘后，用濃度為2mol/L的硫酸終止反應，50ul/孔；酶聯(lián)檢測儀上450nm處讀取吸光度450咖)o本發(fā)明檢測應用時最適抗原包被濃度，抗體最佳工作濃度可根據(jù)棋盤滴定法來確定。樣品的最佳包被濃度為l:128，免疫吸收后的抗體稀釋為1:40，酶標二抗稀釋度為l:1000。本發(fā)明在定量時，使用標準的陰性(脫脂純山羊乳)和陽性(羊乳中摻入一定量牛乳)樣品作控制，陽性樣品采用脫脂羊乳中摻入牛乳的不同梯度含量(V/V)為O，l，2，3,4，5，6，7，8，9,10%,以此濃度梯度樣品制作標準曲線，或作為目視比色標準樣品。該法的檢測羊乳中所摻入牛乳含量的最低限為1-2%(V/V)?？乖贵w反應結合后使用酶標二抗在進行間接的顯色測定，定量測定可以采用酶標儀在450nm波長下測定吸光值，也可在現(xiàn)場采用與相應的系列陽性標準顯色的酶標板直接目視比色判斷。實施例1:免疫學檢測原料羊乳中摻入的牛乳成分①樣品準備將待檢羊乳離心13000Xg，10分鐘后過濾得到脫脂乳。同時用羊乳中摻入牛乳不同含量(V/V)(0，1，2，3，4，5,6,7，8,9,10%梯度)樣品作為制作標準曲線的樣品。②樣品及標準曲線樣品包被酶標板樣品及標準曲線樣品按l:128稀釋包被酶標板。用PBST洗板3次；加入100u11%明膠封閉1小時，洗板。③免疫反應向酶標板加入免疫吸收后的兔抗牛0-酪蛋白多抗100P1/孔，37'C孵育2小時。洗板5次后；④加二抗檢測加100u1/孔體積比為1:1000稀釋的酶標羊抗兔IgG，37-C孵育1小時，洗板；⑤酶顯色反應加入HRP的底物緩沖液(TMB+H202)100y1/孔，室溫下避光孵育20分鐘后，用濃度為2mol/L的硫酸終止反應，50ul/孔；⑥結果檢測與計算酶聯(lián)檢測儀上450咖處讀取吸光度(A450nm)。繪制標準曲線，由標準曲線換算出待測樣品中摻入的牛乳含量。利用建立的間接ELISA對樣品進行檢測，原料羊乳中摻入的牛乳成分最低檢測限度為1%2%。實施例2:免疫學檢測羊乳粉中摻入的牛乳成分①樣品準備將羊乳粉按比例(1:6)加水充分溶解制得復原乳，再按以上的液態(tài)原料乳制樣。②⑤步驟操作同實施例一的②⑤。⑥結果檢測與計算采用實例l相同的測定。計算時乘上羊乳粉溶解時的稀釋倍數(shù)即可。實施例3:免疫學檢測復原羊乳中摻入的牛乳成分①樣品準備商品供應的巴氏滅菌羊乳(62°C，30分鐘)以及高溫滅菌(121°C，20分鐘)羊乳，直接取樣，處理實例l相同的樣品處理方。以不同0，1,2,3，4,5，6，7，8，9，10%梯度含量(V/V)將牛乳摻入復原羊乳中作為樣品。②⑥同實施例1的②⑥步驟。第二種方法對處理的抗體酶標建立競爭法快速檢測方法①對抗體的純化將本發(fā)明方法處理兔血清抗體采用凝膠過濾(S印hadexG-100)純化，制得的純化抗體用于競爭法檢測。②抗原的酶標將純化的牛酪蛋白使用辣根過氧化物酶(HRP)酶標(采用過碘酸鈉氧化法，透析后再用S印hadexG-100凝膠過濾純化)，冷凍干燥；③建立競爭ELISA用于羊乳中摻入的牛乳成分的快速檢測a用以上純化的抗體包被酶標板(濃度由棋盤法確定)；b設測定管和對照管測定管加待測羊乳樣品和一定量的酶標抗原，溫育使二者與固相抗體競爭^口no對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合。分別充分洗滌，除去未結合的成分；c加底物顯色，分別測定兩管的光密度(OD)值，根據(jù)對照管與測定管OD值之比，計算標本中待測抗原含量。結合于固相的酶標抗原與待測抗原含量呈負相關。同實例一，制作相應的用羊乳中摻入牛乳不同含量(V/V)(0，1,2，3，4,5,6，7，8，9，10%梯度)樣品作為制作標準曲線的樣品。權利要求1、羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于包括下述步驟(1)選擇牛乳酪蛋白的特異穩(wěn)定組分為抗原免疫哺乳動物產生抗體(2)處理兔血清抗體，制備得到檢測用高特異性抗體將免疫血清抗體稀釋于PBST緩沖液中(抗體濃度2.0mg/ml)，然后與羊乳β-酪蛋白混合(按1.0mg/ml凍干蛋白加入，置37℃培養(yǎng)2小時，再于4℃下過夜，目的是免疫吸收消除多克隆血清抗體與羊乳中存在的交叉抗原的非特異反應(交叉反應)，從而得到特異性高的檢測用抗體；(3)用免疫學檢測方法進行檢測。2、根據(jù)權利要求l所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于所述步驟(1)的具體步驟包括①選擇牛乳中含量高，組成穩(wěn)定的e-酪蛋白作為抗原牛酪蛋白的制備是將干酪素5g溶于100mlpH12.0的3.3mol/L的尿素中，調節(jié)pH4.6，3000r/min離心10分鐘得到沉淀和上清液。向上清液加水使尿素濃度稀釋至0.5mol/L，再一次離心得到沉淀，后者得到P-酪蛋白，e-酪蛋白作為抗原用于免疫及抗體檢測的標準；②兔抗牛e-酪蛋白多克隆抗體的制備用牛e-酪蛋白免疫新西蘭白兔。以2mg/只為免疫劑量，初次注射用弗式完全佐劑混合，充分乳化后于背部皮下多點注射，IO天后，與等量弗式不全佐劑充分乳化后，進行第一次加強免疫。以后間隔7天再加強三次，到第35天效價達到最高1:104以上并維持一周后，對兔進行頸脈放血，室溫放置l小時后，800Xg離心分離并收集血清，存放于-2(TC冰箱備用。血清的純化采用飽和硫酸銨分級沉淀法，依次以50%、40%、33%的飽和硫酸銨純化一次；上述步驟(2)中羊乳3-酪蛋白的制備方法是將干酪素5g溶于100mlpH12.0的3.3mol/L的尿素中，調節(jié)pH4.6，3000r/min離心10分鐘得到沉淀和上清液。向上清液加水使尿素濃度稀釋至0.5mol/L，再一次離心得到沉淀，后者得到P-酪蛋白。3、根據(jù)權利要求1或2所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于:所述步驟(3)中的檢測方法是應用得到的特異抗體應用間接ELISA定量檢測羊乳及其乳制品中摻入的牛乳成分。4、根據(jù)權利要求3所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中檢測應用時最適抗原包被濃度，抗體最佳工作濃度可根據(jù)棋盤滴定法來確定，樣品的最佳包被濃度為l:128，免疫吸收后的抗體稀釋為l:40，酶標二抗稀釋度為l:1000。5、根據(jù)權利要求4所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于上述步驟(3)中用包被緩沖液將待測樣品適當稀釋包被酶標板，100ul/孔，4'C過夜，用PBST洗板3次，加入100ul1%明膠封閉1小時，洗板；加入免疫吸收后的兔抗牛P-酪蛋白多抗100ul/孔，37匸孵育2小時。洗板5次后，將殘留的異種抗原以及為吸附的抗體除去；加100"1/孔體積比為1:1000稀釋的酶標羊抗兔IgG，37'C孵育1小時，洗板；加入朋？的底物緩沖液016+H202)100u1/孔，室溫下避光孵育20分鐘后，用濃度為2mol/L的硫酸終止反應，50ul/孔；酶聯(lián)檢測儀上450nm處讀取吸光度(A棚咖)。6、根據(jù)權利要求5所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中在定量時，使用標準的陰性(脫脂純山羊乳)和陽性(羊乳中摻入一定量牛乳)樣品作控制，陽性樣品采用脫脂羊乳中摻入牛乳的不同梯度含量(V/V)為:0,1，2,3，4，5，6，7，8，9，10%,以此濃度梯度樣品制作標準曲線，或作為目視比色標準樣品；抗原抗體反應結合后使用酶標二抗再進行間接的顯色測定，定量測定可以采用酶標儀在450nm波長下測定吸光值，也可在現(xiàn)場采用與相應的系列陽性標準顯色的酶標板直接目視比色判斷。7、根據(jù)權利要求1或2所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于所述步驟(3)中的檢測方法是競爭性ELISA檢測方法。8、根據(jù)權利要求1或2所述的羊乳及其制品中摻入牛乳的免疫學檢測方法，其特征在于所述方法包括下述步驟①對抗體的純化將本發(fā)明方法處理兔血清抗體采用凝膠過濾(S印hadexG-100)純化，制得的純化抗體用于競爭法檢測；②抗原的酶標將純化的牛酪蛋白使用辣根過氧化物酶(服P)酶標(采用過碘酸鈉氧化法，透析后再用S印hadexG-100凝膠過濾純化)，冷凍干燥；③建立競爭ELISA用于羊乳中摻入的牛乳成分的快速檢測a、用以上純化的抗體包被酶標板(濃度由棋盤法確定)；b、設測定管和對照管測定管加待測羊乳樣品和一定量的酶標抗原，溫育使二者與固相抗體競爭結合；對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合；分別充分洗滌，除去未結合的成分；c、加底物顯色，分別測定兩管的光密度(OD)值，根據(jù)對照管與測定管0D值之比，計算標本中待測抗原含量。全文摘要本發(fā)明為食品質量與安全的免疫學快速檢測技術，具體是一種羊乳及其乳制品中摻入牛乳成分的快速免疫檢測方法。為克服現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明采用牛乳特異性酪蛋白免疫哺乳動物產生抗體，將制備的血清抗體與羊乳的共同抗原反應得到特異性抗體，再將待測羊乳(疑是摻假樣品)進行脫脂處理，應用制備特異抗體建立間接ELISA定量出羊乳中摻入的牛乳含量。本發(fā)明試劑價格低廉，實驗操作方便，不需特殊的儀器設備，適合現(xiàn)場快速檢測需要，可以滿足有關研究單位，質檢部門批量檢測相關乳品質量的需要。文檔編號G01N33/543GK101271107SQ20081001791公開日2008年9月24日申請日期2008年4月9日優(yōu)先權日2008年4月9日發(fā)明者宋宏新,薛海燕,燕韓申請人:陜西科技大學