專利名稱：能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫層析方法，特別是涉及一種不用對(duì)于現(xiàn)有免疫層析裝置進(jìn)行
較大改變的情況下，能夠同時(shí)進(jìn)行多種分析物檢測的方法，該方法可應(yīng)用于自身免疫診斷 等方面。
背景技術(shù)：
免疫層析法(Imm皿ochromatography)是九十年代興起的一種基于免疫膠體金技 術(shù)的快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的 硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定 有抗體的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該 區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。 現(xiàn)有的免疫層析法，一般在固相上包被有兩條線，一條作為測試線，一條作為質(zhì)控 線(如圖l)，但這種處理方法的結(jié)果只能針對(duì)一種被分析物進(jìn)行分析，如果需要同時(shí)檢測 多種物質(zhì)，則需要準(zhǔn)備多種測試條，并采用多份樣品進(jìn)行測試。 而目前，能夠同時(shí)檢測多種分析物的方法，如自身免疫診斷產(chǎn)品應(yīng)用的方法，其中 包括免疫印跡法(Westernblot)，其構(gòu)造為在一條膜條上同時(shí)平行包被有多種抗原。進(jìn)行測 試時(shí)，需要使用搖床，鑷子，溫浴槽等輔助工具。在這種情況下，如果使用常規(guī)的層析方法進(jìn) 行測試，在前后兩個(gè)條帶含有交叉反應(yīng)抗原位點(diǎn)的情況下，樣品流經(jīng)前個(gè)條帶后再經(jīng)過接 下去的條帶，很有可能會(huì)影響結(jié)果，從而影響判讀，或由于前一條測試帶反應(yīng)過于強(qiáng)烈，使 剩余膠體金量不夠進(jìn)行余下的反應(yīng)，從而影響結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析 方法，該方法可利用一種原理和一種試劑進(jìn)行多種測試，節(jié)約了改換模具的成本及樣品的 使用量，操作更為簡便。 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一種能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方 法，步驟包括 (1)按常規(guī)方法制備顯色劑；
(2)抗原或抗體顯色劑標(biāo)記制備 將顯色劑與多種樣品分析物相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體按比例混合，使顯色劑與抗原或 抗體形成穩(wěn)定的體系，純化濃縮，形成抗原或抗體顯色劑標(biāo)記，該標(biāo)記最終包被于玻璃纖維 上后，制備成顯色劑標(biāo)記；
(3)測試條制備 測試條由背襯(塑料板或硬化板)、吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及步驟(2) 制備的顯色劑標(biāo)記組成，吸水紙、硝酸纖維素膜、固體膠體金片及玻璃纖維膜依次粘貼于背 襯之上，且相互之間有l(wèi)-2mm的接觸；其中，在硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應(yīng)的抗體或抗原，且該抗體或抗原在垂直方向上不重疊；
(4)樣品分析物檢測 按照常規(guī)免疫層析法進(jìn)行檢測，取30iU 1ml樣品分析物點(diǎn)樣于測試條的加樣 區(qū)，在2 30min內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。 所述顯色劑包括膠體金、乳膠或熒光等，采用膠體金作為顯色劑時(shí)，該膠體金顆粒 粒徑在1 150nm，可以按常規(guī)的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒。 在所述步驟(2)中該標(biāo)記最終包被于玻璃纖維上后，可以再經(jīng)過冷凍干燥處理制 備成固體顯色劑片，冷凍干燥的溫度為0 -S(TC，干燥時(shí)間為2-72小時(shí)。
所述步驟(2)中的顯色劑與樣品分析物相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體混合的比例范圍是 lml顯色劑比0. 1-500 ii g抗原或抗體。 所述步驟(3)中的硝酸纖維素膜的尺寸是長2 10cm，寬4mm 2cm，該膜上有 2 10個(gè)抗原或抗體，相鄰兩個(gè)抗原/抗體顯色劑標(biāo)記梯度位置間的間隔范圍是2mm 8cm。 所述步驟(2)中抗原或抗體膠體金標(biāo)記以每ml鋪8-40cm2均勻平鋪于玻璃纖維 上。 所述步驟(3)中的背襯是塑料板或硬化板。 所述步驟(3)中硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應(yīng)的抗體或抗原的濃度為
0. 001mg/ml 10mg/ml。 本發(fā)明與現(xiàn)有方法的比較 如果采用原先的方法在膜上包被平行多條完整條帶進(jìn)行多種測試的，當(dāng)使用含有
二抗的膠體金進(jìn)行對(duì)多種抗原的測試時(shí)，經(jīng)過第一條條帶時(shí)，如果此時(shí)反應(yīng)較為強(qiáng)烈，在第
一條帶上就會(huì)占有膠體金中絕大部分的二抗，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到第二條條帶時(shí)，如果反應(yīng)還是
很強(qiáng)烈，但是由于膠體金在第一條條帶中被占據(jù)了太多，在隨后的反應(yīng)中，即使反應(yīng)同樣強(qiáng)
烈，卻由于膠體金的量不夠而顯不出顏色來，從而帶來判讀失誤，造成測試的失??； 而采用本方法，條帶和條帶之間在垂直方向并不重疊，如果縱向劃分條帶的話，膠
體金等顯色劑并不會(huì)在縱向上受到阻礙，所以一條測試條上的所有反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生相互的干
擾。這樣改進(jìn)的好處在于可以利用現(xiàn)有的層析法檢測裝置，來進(jìn)行自身免疫疾病的診斷。這
樣既節(jié)約了檢測的時(shí)間，又節(jié)約了裝置的成本，并且不需要重新進(jìn)行設(shè)計(jì)或打造模具等工作。 本發(fā)明中，樣品從測試條底部由于毛細(xì)作用向上爬，經(jīng)過各包被條時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的 反應(yīng)。由于各包被條在垂直方向不重疊，所以所有的反應(yīng)并不會(huì)相互之間有影響。從而可 以達(dá)到用一份樣品進(jìn)行多種測試的目的，并且使所有的反應(yīng)都能在同樣條件下進(jìn)行，從而 并不會(huì)產(chǎn)生由于條帶和條帶之間的干擾所產(chǎn)生的錯(cuò)誤結(jié)果。


下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明
圖1是現(xiàn)有的免疫層析法的檢測試劑結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2是本發(fā)明方法操作過程的演示圖，其中紅色部分是膠體金或其他顯色劑的反 應(yīng)途徑；
圖3是實(shí)施例1中HCV的陽性樣品免疫層析圖，其中，a是HCV高濃度陽性樣品，b 是HCV臨界濃度陽性樣品； 圖4是實(shí)施例1中HIV高濃度陽性樣品和HCV臨界濃度陽性樣品混合物的免疫層 析圖，a是采用以前方法，b是采用本發(fā)明方法；
圖5是實(shí)施例2的結(jié)果示意圖；
圖6是實(shí)施例3的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1同時(shí)檢測艾滋病病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV) (1)按常規(guī)的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，顆粒粒徑40nm ; (2)將膠體金與lmg/ml蛋白A(購自Sigma公司)按照體積比為128 : 1混合均
勻，穩(wěn)定后1000轉(zhuǎn)/分離心10min，濃縮，每10cm2玻璃纖維上均勻平鋪1ml膠體金，經(jīng)_20°C
冷凍干燥12h，制成固體膠體金片； (3)測試條制備 將吸水紙、硝酸纖維素膜、步驟(2)所制備的固體膠體金片及玻璃纖維膜依次粘 貼于塑料板背襯之上； 其中，硝酸纖維素膜長2. 5cm、寬4mm，在硝酸纖維素膜上平行包被HIV和HCV的抗 原(但這2個(gè)抗原在垂直方向上不重疊，包被濃度都為lmg/ml ，包被了 0. 4mg) ，HIV抗原比 HCV抗原更臨近加樣區(qū)，2個(gè)抗原梯度間隔0. 5cm ; (4)按照常規(guī)免疫層析法進(jìn)行檢測，取50iU樣品分析物點(diǎn)樣于測試條的加樣區(qū)， 在5min內(nèi)觀察，參照?qǐng)D2，其結(jié)果見圖3和圖4。 其中，圖3-a中HCV陽性對(duì)照的濃度是5mg/ml ，圖3_b中HCV陽性對(duì)照臨界濃度是 0. 005mg/ml。 圖4中，HIV高濃度陽性樣品與HCV臨界濃度陽性樣品的混合比是1 : 1，混合后 HIV高濃度陽性樣品的濃度為10mg/ml，混合后HCV臨界濃度陽性樣品的濃度為0. 005mg/ ml。 從圖3、圖4中結(jié)果可示，如果按照原來的方法操作(在硝酸纖維素膜上包被平行 2個(gè)HIV和HCV抗原進(jìn)行測試，垂直方向有交叉)，HCV弱陽性由于之前HIV反應(yīng)過于強(qiáng)烈 而反映不出，但是按照本發(fā)明方法操作，就可以真實(shí)地反映出試驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例2同時(shí)檢測HIV1、 HIV2、 HCV (1)將FITC(異硫氰酸熒光素)溶解于DMSO( 二甲亞砜)，濃度為lmg/ml ; [OO44] (2)將FITC溶液與0. 2mg/ml蛋白A (購自Sigma公司)按照體積比為1 : 1混合 均勻，緩慢混合8個(gè)小時(shí)，即完成蛋白A與熒光素的結(jié)合； [OO45] (3)測試條制備 將吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜依次粘貼于塑料板背襯之上；
其中，硝酸纖維素膜長2cm、寬5mm，在硝酸纖維素膜上平行包被HIV1、 HIV2、 HCV 抗原和蛋白A(蛋白A作為質(zhì)控線)(所有的包被線在垂直方向上不重疊，包被濃度都為 0. 001mg/ml，包被了 0. 0005mg)，從加樣區(qū)到吸水紙方向依次為HIV1、 HIV2、 、蛋白A，間 隔為4mm ;
(4)按照常規(guī)免疫層析法進(jìn)行檢測，加100 熒光素蛋白A結(jié)合物于樣品區(qū)，取 30iU樣品(HIV1、2與HCV陽性樣品混合物，1 : 1 : l混合，終濃度皆為5mg/ml)分析物 點(diǎn)樣于熒光素結(jié)合物之后，在5min內(nèi)用520nm波長的紫外光觀察，參照?qǐng)D2，其結(jié)果見圖5。
實(shí)施例3同時(shí)檢測ToRCH五項(xiàng) (1)準(zhǔn)備乳膠藍(lán)色微粒，平均粒徑為100nm，微粒；濃度為lmg/ml (2)將膠體金與10mg/ml蛋白A(購自Sigma公司)按照體積比為1000 : 1混合
均勻，室溫緩慢混勻，反應(yīng)4小時(shí)后，于4t:儲(chǔ)存； (3)測試條制備 將吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜依次粘貼于塑料板背襯之上；
其中，硝酸纖維素膜長10cm、寬2cm，在硝酸纖維素膜上依次平行包被Toxo(弓 形蟲)，HSV1 (單純皰疹病毒1型)和HSV2(單純皰疹病毒2型)，CMV(巨細(xì)胞病毒)， Rubella(風(fēng)疹)5種抗原(但這5個(gè)抗原在垂直方向上不重疊，包被濃度都為10mg/ml，包 被了 2mg)，從加樣區(qū)到吸水紙方向依次為TOXO， HSV1， HSV2， CMV， Rubella,各抗原梯度間隔 1. 5cm j (4)按照常規(guī)免疫層析法進(jìn)行檢測，取lml乳膠微粒結(jié)合物于加樣區(qū)，取lml樣品
分析物點(diǎn)樣于乳膠微粒結(jié)合物后，在5min內(nèi)觀察，參照?qǐng)D2，其結(jié)果見圖6。 圖6(A)-(E)是各自的結(jié)果，圖6(F)為混合樣品的結(jié)果，由圖6可見，混合物測試
與各自測試的結(jié)果相同，即本發(fā)明方法反映出測試的真實(shí)結(jié)果。
權(quán)利要求
一種能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，步驟包括(1)按常規(guī)方法制備顯色劑；(2)抗原或抗體顯色劑標(biāo)記制備將顯色劑與多種樣品分析物相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體按比例混合，使顯色劑與抗原或抗體形成穩(wěn)定的體系，純化濃縮，形成抗原或抗體顯色劑標(biāo)記，該標(biāo)記最終包被于玻璃纖維上后，制備成顯色劑標(biāo)記；(3)測試條制備測試條由背襯、吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜及步驟(2)制備的顯色劑標(biāo)記組成，吸水紙、硝酸纖維素膜、顯色劑標(biāo)記及玻璃纖維膜依次粘貼于背襯之上，且相互之間有1-2mm的接觸；其中，在硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應(yīng)的抗體或抗原，且該抗體或抗原在垂直方向上不重疊；(4)樣品分析物檢測按照常規(guī)免疫層析法進(jìn)行檢測，取30μl～1ml樣品分析物點(diǎn)樣于測試條的加樣區(qū)，在2～30min內(nèi)觀察并記錄結(jié)果。
2. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于 所述顯色劑包括膠體金、乳膠或熒光。
3. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于在所述步驟(2)中該標(biāo)記最終包被于玻璃纖維上后，再經(jīng)過冷凍干燥處理制備成固體顯色 劑片，冷凍干燥的溫度為0 -S(TC，干燥時(shí)間為2-72小時(shí)。
4. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于 所述步驟(2)中的顯色劑與樣品分析物相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體混合的比例范圍是lml顯色劑 比0. 1-500 ii g抗原或抗體。
5. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于 所述步驟(3)中的硝酸纖維素膜的尺寸是長2 10cm，寬4mm 2cm，該膜上有2 10個(gè) 抗原或抗體，相鄰兩個(gè)抗原或抗體梯度位置間的間隔范圍是2mm 8cm。
6. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于 所述步驟(2)中抗原或抗體顯色劑標(biāo)記以每ml鋪8-40cn^均勻平鋪于玻璃纖維上。
7. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于 所述步驟(3)中的背襯是塑料板或硬化板。
8. 如權(quán)利要求1所述的能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，其特征在于 所述步驟(3)中硝酸纖維素膜上包被待測分析物相應(yīng)的抗體或抗原的濃度為0.001mg/ ml 10mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能同時(shí)對(duì)多種分析物進(jìn)行檢測的免疫層析方法，步驟包括1)按常規(guī)方法制備顯色劑；2)制備抗原或抗體顯色劑標(biāo)記；3)制備測試條，且在測試條上包被多種分析物相對(duì)應(yīng)的抗體或抗原，且該抗體或抗原在垂直方向上不重疊；4)按照常規(guī)免疫層析法進(jìn)行檢測，觀察并記錄結(jié)果。本發(fā)明由于條帶和條帶之間在垂直方向并不重疊，所以一條測試條上的所有反應(yīng)不會(huì)產(chǎn)生相互的干擾，節(jié)約檢測時(shí)間及改換模具的成本和樣品的使用量，操作更為簡便。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101738470SQ200810043909
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者姚愷齡, 陳國治 申請(qǐng)人:益思美詮生物科技(上海)有限公司