專利名稱：一種測(cè)定一氧化氮生成的熒光探針及其應(yīng)用的制作方法
一種測(cè)定一氧化氮 的熒光徽及其鵬
^:領(lǐng)域本發(fā)明屬于生trtt測(cè)及臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及翻胞或者組織中NO的 測(cè)定，特別是一種可用于活細(xì)胞中NO成像測(cè)定的銅配溯熒光微及其鵬。
背景獄NO是一種肝小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的氣體，難溶于水，極易ilil^鵬擴(kuò)散。由于 其分子中有一未,電子，具自由基結(jié)構(gòu)，極不穩(wěn)定，容易與氧、超氧化物自由基、逝臉屬離 子起反應(yīng)。在組織內(nèi)的半衰期極短，1小于lmin，但在組織》卜棘氧氣對(duì)牛下半衰期可延長(zhǎng)至 4minS右。NO能很快被氧化成石^fe艦硝麟，與超氧化離子、血紅蛋白以及含血紅素蛋白質(zhì) 結(jié)合.而M生物活性。80年f^發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子(EDRF)就劍O，因此有翔0的研究開(kāi) 始興起?，F(xiàn)已査明NO在細(xì)胞內(nèi)信息傳導(dǎo)方面,Sg的作用，它 有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的性 能.又;1^腫瘤細(xì)M寄生蟲爭(zhēng) 鵬肝。正是由于NO的生tffi^性.研究腳!INO可倉(cāng)樹(shù)某 些賺，如細(xì)胞增殖病、新生兒缺氧艦'賊病及細(xì)胞的凋亡、生長(zhǎng)及死t^"面影響駄。因此， 研効0的檢測(cè)技術(shù)具有很高的自價(jià)值。
由于NO在生物體內(nèi)含量低，半衰期短，有氧氣，^K牛下極易被氧化，3^就給其準(zhǔn)確測(cè)定帶
來(lái)困難。目前主要采用測(cè)^NO的穩(wěn)定f^終;^t;硝酸鹽，亞硝酸鹽間接反,o^量的方法。硝
麟可用硝麟還原喊鍍銅鎘法將其還原為亞^4k稱Griess試劑發(fā)縫氮化腿，4^@紅 色化^3Xma^546nm，顯M與亞^^lfc濃;g^lE比。
化學(xué)發(fā)光法根據(jù)NO可與臭ma^化學(xué)反跡^a態(tài)^ft化氮，后者頓回基態(tài)過(guò)程中釋放 育讀，部分育遣以光子形^lt，利用敏感的光電倍增管來(lái)檢測(cè)光子的皿強(qiáng)度，以此推飾0^ 量。此法具Wi^靈M和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于呼出^NO^S的檢測(cè)，但由于#^屬、 鵬、塑料等固糊料，NH3、麟氣體，以淑O易溶于液將因素的干擾作用，其臨床卿受 到一定限制。其它還有高效色譜法、高 紅素,，由于需^m儀器，操^ 雜，難于在臨 床推廣糊。
由^J見(jiàn)在的NO檢測(cè)技術(shù)局限于)(^NO先氧化艦硝鵬或硝^m幫則定，無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)直 接的測(cè)定，使f翻啶結(jié)果的科學(xué)性受至頓疑。熒光光譜測(cè)定是一種靈敏的化^t測(cè)手段，微測(cè)下限一般可超i糊摩爾(10—摩爾)甚至皮 摩爾(10—12摩爾)級(jí)。自1995年以來(lái)，世l!^實(shí)^^力于開(kāi)劍0的生物熒光檢測(cè)i^iJ，如二 氦萘及其衍生物(Diaminonaphthalene,DAN)， 二氯熒光素(dichlorofluorescir^DCFH), 二條和 鈷離子的配合物，二SS熒光素(DAFs)和二MS羅丹明(DARs)等等，但目前存在的各種熒 光檢測(cè)試劑^ffi著各種缺陷妨礙其進(jìn)一步l^ffl，如缺2N0檢測(cè)^H4 (DAN^DCFH)，檢測(cè)靈敏 度低(二,和鈷離子的配^tl),需要其他HI^物(典型為M氧)的參與(如DAFsSJDARs) ，，使得細(xì)胞內(nèi)或機(jī)體內(nèi)WNO檢測(cè)i4M緩侵。目前應(yīng)用的ft^功WNO熒光檢測(cè)試劑;！DAF和
dar，但由于禾PN0His激活熒光時(shí)需^02的參與，盡管其j^ffiii:接禾PNoas^^3ta行檢
測(cè)，但在一定割牛下(如5^境中的細(xì)鵬組織)臓不能實(shí)1則0在細(xì)胞內(nèi)赫機(jī)體內(nèi)的實(shí)時(shí) 三維空間檢測(cè)。
銅離子和一些熒光基團(tuán)形成的配合 近期受到了大家的關(guān)注，Cu (n)形成的配合物具有
M的氧化性，在溶液中或生理^K牛下可以和no ， ，形成新的熒光化，，cu (n)被
還原成Cu (1)，這是一種很靈敏的縱(tunwm)熒光檢測(cè)法，并且不需要其他,鵬物的參 與。苯并咪唑或萘并咪麟衍生物是一類熒光件質(zhì)優(yōu)秀，斯托克斯位移駄，較為穩(wěn)定的激發(fā)態(tài) 好內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(Excited-State Intramolecular Proton Transfer, ESIPT)型熒光化^t/，它們的最大 ^^波長(zhǎng)在350nm左右，與經(jīng)典的細(xì)胞凋t^i!l熒光染料DAPI位于相同的區(qū)域，大部，， 微微配絲相應(yīng)的M^濾光片，易fit行檢測(cè)。它們可以和銅離子形成穩(wěn)定'腿中的配合物， 招艮NO反鵬，微出熒光。并且由于它們的熒光頓比較穩(wěn)定獨(dú)特，在細(xì)胞內(nèi)可以和其他熒 光染料結(jié)湖亍雙鵬，進(jìn)一雜細(xì)化檢測(cè)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是劃艮現(xiàn)有技術(shù)，的，不足，皿一種測(cè)定一氧化氮生成的熒光探 針及其鵬。這種熒光探針可以為研究人類的各種炎癥、心血管疾病刻中瘤發(fā)組程中的機(jī)制、 以及為某^^疾病的早期診斷與預(yù) ^良好的輔助手段。 本發(fā)明的技術(shù)方案為
1、測(cè)定1化氮4^的熒光,的結(jié)構(gòu)及其合成方法與合成路線本發(fā)明提供的測(cè)定NO生成的熒光探針的結(jié)構(gòu)為式(I )或(II):
3a-Cu: RfRfRfl^H, R=H 3b-Cu: R廣R3-R4-H, R2=OMe, R=H 3c-Cu: R廣RfH， R2=R4=OMe, R=H 3d誦Cu: RfRfF^-H, R3=C1, R=H 3h-Cu: RfRfF^H, R3=C1， R=CH3
4a-Cu : R, =R2=R3= H; 4b"Cu: R廣R廣H R2=OMe 4c-Cu : R,=H, R2=R3=OMe 4d-Cu: R^RfHR^Cl 4bCu: R2=R3=H R廣OMe 4f-Cu: R^R^HR^OH
該熒光徽的合駄法如下步驟
&分別將300mmol取f^K楊歐l^l喊,下溶于125ml的甲醇中，然后加入150mmol的 取代鄰苯二胺(2a或2b)用刊ij備式(I )的H^fi^J，鋤卩入150mmol的鄰萘二銜2)用刊iJ 備式(II)的 ￡^#/,室^mt半1小時(shí)，^ffl應(yīng)的沉淀物，過(guò)濾i^K淀物，甲,滌，真 空千Jtf導(dǎo)到配體Aa Ah (或Da^Df)。
b. 分別將13mmo1上步得到的配體Aar~Ah (或DbDf)溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn (n) Cl2'4H2O溶于40ml乙醇戶顧U得的溶液，頓褐色溶液，再將此溶MSA空氣的情況下攪
拌12小時(shí)，f娜啡色溶液，室W^24小時(shí)并,，^咖啡色沉淀，過(guò)濾出沉淀物，用DMF 洗滌，再用少量乙^fe滌，真空千麟到三i^配糊Ba Bh (或Ea Ef)。
c. 分別將200mg上步得到的三 配，BhBh (或Ea~Ef)溶于10ml水和5ml甲醇中， 加入少量6mol/LNaOH溶液，調(diào)節(jié)溶液的PH為IO，然后室溫下離12小時(shí)，過(guò)濾出沉淀物， 、搶液中力口入少量醋酸，中和至PH=5，用乙酸乙酯提取溶液，有豐細(xì)用^7jC硫,千燥，繊， 得，，用薄層層析赫據(jù)析分離，乙酸乙酚正己烷l: l為展開(kāi)劑，分離出目的產(chǎn)物，用乙 酸赫乙醇重結(jié)晶得到2-(2-羥基^S)苯并咪t^f行生物3a 3h (或4"f)。
cL分別將上步 的2-(2-羥基苯基)苯并咪( ^生物3a 3h (或4"f) 2mg溶于10ml乙醇， 與等^R等摩爾硫,水溶液在室溫下形成配，，常溫?fù)]發(fā)^M， ^以乙醇和去離子水各洗 滌三次，即得2-(2-羥基^8)苯并咪1 衍生物- ^/產(chǎn)物。具體合^S各線如下:<formula>formula see original document page 7</formula><formula>formula see original document page 8</formula>2、本發(fā)明麟的測(cè)定NO頓的熒光徽的鵬
在^^物及非生物環(huán)境中，利用0M的i^e^i熒光探針捕,系中的No，使^^針的熒
光3MM著增強(qiáng)，然后M熒光測(cè)定S^確定NO的產(chǎn)生。0M熒光測(cè)定法除了常規(guī)的熒光測(cè)定 法外，還包括時(shí)間^^光測(cè)定法及時(shí)間^#熒 微皿像測(cè)定法。
本發(fā)明的應(yīng)用具體包括但不限于
鵬于化學(xué)體系中NO的檢測(cè)，生物翻鵬Mi且織內(nèi)的NO的分析檢測(cè)和熒光成像檢測(cè)，
1e: R2=R3=R4=H RfOCHg Da. 1f: RfRfRfH R2=OH ^_^臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中NO的檢測(cè)以及生物活體的NO即賺測(cè)。 本發(fā)明的^feMh具有如下皿
1. 穩(wěn)定'斷，l灘長(zhǎng)期保存f頓，翻于中性，弱酸隨堿性多種環(huán)境。
2. 具有極高,O觀啶靈鵬，其最低檢測(cè)下限為17nmol/L (以4M:u為例)。
3. 對(duì)NO有很好的選擇性，與其他的含活性氧、活性氮自由S5HH乍用后熒光信號(hào)幾乎無(wú)變 化。
4. 糊0鵬前后熒光變4tM，熒光穩(wěn)定，適舒體系內(nèi)NO的即時(shí)熒光測(cè)定。
5. 可簡(jiǎn)單ax活細(xì)鵬口離織，特異'鵬獲細(xì)鵬且織中,O，導(dǎo)致配糊的熒光鵬顯
著增強(qiáng)，進(jìn)而用于活細(xì)胞中NO的時(shí)間^^光測(cè)定。
6. 配^K體內(nèi)穩(wěn)定性強(qiáng)，可以直接用于體內(nèi),0熒 ^,皿生物即時(shí)熒光檢測(cè)自 中優(yōu)勢(shì)較為明顯。
本發(fā)明的熒光徽為研効O介導(dǎo)的生物信號(hào)鵬、NO在炎癥中的功能、以淑O御中瘤發(fā)
^程中的意XS診斷,了，的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)方法。

圖l是化激3a-CA 3d-Cu^ 3h-Cu^4b"Cu與不同鵬肝反應(yīng)后的熒光變化倍數(shù)圖，用以證明
它們^NO鵬的選擇性。其中，A是3a《u、 B影h^Cu、 C彭cUCu、 D是4b-Cu;
圖2是化^I3a-Cu^d"QUh-Cu^4b"Cu執(zhí)0反赫后的熒光光i魏化圖，其中，A彭a-Cu、
B彭d-Cu、 C影h-Cu、 D是4bCu;
圖3是化糊4W:u^小鼠巨噬細(xì)胞(Raw264.7)組PS刺激前后NO變化的熒艦像； 圖4是化^J4M:u檢測(cè)肝急性炎癥小鼠中肝臟組織,0局部變化的冰凍切片熒艦像圖； 圖5是i!3lMALDI—TOFSlFT-IR測(cè)定確定4b"CuS]NOaS的機(jī)理，其中，A是4lvCu的
MALDI-TOF測(cè)定圖、B是4W:u別0反應(yīng)后，的MALDI-TOF測(cè)定圖、C是4b的FT-IR測(cè)定圖、D
是4b^Cu^NOSiS后^的FT-IR測(cè)定圖。
具體實(shí)lfi^
實(shí)施例中化糊的編號(hào)對(duì)應(yīng)于戰(zhàn)方案中的化激編號(hào)。^Jfi例1:化，3a-Cu， 3b"Cm 3c-Cu^ 3dCu^ 3h-Cu的共同合^線
分別將300mmo1取f^JC楊醛(la ld) ^ 下溶于125ml的甲醇中，然后加入15Ommo1的 取代鄰苯二腐2a或2b)，室W^1小時(shí)，4jtffi應(yīng)的沉淀物，過(guò)濾收敏淀物，甲纖滌，真 空千嫩導(dǎo)到配體Aa^Ah。
分別將13mmo1的配體Aa^Ah溶于100ml氯仿中，再加入由2.5gMn (n) C124H20溶于40ml 乙醇戶賴i照的溶液，4^褐色溶液，翔每此溶MSA空氣的情況下,12小時(shí)，徵加啡色溶液， 室^^24小時(shí)并M， 咖啡色沉淀，過(guò)濾出沉淀物，用DMF洗滌，再用少量乙S ^滌， 真空千激導(dǎo)到相應(yīng)的三傾配，Ba Bh。
分別將200mg的三催配糊Ba Bh溶于10ml 7jCf 口 5ml甲醇中，力口入少量6mol/LNaOH溶 液，調(diào)節(jié)溶液的PH為IO，然后室溫下,12小時(shí)，過(guò)濾出沉淀物，'搶液中加入少量醋酸，中和 至PH=5，用乙酸乙,取溶液，有機(jī)相用^7K硫,千燥，繊，得，，用薄層,1析赫柱 層析分離，乙酸乙酚正己烷=1: l為展開(kāi)劑，分離出目的，，用乙酸赫乙醇重結(jié)晶，得純品 2-(2-羥基苯基)苯并咪 配體化^13a 3h。
將上步頓的3a， 3b，3c,3(Uh配體化^f2mg分別溶于10ml乙醇，與^f只等摩爾硫, 7jC溶^S^溫下形成配糊，常鵬發(fā)^IJ， ；^以乙醇和去離子水各洗滌三次，即得2-(2名基 ^^萄苯并咪1 ^生物-銅配^/產(chǎn)物，分別稱為3a"Cm 3b"Cu^ 3o(X 3d-Cu和3h《u。
配體化激3a的基本,
NMR (400MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): .5= 13.22 (br s， 2F^ OH and NH), 8.10 (d4 lli arom H J = 1.6,7.2 Hz)， 7.76 " lli arom H J =5.6 Hz)， 7.65 (4 arom Ii J =5.6 Hz)， 7.44~7.32 (11% 3H, arom H), 7.10-7.04 arom H); 13C nmr (100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide):. = 157.9,
151.6， 140.7, 133.0， 131.7, 126.2， 126.0, 123.2， 122.3， 119.0, 117.1, 112.5, 111.4; EI-MS: m/z (relative intensity) = 210 (100，), 182 (20)， 91 (18), 78 (14).
配體化，3b的基本M:
& NMR (400MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): 6^ 13.35 (br s， OH)， 13.00 (s， NH)， 7.95 " 1H,咖m H J = 8.4 Hz), 7.62 (cH 2H, arom H J = 3,2， 9.2 Hz)， 7.25 (私2H, arom H J = 3.2,9.2 Hz)， 6.62 (d《lli arom H, J = 2.4,8.4 Hz)， 6.58 (41H, arom Ii J = 2.4 Hz)， 3.80 (s, 3H， C恥);13C證(100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide) . = 162.2,159.7， 151.6,139.9， 132.8,127.5,127.3,122.6,122.4,106.5, 105.3,101.4， 101.3, 55.4; H-MS: ni/z (relative intensity) = 240 (100,1VT ), 197 (24)， 169 (7), 143 (5), 120 (6)， 106 (7)， 65 (7).
配體化激3c的基本繊
& NMR (400MHz, deuteriodimethyl sulfoxide): 5= 14.68 (br s， 1H， NH), 12.09 (hr s， 1H， OH)， 7.64(d4 2H， arom H J = 3.2， 9.2Hz)， 7.23 (d4 arom H J = 3.2， 9.2 Hz)， 6.35 (s, 2H, arom H)， 4.01 (s， 3H， CH3。)， 3.80 CH30); 13C nmr (100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): . = 162.3， 161.6， 158.8，
150.2， 139.0,132.4， 122.3， 122.2， 116.8,111.9， 95.3， 94.3,90.2， 55.6， 55.1; EI陽(yáng)MS: m/z (relative intensity) =270 (100，)， 240 (16)， 193 (20), 143 (12)， 136 (20)， 121 (17)， 78 (6), 65 (5)， 58 (10).
爿na/. Calcd. for C15H14N203: C， 66.66; H 5.22; N, 10.36. Found: C， 66.38; H， 5.31; N, 10.13.
配體化，3d的鉢繊
NMR(400MH^ deuteriodimethyl sulfoxide): 5= 13.26 (br s, 2H， OH and NH)， 8.15 " 1H， arom H J = 2.8 Hz)， 7.80 " lli arom H J = 8.4Hz)， 7.69 (4 1H arom H, J = 8.4 Hz), 7.47 (d4 lli arom H， J =2.8， 8.8 Hz), 7.37 (hr s, 2H, arom H)， 7.14 " 1H， arom H J = 8.8 Hz); 13C證(100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): . = 156.5， 150.1， 133.2， 133.1， 125.5， 125.4， 123.1， 123.0,122.6， 122.5， 119.0， 118.9， 113.9;EI-MS: m/z (relative intensity) = 246 (33， +2)， 244 (100, )， 216 (8), 181 (16)， 149 (7), 90 (11)， 57 (10).
配體化^|311的基本 :
nmr(400MH^ deuteriodimethyl sulfoxide): 5=13.24(br s, l還NH)， D.10(br s， 1H， OH)， 8.14(4 lli arom H J=2.8Hz)， 7.59" 1H， arom H， J=8.0Hz)， 7.45(br s， arom H), 73, 1H， arom H J=2.8, 8.8Hz)， 7.12(4 lli arom Ii J=8.0Hz), 7.06(4 arom Ii J=8.8Hz), 2.45(s， 3H, CH3); 13C nmr (100
MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): S= 156.4， 149.5,133.2， 131.1， 125.5， 125.4， 124.7， 122.6， 122.5， 118.9,
113.9， 113.8,21.3; EI-MS: m/z (relative intensity) = 260 (31, NT +2)， 258 (91，)， 193 (97)， 136 (100)，
107 (66), 77 (33)， 58 (53).
爿na/. Calcd. for C14HUC1N20: C， 65.00; H 4.29; N， 10.83. Found: C， 64.71; H， 4.40; N, 10.62.
鄉(xiāng)例2:化糊4a，4b，4c，4d，4e，4f的共同合鵬駄其鵬糊的合成
分別將300mmol取f^jC楊斷l(xiāng)a lf) M拌下溶于125ml的甲醇中，然后加入ISOmmol的鄰
萘二胺(2)，室fflt半1小時(shí)，^S應(yīng)的沉淀物，過(guò)濾收敏淀物，甲l^fe滌，真空千Mt導(dǎo)到
配體Da Df。
分別將13mmol的配體Da~Df溶于100ml氯仿中，再加入由2.5gMn (n) C124H20溶于40ml 乙醇鵬暢的溶液，4 色溶液，翔每此溶S^1A空氣的情況下離12小時(shí)，娜啡色溶液， 室M^24小時(shí)并繊，頓咖啡色沉淀，過(guò)濾出沉淀物，用DMF洗滌，再用少量乙^fe滌， 真空千Mf尋到三籠配^tl Ea^Ef。
分別將200mg的三i/r^配^！ Ea~f溶于10ml 7KfB 5ml甲醇中，加入少量t&和的NaOH溶液， 調(diào)節(jié)溶液的PH為10，然后室溫下離12小時(shí)，過(guò)濾出沉淀物，濾液中加入少飄酸，中和至 PH=5，用乙酸乙酯提取溶液，有機(jī)相用^7K硫,千燥，t縮，得產(chǎn)物，用薄層層析或者腺 析分離，乙酸乙酚正己烷l: l為展開(kāi)劑，分離出相應(yīng)的目的,，用乙酸或者乙醇重結(jié)晶，得純品4a 4f。
分別將上步頓的4b, 4c， 44 4e, 4f 2mg溶于10ml乙醇，與^R等摩爾硫,水溶鵬 室溫下形成配^tl，常Sf發(fā)^FU， ^以乙醇和去離子水各洗滌三次，即得2-(2-,5S^^湊并 咪挫^f行生物-KHg^t;產(chǎn)物，分別稱為4a-C^ 4b"Cu^ 4c-Cu^ 4d-Cu^ 4e《u和4f"Cu。
配體化^t!4b的基本im:
'H nmr(400MH^ deuteriodimeihyl sulfoxide): 5=13.50(br s， 1H, NH), 13.03(br s， OH)， 8.18(br s， 1H arom H)， 8.05(4 arom H， J=8.8Hz)， 8.oi(br s, 1H aiom H), 8.02(m^ arom H)， 7.40(m^ 咖m H), 6.68(d4 IH arom H， J=2.8， 8.8Hz), 6.63" 1H， arom J=2.8Hz)， 3.84(s， 3H， OCH3); 13C nmr
(100 MHz^ deuteriodimethyl sulfoxide): 5= 162.8， 162.6， 156.0, 141.6， 141.5， 130.0， 127.98, 127.94，
127.85,127.82， 123.56， 123.50， 113.67， 113.62， 106.7,105.2， 101.4， 55.4; EI-MS:m/z (relative intensity" 290 (100， M), 261 (120)， 247 (23), 219 (6)， 193 (4). Jna/. Calcd for C18H14N202: C， 74.47; H 4.86; N，
9.65. Found: C， 74.21; H 4.95; N， 9.48.
其它配體化的基本娜略
鄉(xiāng)例3:配^WNO的選離
取3a-OUcM:iUh-Cu^4W:u，溶于DMSO中，至終濃度為lmmol/L。向96孑L板中加入各種 銅配J，分另咖入亞硝微，銨根，硝離，過(guò)氧{複，ONOCT， NO，而后向鄉(xiāng)樣品中補(bǔ)加 去離子水，使針孔得到探汁濃度是100,1/L。亞硝艦，銨根，硝麟，過(guò)氧化氫，ONOa， NO的摩爾量分別為相應(yīng)探針的100倍。反應(yīng)1小時(shí)后在,示處測(cè)定熒光3艘，鵬后的熒光強(qiáng) 度除以原本銅離子復(fù)^tl的熒光強(qiáng)度，進(jìn)行熒光值的歸一化(noimalized)。結(jié)果如圖1 B^，其 中，A是3a《u、 B是3d-Cu、 C是3h-Cu、 D是4M:u。
由圖中可以看出，徽3a-Cu^3d-CA 3h-Cu^4l>Cu對(duì)NO具有很高的選擇性和靈敏度。
實(shí)施例4:配，3a^3cUh， 4b~Cu與NO M^的熒光圖譜
麟針34 3d3h4W:u溶于DMSO中，至終濃度為100pmoI/L，與1000當(dāng)量的NO反應(yīng)15 ，后，測(cè)定熒光弓驢變化，驗(yàn)光分別為3a-Cu:316nm， 3d-Cu:326nm， 3h-Cu: 326nm， 4l>Cu: 353nm。結(jié)果如圖2，其中，A是3a-Cu、 B是3d《u、 C是3h-Cu、 D是4b^Cu。所有的熒光弓艘 進(jìn)行歸一化(normalized )。由圖中可以得出,配^t;的本底熒光3艘在一個(gè)很低的本底水平，而跟no反應(yīng)后，熒光 弓艘在i餅內(nèi)即剤腿著的增強(qiáng)。這種熒光增強(qiáng)的'鵬性和明顯性說(shuō)明這幾f^f^針完全可以用
于NO的即時(shí)測(cè)定。
其他配，(除3b"Cu和3c-Cu夕卜，這兩種化，跟NOH^后不具有熒光增強(qiáng)性)顯示出 類似的熒光光譜睞
實(shí)施例5:配，4b>Cu檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO的實(shí)驗(yàn)
取4b"Cu配，溶于DMSO中，濃度為lmmol/L，力口入RAW264.7細(xì)胞中，探針的終濃度為 10nmol/L。 RAW264.7細(xì)胞以含有10%小牛血清的Dulbecco，s modified Eagle's medium if^iS行 i^。在1 12小時(shí)后照熒光照片作為空白對(duì)照;用M桿菌脂多糖LPS(500ng/ml)刺激RAW264.7 細(xì)胞后，同樣加A^濃度為10Mmol/L的4b"Cu,每隔2小,攝熒光照片。為了確認(rèn)4b"Cu在細(xì) 胞內(nèi)的熒光增^^應(yīng)于NO的頓，我們?nèi)?分Raw264.7細(xì)胞，在以LPS刺'鄉(xiāng)lfet前，加 入NO合成酶的抑制劑1400w (N-[3"(aminomethyl)benzyl]acetamidine),同步"ia行熒^M測(cè)，結(jié)果 如圖3。
從圖3中看，探針4b"Cu的檢測(cè)結(jié)果非常明顯，在普通的RAW264.7細(xì)胞中，它的熒光5SJ^R 有微弱的增強(qiáng)，這可能與RAW264.7細(xì)胞本j^生的NO量有關(guān)，而在LPS剌、,RAW264.7細(xì) 胞中，4b"銅復(fù)激的熒光^gW了很大的提高，在10 12小時(shí)這個(gè)區(qū)域內(nèi)熒光3驢超IJ了一個(gè) 極大值，這與LimM.H.等人的結(jié)果很吻合(Nature Chemical Biology, 2， 375-380， 2006)，而當(dāng)加入 NO合成,制劑1400w后，LPS臓導(dǎo)的相應(yīng)熒光3艘升i^嫁消失，證明4b~Cu鄉(xiāng)胞內(nèi)的 熒光變艦應(yīng)于細(xì)胞內(nèi)即時(shí)的NO變化，因此t隨合作細(xì)胞內(nèi)NO的實(shí)時(shí)直接檢測(cè)熒光徽。
實(shí)施例6: 配糊4b^Cu熒光^"測(cè)急14fF損傷艦(Acute Severe Hepatic Injuiy, ASffl)
小,中NO局^l^化(冰凍切片)
取Balb/c小鼠(雄性，8周左右，18 20g)， M0i4lt 300mg/kg的氨基半乳糖和5ng/kgLPS 誘導(dǎo)急'斷損傷，6個(gè)小時(shí)后，進(jìn)行肝門靜詠皿41>01 (10mg^g，溶于DMSO:生S^/JC =1: l的混合溶液中)，半小時(shí)后處死小鼠，取肝于一20。C冰凍，接著肝組織浸潤(rùn)于OCT復(fù)^/中1小時(shí)(SakuraFinetek公司，Torrance, CA)，于一22'C以Sakuracm—41冰凍切片機(jī)切成4Mm厚 的薄片，4'C翻加于薄片進(jìn)根且織固定，固定后1小時(shí)進(jìn)行熒艦微徵見(jiàn)測(cè)。結(jié)果顯舒圖4。 從圖4可以看出，急'SfF損傷小鼠的肝中4b-Cu的熒光3艘有了顯著的提高，而正常小鼠肝中熒 光虧艘提高不慰艮明顯。為了艦4W:u在體內(nèi)的熒光弓艘變化也是NO相關(guān)的，我們以三氯化 釓(GdCl3) (10mg/kg)職24小時(shí)尾靜詠湖Balb/c小鼠，去除NO頓細(xì)胞K，ffere細(xì)胞， 再以GalN+LPS誘導(dǎo)急斷損傷炎癥。誘導(dǎo)后半小時(shí),門靜詠激眷Cu微10mg/kg， 由于巨噬細(xì)胞的消除，肝冰凍切片中的3麟光消失，證明4b"Cu徽在急'l4lf損傷中確^t測(cè)的 是肝中的NO變化，仍參見(jiàn)于圖4。在急'SfF損傷中，肝臟組織是免 胞(尤其是巨噬細(xì)胞)的 攻擊)^，急性的ifeg也會(huì)伴隨著組織中NO濃度的;U:升高。這與4b"銅復(fù)，的檢測(cè)結(jié)果是一 致的。
實(shí)施例7: 4b"Cu和NOM^TO盼測(cè)定
為了測(cè)定和NO反應(yīng)后物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，我們M3lMALDI-TOF (基質(zhì)輔助的激，離厲子化飛 行質(zhì)i普，Bruker Autoflex n timeof-flight (TOF)質(zhì)i靴(Bruker Daltonics, Billerica^ MA)測(cè)定了 4b~Cu 和NO SiS itr后^量的變化。m^激光波長(zhǎng)為X=337nm， a-氰S^羥基肉桂酸(HCCA)作為 做基質(zhì)，在點(diǎn)樣feJl的上樣量為基質(zhì)1W，復(fù)^t/0.5Ml。結(jié)果參見(jiàn)圖5 (A)和(B)。與原化合 物對(duì)比，對(duì)于41> ^|而言，m/z(4b)是289.887, m/z=351.893 4驚了[4b4Cu"-H^,m/zp633.962 條[2(4b) +012+-21^， andm/z=319.415條[4嫌0-rf]。
同時(shí)，以Nexus 870 FT-IR傅立葉變換紅外測(cè)定儀測(cè)定4b"Cu和NO M^tr后的光i魏化。結(jié) 果參見(jiàn)圖5 (C)和(D)。與原化^tl對(duì)比，SSAT^cm-1峰的娜，以及1500cnT1， 1103.0011_1處 峰的出現(xiàn)，證明了-N-N《基團(tuán)的產(chǎn)生，結(jié)合^^量變化的結(jié)果，可鄉(xiāng)ij腿后，結(jié)構(gòu)如下
權(quán)利要求
1. 一種測(cè)定一氧化氮生成的熒光探針，其特征在于該熒光探針是二價(jià)銅離子Cu2+與有機(jī)配位體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑類衍生物形成的銅配合物，其結(jié)構(gòu)為式(I)或(II)id="icf0001" file="S2008100532455C00011.gif" wi="119" he="32" top= "56" left = "47" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/> 4a-CuR1＝R2＝R3＝H；3a-CuR1＝R2＝R3＝R4＝H，R＝H 4b-CuR1＝R3＝H R2＝OMe3b-CuR1＝R3＝R4＝H，R2＝OMe，R＝H 4c-CuR1＝H，R2＝R3＝OMe3c-CuR1＝R3＝H，R2＝R4＝OMe，R＝H 4d-CuR1＝R3＝H R2＝Cl3d-CuR1＝R2＝R4＝H，R3＝Cl，R＝H 4e-CuR2＝R3＝H R1＝OMe3h-CuR1＝R2＝R4＝H，R3＝Cl，R＝CH3 4f-CuR1＝R3＝H R2＝OH。
2、一種權(quán)利要求l臓的熒光探針的合舫法，辦征在于&分別將300mmo1取f^K楊醛(la<l) #下溶于125ml的甲醇中，然后加入15Ommo1 的取代鄰苯二胺(2a或2b)用刊ij備式(I )的 2^1，或加入150mmol的取代鄰萘二胺(2)用刊恪式(n)的iffi激，室w^半i小時(shí)，^a應(yīng)盼沉淀物，過(guò)濾iB^:淀物，甲麟滌，真空千Bt尋到配體Aa-h或Da-f;b. 將13mmo1的配體Aa-h或Da-f溶于100ml氯仿中，再加入由2.5g Mn (n) C12'4H20溶于 40ml乙醇MU得的溶液， 褐色溶液，翔每此溶KfflA空氣的情況下攪拌12小時(shí)，得咖啡 色溶液，室 #24小時(shí)并 ， ^fe咖啡色沉淀，過(guò)濾出沉淀物，用DMF洗滌，再用少量乙 ,滌，真空千激尋到三籠配激Ba-h^Ea-f;c. 將200mg以上得到的三ifi^配^1 B溶于10ml tKI口 5ml甲醇中，力口入少量6mol/L NaOH 溶液，調(diào)節(jié)溶液的PH為IO，然后室溫下,12小時(shí)，過(guò)濾出沉淀物，賺中加入少量醋酸，中 和至PH=5，用乙酸乙酯提取溶液，有機(jī)相用^7K硫,千燥，、鵬，得，，用薄層層析或者 ttM析分離，乙酸乙醱正己烷=1: 1為展開(kāi)劑，分離出目的產(chǎn)物，用乙酸或者乙醇重結(jié)晶得到2-(2-P5基^S)苯并咪P^I^生物3a-h 4a-f;d. 分別社步生成的2-(2-羥基^S)苯并咪Pi^^生物3a-h^ 4a-f 2mg溶于10ml乙醇，與等體3卜Cu: R廣RfR4-H， R2=OMe, R=H 3c-Cu: R廣RfH, R2=R4=OMe, R=H 3d-Cu: RfRfF^H, R3=C1, R=H 3h陽(yáng)Cu: R^R^R^H, R3=C1, R=CH34a-Cu : & =R2=R3= H; 4b-Cu: R廣R^H R2=OMe 4c-Cu : R廣H, R2=R3=OMe4d隱Cu:R產(chǎn)RfHR2K:i 4isCu: R2=R3=H R廣OMe 4f-Cu: R產(chǎn)R廣H R2=OH積等摩爾硫,水溶^^溫下形成配^t/，常Sf^FU， rt/以乙醇和去離子zK各洗滌三次, 即得2"(2一逮^S)苯并咪t^^生物-llllfi^t1^ 3a-h-Cu^ 4a-fCu。
3、 一種權(quán)利要求l臓的熒光徽的頓，辦征在于在錢生物及非生物環(huán)境中，利用 臓的艦激熒光探針捕辦系中的NO，使得熒光徽的熒光^SM著增強(qiáng)，然后淑熒光測(cè) 定、^I5確定N0的產(chǎn)生。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3皿的鵬，，征在于,熒光測(cè)定法除了常規(guī)的熒光測(cè)定法外，還 包括時(shí)間^^光測(cè)定法及時(shí)間i)fJ熒^^微M^像測(cè)定法。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3,的自，，征在于iSffl于化學(xué)體系中的NO的檢測(cè)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3m的應(yīng)用，，征在于應(yīng)用于生物、^lfi^^且織內(nèi)的NO的分析檢 測(cè)麟爐象檢測(cè)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3 m的iSffl，，征在于自于病理研究中NO的檢測(cè)i敘U盒，進(jìn)行 NO即離測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定一氧化氮生成的熒光探針及其應(yīng)用。該熒光探針是二價(jià)銅離子Cu²⁺與有機(jī)配位體2-(2-羥基苯基)苯并咪唑類衍生物形成的銅配合物，具有如下式(I)或(II)的結(jié)構(gòu)。該配合物可簡(jiǎn)單迅速的進(jìn)入活細(xì)胞，進(jìn)而特異性的捕獲細(xì)胞或組織中的活性NO，導(dǎo)致配合物的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，進(jìn)而可以應(yīng)用于化學(xué)體系中NO的檢測(cè)，生物活細(xì)胞或活組織內(nèi)的NO的分析檢測(cè)和熒光成像檢測(cè)，臨床醫(yī)學(xué)上病變組織中NO的檢測(cè)以及生物活體的NO即時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明的熒光探針具有極高的NO測(cè)定靈敏度，其最低檢測(cè)下限為17nmol/L，對(duì)NO有很好的選擇性，和NO反應(yīng)前后熒光變化迅速，熒光穩(wěn)定，同時(shí)該探針具有穩(wěn)定性好，能夠長(zhǎng)期保存使用，適用于中性，弱酸性及堿性多種環(huán)境。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101302425SQ20081005324
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者張峻峰, 張有來(lái), 李明亮, 歐陽(yáng)杰, 沈紅芹, 浩 洪, 勇 趙 申請(qǐng)人:天津理工大學(xué)