本發(fā)明涉及microRNA標志物組及其在制備檢測胃癌淋巴結轉移試劑盒中的應用，屬于醫(yī)學分子生物學
技術領域：
。背景知識胃癌是我國最常見的腫瘤之一，在我國發(fā)病率居各類消化道腫瘤的首位。胃癌高死亡率最主要的原因是患者診斷明確時已經(jīng)處于胃癌晚期，胃癌患者的存活率非常低，大約5％-15％。雖然胃癌的診斷和治療有所改善，但是胃癌患者的預后非常差，尤其是有遠處轉移的患者。早期胃癌指癌組織僅局限于粘膜層和粘膜下層，判斷早期胃癌的標準不是其面積的大小和是否有局部淋巴結轉移，而是其浸潤的深度。內鏡粘膜下剝離術是近年來出現(xiàn)的一項新的治療手段，也是臨床應用前景很好的技術，廣泛應用于早期胃癌的治療。內鏡粘膜下剝離術是在內鏡下，使用高頻電刀與專用器械，將胃部早期腫瘤與其下方正常的粘膜下層逐步剝離，以達到將病灶完整切除的目的。內鏡粘膜下剝離術允許早期胃癌病變超過2厘米及破潰的病變，并且可對切除癌組織進行準確的組織學分級的評估。另外，由于內鏡粘膜下剝離術創(chuàng)傷小的優(yōu)點，對年老者及高手術風險的患者非常有利。但是，在早期胃癌患者進行內鏡粘膜下剝離術后，患者可能會發(fā)生淋巴結轉移從而導致胃癌復發(fā)及轉移，影響胃癌患者預后。目前為止，內鏡粘膜下剝離術的胃癌患者是否伴隨著淋巴結轉移的發(fā)生是不清楚的。但是，淋巴結轉移是胃癌患者不良預后的主要原因，并且淋巴結轉移是重要單一的預后不良因子。因此，合適的分子標志物可為預測胃癌患者淋巴結轉移提供重要的線索和依據(jù)，促進胃癌患者個體化治療目標的實現(xiàn)。miRNAs是近幾年研究的熱點，它是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類短鏈內源性非編碼RNA，長約22個堿基左右，主要通過與靶基因3’UTR完全或不完全配對，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調控個體發(fā)育、細胞凋亡、增殖及分化等生理及病理過程。越來越多的研究表明miRNAs在腫瘤轉移，發(fā)展和進展過程中發(fā)揮著重要作用。Khan等人認為miR-27b-5p與神經(jīng)母細胞瘤的轉移相關。許多研究顯示miR-101-5p在多種腫瘤中能抑制促轉移基因，例如EZH2，VEGF-C和HMGA2等基因。同樣地，miR-128-3p能調控上皮間質化并且抑制癌細胞的遷移和浸潤能力。miR-100-5p在多種腫瘤中通過抑制多個靶基因被認為是抗轉移的調控者。除了以上提到的miRNAs，miR-145-5p在肺癌中表達降低，并且與淋巴結轉移相關。Xing等人報道m(xù)iR-145-5p可抑制胃癌的浸潤和轉移。Wang等人研究表明miR-214-3p在胃癌中表達降低，與癌細胞的遷移，浸潤及胃癌的淋巴結狀態(tài)有關。研究表明miRNAs表達譜能夠作為許多腫瘤診斷和預后的標志物。Wei等人發(fā)現(xiàn)miRNAs表達譜檢測為肝癌患者的診斷和預后提供了可行的方法。Yu等人也表明miRNAs表達譜可以很好的預測非小細胞肺癌患者的預后。miRNAs表達譜在胃癌中的研究揭示miRNAs的表達與胃癌發(fā)生，進展及個性化治療有密切關系。例如，Li等人檢測了7個miRNAs(miR-10b,miR-21,miR-223,miR-338,let-7a,miR-30a-5p,miR-126)表達譜與胃癌患者總體生存和無瘤生存時間密切相關，并且這種預后相關的miRNAs表達譜可應用于胃癌患者個體化治療。Liu等人發(fā)現(xiàn)5個miRNAs表達譜(miR-1,miR-20a,miR-27a,miR-34andmiR-423-5p)可作為胃癌檢測的新的診斷指標，并且基于5個miRNAs的生物標記可預測在腫瘤進展分期。然而，miRNAs表達譜在預測胃癌淋巴結轉移的報道非常少，并且表達譜的研究較新，該領域的研究目前處于空白，未發(fā)現(xiàn)相關的應用性研究。此外，該領域研究需還要克服以下幾個技術難點：1、大樣本臨床標本、臨床資料的獲取(小樣本由于個體差異難獲得陽性結果或一致結果)，長期的隨訪；2、單個miRNA的局限性，低敏感性和特異性；3、許多研究多關注miRNA表達譜在癌與正常的作用，少有研究miRNA表達譜在淋巴結轉移與非轉移的作用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種microRNA標志物組及其在制備檢測胃癌淋巴結轉移試劑盒中的應用。該microRNA標志物組可用于預測胃癌淋巴結轉移的預測、檢測或篩查；通過實時定量PCR檢測胃癌標本中標志物組中所涉及的4個miRNA(miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p)的表達狀況，用于評判胃癌患者的淋巴結轉移情況。本發(fā)明技術方案如下：microRNA標志物組，由miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p組成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-128-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。上述microRNA標志物組在制備檢測胃癌淋巴結轉移試劑盒中的應用。一種檢測胃癌淋巴結轉移的試劑盒，包括：上述microRNA標志物組；以及microRNA快速提取試劑、反轉錄試劑、實時定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物。上述microRNA快速提取試劑、反轉錄試劑、實時定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物均可采用本領域常規(guī)市售試劑，如microRNA快速提取試劑可采用Bioteke公司銷售的貨號RP5301的試劑；反轉錄試劑(包括反應緩沖液，DNA聚合酶，反轉錄酶復合物，去離子水)可采用TaKaRa公司銷售的貨號RR066A的試劑；實時定量PCR試劑(包括反應緩沖液，qPCR復合物，去離子水)可采用GeneCopoeia公司銷售的貨號AOMD-Q020的試劑；人RNU6BmiRNA引物可采用GeneCopoeia公司銷售的貨號HmiRQP9001的試劑。microRNA標志物組中各microRNA標志物的篩選過程：發(fā)明人通過實時定量PCR檢測胃癌標本中6個miRNA的表達狀況，結果顯示miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p的表達水平在發(fā)生淋巴結轉移的胃癌患者中表達下調。發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)miR-101-5p和miR-145-5p在ROC曲線(受試者工作特性曲線)分析中無統(tǒng)計學意義，將4個miRNA標志物：miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p通過Logistic回歸構建了風險公式。該公式可以很好的區(qū)分胃癌淋巴結轉移與否，比傳統(tǒng)的檢測單一miRNA指標具有更高的準確性和特異性。有益效果1、本發(fā)明首次構建了檢測胃癌淋巴結轉移的包含4個microRNA標志物的microRNA標志物組，對胃癌淋巴結轉移的預測有極高的準確性和特異性。針對上述4個miRNA標志物的檢測結果與已經(jīng)建立的風險公式進行比較，可以很好地區(qū)分胃癌淋巴結轉移與否，極大提高預測的準確性。2、本發(fā)明通過對所述microRNA標志物組研制相對應的檢測試劑盒，用于胃癌患者淋巴結轉移的預測，提供個性化治療方案，具有重要的臨床意義和很大的開發(fā)價值。附圖說明圖1、采用qRT-PCR方法在初篩(51例)樣本中檢測了6個miRNA的表達結果柱狀圖及這6個miRNA在初篩(51例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖中：A為miR-27b-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；B為miR-101-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；C為miR-128-3p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；D為miR-100-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；E為miR-145-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；F為miR-214-3p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；圖2、采用qRT-PCR方法在驗證(51例)樣本中檢測了6個miRNA的表達結果柱狀圖及這6個miRNA在驗證(51例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖中：A為miR-27b-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；B為miR-101-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；C為miR-128-3p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；D為miR-100-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；E為miR-145-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；F為miR-214-3p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；圖3、采用qRT-PCR方法在合并(102例)樣本中檢測了6個miRNA的表達結果柱狀圖及這6個miRNA在合并(102例)樣本中的ROC曲線分析圖；圖中：A為miR-27b-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；B為miR-101-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；C為miR-128-3p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；D為miR-100-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；E為miR-145-5p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；F為miR-214-3p的表達結果圖和ROC曲線分析圖；圖4、高風險組和低風險組進行ROC曲線分析圖；圖中：A為高風險組的胃癌患者比低風險的患者更易于發(fā)生淋巴結轉移；B為高風險組和低風險組ROC曲線分析圖；圖5、miR-27b-5p，miR-101-5p，miR-100-5p和miR-145-5p組成的表達譜在合并(102例)樣本中進行ROC曲線分析圖；具體實施方式：下面結合實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。實施例1用于實時定量PCR的102例胃癌組織石蠟標本均取自山東大學齊魯醫(yī)院2004-2007年手術切除病例。其中，65例胃癌患者發(fā)生淋巴結轉移，37例患者未發(fā)生淋巴結轉移。102例患者手術前均未接受放、化療。以上石蠟組織均經(jīng)HE染色后病理證實。本研究中胃癌患者臨床參數(shù)，如表1所示。表1、4個miRNAs標志物組在合并組(102例)標本中的臨床病理參數(shù)分析實施例21、胃癌標本組織中miRNA的提?。翰捎肂ioteke公司的石蠟包埋組織中miRNA的提取試劑盒。(1)切片：將胃癌標本的已包好石蠟組織切成4μm的薄片8-10張。(2)脫蠟脫水：組織切片放在65℃恒溫箱2-4小時，然后依次放在二甲苯浸泡2次用于脫蠟，每次10min左右。然后依次浸泡在梯度酒精如75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇，每個梯度酒精缸浸5分鐘、100％無水乙醇2次，各5min，此步驟用于脫蠟，取出后待其自然晾干。(3)染色：待切片晾干后，將其放在蘇木素缸里(根據(jù)蘇木素使用時間長短，估計染色時間)，大約染色1min后，再用自來水溫和沖洗切片3min。(4)挑取：提前準備好1ml注射器針頭并配置好240μlPTL溶液和10μl蛋白酶K混合液，于顯微鏡下觀察切片，找到所需的組織在用針頭將其輕輕刮下，放于混合液的EP中，渦旋混勻。(5)miRNA提取：1)將EP管放于55℃水浴孵育15min，取出后放于80℃水浴孵育10min。2)用移液器吸取750μl裂解液MRL加入到EP管中，吹打充分混勻，于室溫放置3min。3)繼續(xù)向EP管中加入200μl氯仿，震蕩器劇烈震蕩20秒左右，于室溫靜置2min。4)提前將4℃離心機預冷，EP管放于12000rmp離心15min，緩慢取出，可觀察到樣品分為三層，分別為上層的無色的水相層，中間層，以及有機相層，實驗所需的RNA在無色水相層存在。隨即把水相移到新的RNasefree-EP管中估計其體積，勿吸出中間層。5)將體積濃度為70％的乙醇加入到新的RNasefree-EP管，約水相的0.6倍體積，充分混勻后，將所得液體小心移入RA吸附柱。6)將RA吸附柱放于4℃離心機，12000rmp離心45s，收集下濾液置于新的RNasefree-EP管中，肉眼評估下濾液的體積后，向EP管中加入2/3下濾液體積的無水乙醇，上下顛倒幾次達到充分混勻效果，將混合液小心移入RB吸附柱中，4℃離心機10000rmp離心30s棄掉廢液。7)往RB吸附柱中加入700μl漂洗液RW，12000rmp，4℃離心1min，棄掉廢液。8)重復上一步驟，達到充分漂洗的目的。9)將吸附柱RB放回空收集管中，4℃12000rmp離心2min,掀開離心柱蓋,室溫放置3-5min，盡量除去漂洗液，讓乙醇揮發(fā)。10)將RB吸附柱取出后，放入一個新的RNasefreeEP管中，加入30μl左右RNasefreewater(事先在65℃水浴5-10min效果更好)，室溫放置3min，4℃12000rmp離心1min。收集得到miRNA，用光度計測miRNA的純度及濃度后保存于-80℃?zhèn)溆?。2、qRT-PCR檢測：采用All-in-oneTMmiRNAqRT-PCR檢測試劑盒(GeneCopoeia公司)。miRNA的通用下游引物序列：CAGTGCGTGTCGTGGAG和人內參U6引物由該公司設計合成。(1)RT反應條件：37℃1h；85℃5min。體系如下：(2)6種miRNAs(miR-27p-5p，miR-101-5p,miR-128-3p，miR-100-5p,miR-145-5p和miR-214-3p進行實時定量PCR驗證，其序列信息如表2所示。表2表3：相關miRNAs的引物信息序號miRNAs名稱上游引物序列7miR-27p-5pAGAGCTTAGCTGATTGGTGAACAA8miR-101-5pCAGTTATCACAGTGCTGATGCTAAA9miR-128-3pTCACAGTGAACCGGTCTCTTTAA10miR-100-5pCGTAGATCCGAACTTGTGAA11miR-145-5pAGTTTTCCCAGGAATCCCTAAA12miR-214-3pCAGGCACAGACAGGCAGTAAPCR反應(總體系20μL)：反應條件：95℃預變性10min；95℃變性10sec，60℃退火20sec，72℃延伸10sec共40個循環(huán)。(3)數(shù)據(jù)處理：記錄各樣本平均CT值，按公式△CT＝CT(miRNA)-CT(U6)和2-△CT計算每個樣本中6種miRNA的相對表達量。使用t檢驗分析，以P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。(4)實驗結果：在51例初篩組樣本中，與沒有淋巴結轉移組相比，miR-27b-5p,miR-101-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p在淋巴結轉移組中表達下調。隨后在51例驗證組樣本中進行了實時定量PCR檢測，并綜合分析了102例樣本中6種miRNA的表達情況，實驗結果表明miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p的表達水平在發(fā)生淋巴結轉移的胃癌患者中表達下調。實施例3利用GraphPadPrism5軟件對6種miRNA區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性進行了受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲線)分析。在51例初篩組中，結果顯示miR-27b-5p,miR-101-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲線下面積AUC＝0.7161,0.7210,0.7839,0.7150和0.7081P均<0.05)，具有較好的區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性，如圖1；而miR-145-5p的分析結果顯示其AUC＝0.6161(P>0.05)，差異沒有顯著統(tǒng)計學意義，如圖1所示。在51例驗證組中，結果顯示miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲線下面積AUC＝0.7474,0.6972,0.7768和0.7776，P均<0.05)，具有較好的區(qū)分化療效果的特異性和靈敏性，如圖2；而miR-101-5p和miR-145-5p的分析結果顯示AUC分別為0.6246和0.5956(P>0.05)，差異沒有顯著統(tǒng)計學意義，如圖2所示。綜合分析102例胃癌組織標本，結果顯示miR-27b-5p,miR-128-3p,miR-100-5p和miR-214-3p(曲線下面積AUC＝0.7343,0.7193,0.7414和0.7306，P均<0.05)，如圖3。綜合上述三組實驗結果，除去miR-101-5p和miR-145-5p，將其余4個指標采用Logistic回歸模型構建了淋巴結轉移的風險公式：miRNAscore＝(12.92×thelevelofmiR-27b-5p)+(3.686×thelevelofmiR-100-5p)–(0.972×thelevelofmiR-128-3p)+(1.789×thelevelofmiR-214-3p)-1.5。根據(jù)該公式，我們將102中的每例患者的miRNAscore計算出來，并根據(jù)cut-offvalue(敏感性和特異性最大值減去1所得)做為截點，將102例中的病例分成高風險組和低風險組。結果顯示高風險組的胃癌患者比低風險的患者更易于發(fā)生淋巴結轉移(圖4A)。而后再對高風險組和低風險組進行ROC曲線分析，結果顯示以這4種miRNA形成的標志物組具有較好的預測胃癌淋巴結轉移的特異性和靈敏性(AUC＝0.760，P<0.0001)，比單一miRNA預測胃癌淋巴結轉移的準確性好，如圖4B。實施例4一種評價胃癌淋巴結轉移的試劑盒，包括：microRNA標志物組；以及microRNA快速提取試劑、反轉錄試劑、實時定量PCR試劑、人RNU6BmiRNA引物。上述microRNA快速提取試劑采用Bioteke公司銷售的貨號RP5301的試劑；反轉錄試劑(包括反應緩沖液，DNA聚合酶，反轉錄酶復合物，去離子水)采用TaKaRa公司銷售的貨號RR066A的試劑；實時定量PCR試劑(包括反應緩沖液，qPCR復合物，去離子水)采用GeneCopoeia公司銷售的貨號AOMD-Q020的試劑；人RNU6BmiRNA引物采用GeneCopoeia公司銷售的貨號HmiRQP9001的試劑。所述microRNA標志物組，由miR-27b-5p，miR-128-3p，miR-100-5p和miR-214-3p構成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-128-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-214-3p的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。對比例如實施例4所述的評價胃癌淋巴結轉移的試劑盒，不同之處在于：所述microRNA標志物組，由miR-27b-5p，miR-101-5p，miR-100-5p和miR-145-5p構成，miR-27b-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，miR-101-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，miR-100-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，miR-145-5p的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。實驗例采用實施例4及對比例的試劑盒同時檢測了102例胃癌樣本中miRNA的表達情況。綜合對比例中的4個miRNA，采用Logistic回歸模型構建了淋巴結轉移的風險公式：Riskscore＝(5.013×expressionofmiR-27b-5p)+(6.451×expressionofmiR-101-5p)+(0.186×expressionofmiR-100-5p)-(0.746×expressionofmiR-145-5p)-1.397。根據(jù)該公式，計算每例患者的風險系數(shù)，進行ROC曲線分析，結果顯示在102例胃癌樣本中，以對比例這4種miRNA形成的標志物組具有雖然較好的區(qū)分胃癌淋巴結轉移的特異性和靈敏性；但相比于實施例4構成的模型，曲線下面積較小，預測效力較弱，如圖5所示。提示實施例4的標志物組預測價值要優(yōu)于對比例。當前第1頁1 2 3