專利名稱：：一種檢測(cè)恩諾沙星藥物殘留的膠體金試紙卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獸藥殘留的免疫化學(xué)速測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地涉及一種檢測(cè)恩諾沙星藥物殘留的膠體金試紙卡，借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反應(yīng)，快速檢測(cè)恩諾沙星藥物殘留。
背景技術(shù)：
：恩諾沙星(enrofloxaicn，ENR)藥物是近20年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一類十分重要的廣譜抗生素。在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，本類藥物屬于吡酮酸衍生物(pyridonecarboxylicacids,PCAs)。抑制細(xì)菌DNA螺旋酶，抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透能力強(qiáng)，抗菌作用是磺胺類的近千倍，可與第三代頭孢抗生素相媲美。因化學(xué)結(jié)構(gòu)，價(jià)格低廉，故在醫(yī)學(xué)上和獸醫(yī)學(xué)中很快取得廣泛應(yīng)用。在獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，但由于其耐藥性和潛在的致癌性引起廣泛的關(guān)注。目前恩諾沙星藥物殘留常用的檢測(cè)方法有兩種。一種是色譜分析，如高效液相色譜法(HPLC)，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過(guò)程，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查。另一種為免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，它的缺點(diǎn)是檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，費(fèi)用較高，不利于在基層單位推廣使用。而且，這兩種方法都需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作。膠體金免疫層析(gold-immunochromatographyassay,GIGA)是將膠體金作為示蹤物應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)金技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種敏感度高、操作簡(jiǎn)單、成本低的恩諾沙星藥物殘留快速檢測(cè)試紙卡。本發(fā)明的試紙卡包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊和背襯，在上述反應(yīng)膜具有包被有恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊包被有恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。與常規(guī)試紙卡不同的是，本發(fā)明試紙卡的結(jié)合物釋放墊并非完全覆蓋在樣本墊的下面，而是部分覆蓋在樣本墊的下面。這樣做的好處是可以延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果觀察時(shí)間，樣品墊也可以將檢測(cè)液體充分吸收與金標(biāo)抗體完全接觸充分反應(yīng)，再層析至反應(yīng)膜上進(jìn)行反應(yīng)，可以有效的減少誤差。還可以防止檢測(cè)樣本中一些干擾成份使金標(biāo)抗體中的蛋白失去活性，影響金標(biāo)抗體與包被原的結(jié)合。本發(fā)明將恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)抗原固化于反應(yīng)膜測(cè)試區(qū)內(nèi)，并用膠體金標(biāo)記恩諾沙星單克隆抗體，通過(guò)待測(cè)樣本中的恩諾沙星藥物和包被在反應(yīng)膜上的恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)物共同競(jìng)爭(zhēng)恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，根據(jù)測(cè)試區(qū)條顏色深淺或有無(wú)紅色條帶來(lái)判斷待測(cè)樣本液中是否含有恩諾沙星殘留。檢測(cè)時(shí)，樣本溶液滴入試劑卡孔內(nèi)，當(dāng)恩諾沙星在樣本中濃度低于40ng/ml時(shí)，膠體金抗體在層析過(guò)程中會(huì)被固定在反應(yīng)膜上的恩諾沙星的偶聯(lián)物結(jié)合，在測(cè)試區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)各出現(xiàn)一條紅色條帶。如果恩諾沙星在樣本中濃度高于40ng/ml時(shí)，膠體金抗體與樣本中的恩諾沙星全部結(jié)合，從而在(T)區(qū)內(nèi)因?yàn)榫範(fàn)幏磻?yīng)不與恩諾沙星偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測(cè)過(guò)程中由于缺少抗體抗原竟?fàn)幏磻?yīng)，將會(huì)在(T)區(qū)與(C)區(qū)內(nèi)出現(xiàn)紅色條帶。如圖2所示。陽(yáng)性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，而(T)區(qū)不顯色，判為陽(yáng)性，表示恩諾沙星含量超過(guò)40ng/ml，用"+"表示。陰性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，(T)區(qū)同時(shí)顯示出紅色條帶，且(T)帶顏色接近或淺于(C)帶時(shí)，判為陰性，表示恩諾沙星含量小于40ng/ml，用"-"表示。無(wú)效當(dāng)(C)區(qū)不顯示出紅色條帶，則無(wú)論(T)區(qū)顯示出紅5色條帶與否，該試紙卡判為無(wú)效。本發(fā)明還提供了制備上述試紙卡的方法，其包括步驟1)制備包被恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；2)制備具有包被恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；3)將1)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣本墊、吸水墊和背襯組裝成試紙卡。具體地說(shuō)，其步驟包括(1)將恩諾沙星與載體蛋白偶聯(lián)，形成恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)物；(2)用恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)融合、篩選，得到分泌恩諾沙星單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；(3)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗體；(4)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；(5)將制備的恩諾沙星單克隆抗體加入制備的膠體金中，得到恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；(6)將結(jié)合物釋放墊用含0.10.5%酪蛋白的磷酸氫二鉀和轔酸二氫鉀混合緩沖液浸泡30秒，在37'C烘2h，然后將恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物包被在結(jié)合物釋放墊上；(7)將恩諾沙星-人血清白蛋白偶聯(lián)物包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成測(cè)試區(qū)，并將羊抗鼠IgG包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控區(qū)，用含0.5%脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉；(8)將樣本墊用含0.050.1%人清蛋白、0.5~1%吐溫-50的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合緩沖液浸泡2h,在37X:烘2h;(9)在背襯上按順序貼上反應(yīng)膜、吸水墊、結(jié)合物釋放墊和樣6本墊，將樣本墊蓋住結(jié)合物釋放墊。最后切成3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝。將樣本墊蓋住結(jié)合物釋放墊可以延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果觀察時(shí)間，可使樣本墊將檢測(cè)液體充分吸收并與金標(biāo)抗體充分反應(yīng)，從而減少誤差。本發(fā)明試紙卡具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單、保質(zhì)期長(zhǎng)成本低等優(yōu)點(diǎn)，能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控，適合大量樣本篩查。圖i為本發(fā)明檢測(cè)試紙卡的組裝示意圖；圖2為本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果分析示意圖。圖中1、樣本墊；2、結(jié)合物釋放墊；3、反應(yīng)膜；4、吸水墊；5、測(cè)試區(qū)；6、質(zhì)控區(qū)；7、背襯。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)可能會(huì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾同樣應(yīng)落入發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1恩諾沙星檢測(cè)試紙卡的制備1、恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定(1)恩諾沙星-人血清蛋白偶聯(lián)物的合成30mg恩諾沙星用lml二甲基甲酰溶解。冷卻至10度，加40ul氯甲酸異丁酯，IO度攪拌反應(yīng)30分鐘。120mgHSA用2ml5Ommol/LNa2C02溶解。10度反應(yīng)4小時(shí)(必要時(shí)加NaOH,維持溶液的pH為9.0),然后4度過(guò)夜。冷凍干燥，-20°。保存。(2)恩諾沙星-牛血清蛋白的合成取EDC100mg,用pH8.0的1Ommol/LPBS液1.5mL使之充分溶解(I液)。取恩諾沙星40mg,用0.2mol/LNaOH溶液2ml溶液溶解(II液)。取BSA100mg，溶于3mll0mmol/LPBS(pH8.0)液中(in液)。將II液與m液混合，在磁力攪拌下逐滴加入I液(余下0.5ml)。室溫下避光攪拌l小時(shí)，逐滴加入余下的I液。4度攪拌12小時(shí)。靜置10小時(shí)(4度)。用蒸餾水使之充分透析(約48小時(shí))，冷凍干燥，-2(TC保存。(3)恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白恩諾沙星藥物半抗原、恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH9PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在200-800nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，得到載體蛋白恩諾沙星藥物、恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。并出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明恩諾沙星藥物與載體蛋白偶聯(lián)成功。2、恩諾沙星單克隆抗體的制備(1)動(dòng)物免疫將免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，劑量為50嗎/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。(2)細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5:l比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接竟?fàn)嶦LISA法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并意外發(fā)現(xiàn)，其中一株效價(jià)顯著高于其它雜交瘤細(xì)胞株，將該雜交瘤細(xì)胞株命名為C-1-2，該細(xì)胞株已于2007年12月25曰保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京巿朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2298。(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-l-2用凍存液制成lxl()S個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37'C水洛中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。(4)單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注射滅菌石蠟油，劑量為0.4ml/只，7天后腹腔注射恩諾沙星的單克隆雜交瘤細(xì)胞株C-l-25xl0S個(gè)/只，7天后釆集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20。C環(huán)境中保存。3、羊抗鼠抗抗體的制備以山羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4、恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(1)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%,置磁力加熱棒攪拌器上攪拌煮沸，每100ml0.01。/。的氯金酸加入2ml1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，液體呈紅色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無(wú)沉淀和漂浮物，有效期為一個(gè)月。(2)恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用O.IM碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2,按12pg/ml抗體膠體金加入恩諾沙星單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻30min,加入10。/。BSA至終濃度為1。/。，靜置30min。12000rpm、4°C離心30min,棄去上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用初始膠體金體積1/20的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4。C備用，保存60天。復(fù)溶緩沖液含牛血清白蛋白(BSA)0.02~0.1%,吐溫-200.05~0.2%，維生素C(Vit-C)0.r/。，0.02MpH9.0的硼酸復(fù)溶緩沖液。5、結(jié)合物釋放墊的包被將結(jié)合物釋放墊放入含有0.10.5%酪蛋白的磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀混合緩沖液浸濕30秒，37'C烘2h備用；用Biodot點(diǎn)膜儀將制備好的恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物均勻包被在結(jié)合物釋放墊上，每5cm結(jié)合物釋放墊包被9^tl恩諾沙星單克隆抗體-膠體金標(biāo)9記物，真空干燥，真空封裝，置4'C備用。6、反應(yīng)膜的制備將硝酸纖維素膜上分別包被恩諾沙星-載體蛋白偶聯(lián)物構(gòu)成測(cè)試區(qū)和羊抗鼠IgG構(gòu)成質(zhì)控區(qū)，再用含0.5%的脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉。包被過(guò)程用磷酸鉀緩沖液(含3%的甲醇)將恩諾沙星-人血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物稀釋至15ng/mL，用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜作為測(cè)試區(qū)，包被量為0.7嗎/cm2,測(cè)試區(qū)靠近結(jié)合物釋放墊端，距結(jié)合物釋放墊端約8mm;用0.01M碟酸鉀緩沖液(含3%的甲醇)將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200|Lig/ml，用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于纖維素膜作為質(zhì)控區(qū)，包被量為0.7pg/ml2，質(zhì)控區(qū)靠近吸水墊，距吸水墊約8mm,兩線距離58mm。37"C烘干，封裝。7、膠體金免疫試紙卡的組裝在PVC背襯上按順序貼硝酸纖維素膜、吸水墊、結(jié)合物釋放墊，最后貼樣本墊，將樣本墊蓋住結(jié)合物釋放墊。切成3mm寬的小條，加塑料盒，真空包裝。原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于1825°C，有效期一年。本發(fā)明的試紙卡將樣品墊覆蓋在結(jié)合物釋放墊二分之一處，可以延長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果觀察時(shí)間，樣品墊也可以將檢測(cè)液體充分吸收與金標(biāo)抗體完全接觸充分反應(yīng)，再層析至反應(yīng)膜上進(jìn)行反應(yīng)，可以有效的減少誤差。還可以防止檢測(cè)樣本中一些干擾成份使金標(biāo)抗體中的蛋白失去活性，影響金標(biāo)抗體與包被原的結(jié)合。實(shí)施例2樣本中恩諾沙星殘留的檢測(cè)1、樣本前處理(1)動(dòng)物組織前處理(雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚、蝦)稱取1.0士0.05g勻質(zhì)過(guò)的組織樣本于離心管中，加入4ml去離子水，蓋緊瓶蓋。將裝有樣本的離心管在微沸的水洛鍋中水浴10min,吸取三滴以上溶液倒1.5ml的離心管中。如有明顯黃色渾濁請(qǐng)離心，然后使用上清液作為待測(cè)樣本溶液。(2)血清樣本的前處理將少量血清樣本放于離心管中，加入4ml去離子水，混合后作為待測(cè)樣本溶液。2、用本發(fā)明的試紙卡進(jìn)行檢測(cè)用滴管向試劑卡孔內(nèi)滴加3滴樣本，58min后觀察結(jié)果。超過(guò)10min，則樣本檢測(cè)判讀結(jié)果無(wú)效。3、檢測(cè)結(jié)果分析恩諾沙星在樣本中濃度高于40ng/ml時(shí)，膠體金抗體與恩諾沙星全部結(jié)合，從而在(T)區(qū)因?yàn)榫範(fàn)幏磻?yīng)不會(huì)與恩諾沙星偶聯(lián)物結(jié)合而不出現(xiàn)紅色條帶。陰性樣本在檢測(cè)過(guò)程中由于缺少抗體抗原競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，將會(huì)在(T)區(qū)與(C)區(qū)內(nèi)出現(xiàn)紅色條帶。陽(yáng)性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，而(T)區(qū)不顯色時(shí)，判為陽(yáng)性，用"+"表示。陰性當(dāng)(C)區(qū)顯示出紅色條帶，(T)區(qū)同時(shí)顯示出紅色條帶時(shí)，且(T)區(qū)顏色接近或淺于(C)區(qū)時(shí)，判為陰性，用"-"表示。無(wú)效當(dāng)(C)區(qū)不顯示出紅色條帶，則無(wú)論(T)區(qū)顯示出紅色條帶與否，該試紙卡判為無(wú)效。如圖2所示。實(shí)施例3樣本檢測(cè)實(shí)例取已知恩諾沙星藥物殘留濃度大于40ng/g的豬肉、雞肉、豬肝、蟲下、血清樣本各20份和各種陰性樣本各20份，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算其陰陽(yáng)性率。結(jié)果如表1表5所示。表l豬肉樣本陰陽(yáng)性率檢測(cè)樣本編號(hào)樣本l樣本2樣本3樣本4樣本5檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)樣本6樣本7樣本8樣本9樣本10陰性檢測(cè)樣本結(jié)果11樣本編號(hào)樣本11樣本12樣本13樣本14樣本15檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)樣本16樣本17樣本18樣本19樣本20檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)樣本l樣本2樣本3樣本4樣本5檢測(cè)結(jié)果++++陽(yáng)性樣本編號(hào)樣本6樣本7樣本8樣本9樣本10樣本(>10檢測(cè)結(jié)果++++++ng/g)樣本編號(hào)樣本11樣本12樣本13樣本14樣本15檢測(cè)結(jié)果++++++樣本編號(hào)樣本16樣本17樣本18樣本19樣本20檢測(cè)結(jié)果++++++表2雞肉樣本陰陽(yáng)性率檢測(cè)樣本編號(hào)樣本l樣本2樣本3樣本4樣本5檢測(cè)結(jié)果陰性樣本編號(hào)樣本6樣本7樣本8樣本9樣本10樣本檢測(cè)結(jié)果-一-一——_-一樣本編號(hào)樣本11樣本12樣本13樣本14樣本15檢測(cè)結(jié)果----+——-一-一樣本編號(hào)樣本16樣本17樣本18樣本19樣本20檢測(cè)結(jié)果樣本編號(hào)樣本l樣本2樣本3樣本4樣本5<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表4蝦樣本陰陽(yáng)性率檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表5血清樣本陰陽(yáng)性率檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>結(jié)果表明豬肉、雞肉、豬肝、蝦、血清20份陽(yáng)性樣本和20份各自的陰性樣本，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2次，豬肉樣本中其陰陽(yáng)性符合率均為100%，雞肉樣本中假陽(yáng)性率8%以下，其陽(yáng)性符合率均為100%，陰性符合率均為92%以上。豬肝樣本中其陰陽(yáng)性符合率均為100%，蝦樣本中假陽(yáng)性率10%以下，其陽(yáng)性符合率均為100%,陰性符合率均為90%以上。血清樣本中假陽(yáng)性率13%以下，其陽(yáng)性符合率均為100%,陰性符合率均為87%以上。說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)試紙卡完全可以作為常規(guī)方法用于巿場(chǎng)上對(duì)恩諾沙星殘留的快速檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)例1敏感性和特異性試驗(yàn)特異性試驗(yàn)本發(fā)明檢測(cè)試紙卡的標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性檢測(cè)濃度為10ng/ml,檢測(cè)恩諾沙星藥物及陰性標(biāo)準(zhǔn)品，同樣將依諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星、雙氟沙星、沙拉沙星按5，6，7,8,9,10、20、40、60、120、500、1000、5000、25000ng/ml進(jìn)行稀釋，用本發(fā)明的試紙卡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為依諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、達(dá)氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、噁喹酸、氟甲喹、麻保沙星、氨氟沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、沙拉沙星均在20000、50000ng/ml濃度時(shí)測(cè)試區(qū)不顯，通過(guò)計(jì)算可得出交叉反應(yīng)率，全都小于1%。如表6所示。交叉反應(yīng)越大，說(shuō)明此試紙卡對(duì)恩諾沙星檢測(cè)的特異性就越好。表6本發(fā)明試紙卡特異性試驗(yàn)結(jié)果藥物交叉反應(yīng)率(％)恩諾沙星100%依諾沙星小于1%諾氟沙星小于1%氧氟沙星小于1%達(dá)氟沙星小于1%培氟沙星小于1%環(huán)丙沙星小于1%洛美沙星小于1%噁喹酸小于1%氟甲喹小于1%麻保沙星小于1%氨氟沙星小于1%雙氟沙星小于1%沙拉沙星小于1%1權(quán)利要求1、一種檢測(cè)恩諾沙星藥物的膠體金試紙卡，包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊和背襯，其特征在于所述反應(yīng)膜上具有包被有恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊包被有恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。2、如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙卡，其特征在于所述恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物由恩諾沙星藥物與載體蛋白偶聯(lián)得到。3、如權(quán)利要求1或2所述的膠體金試紙卡，其特征在于所述恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的恩諾沙星藥物單克隆抗體是以恩諾沙星藥物與載體蛋白偶聯(lián)得到偶聯(lián)復(fù)合物作為免疫原制備獲得。4、如權(quán)利要求1或2所述的膠體金試紙卡，其特征在于所述恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的恩諾沙星藥物單克隆抗體是由雜交瘤細(xì)胞株C-l-2CGMCCNo.2298分泌獲得。5、如權(quán)利要求1或2所述的膠體金試紙卡，其特征在于，所述結(jié)合物釋放墊的部分區(qū)域被覆蓋于樣本墊之下。6、權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述膠體金試紙卡在檢測(cè)恩諾沙星藥物中的應(yīng)用。7、一種制備權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述膠體金試紙卡的方法，其包括步驟1)制備包被恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的結(jié)合物釋放墊；2)制備具有包被恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；3)將l)和2)制備好的結(jié)合物釋放墊、反應(yīng)膜與樣本墊、吸水墊和背襯組裝成試紙卡。8、一種檢測(cè)樣本中恩諾沙星藥物殘留的方法，其特征在于包括1)樣本前處理；2)用權(quán)利要求15任意一項(xiàng)所述的試紙卡進(jìn)行檢測(cè)；3)分析檢測(cè)結(jié)果。9、一種分泌恩諾沙星藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株C-l-2CGMCCNo.2298。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)恩諾沙星藥物的膠體金免疫試紙卡，包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊、吸水墊和背襯，在所述反應(yīng)膜上具有包被有恩諾沙星藥物-載體蛋白偶聯(lián)物的測(cè)試區(qū)和包被有羊抗鼠IgG的質(zhì)控區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊包被有恩諾沙星藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述試紙卡檢測(cè)恩諾沙星藥物的方法，它包括步驟首先進(jìn)行樣本前處理，然后用試紙卡進(jìn)行檢測(cè)，最后分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提供的試紙卡可用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品如豬肉、豬肝、雞肉、雞肝、血清、魚、蝦中的恩諾沙星藥物殘留量，其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)速度快、成本低，能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控，滿足大量樣本篩查的需要。文檔編號(hào)G01N33/558GK101498726SQ200810057198公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2008年1月30日優(yōu)先權(quán)日2008年1月30日發(fā)明者萬(wàn)宇平,何方洋,馮才偉,馮才茂,吳小平,亮朱,汪善良,沈建忠,趙正苗申請(qǐng)人:北京望爾生物技術(shù)有限公司;北京望爾康泰生物技術(shù)有限公司