一種犬弓形蟲感染膠體金檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測(cè)犬弓形蟲感染膠體金試紙條及其制備方法，是通過(guò)克隆、表達(dá)純化SAG3重組蛋白，制備并純化單克隆抗體，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金對(duì)42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體標(biāo)記，制備金標(biāo)墊，組裝試紙條，29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體作為檢測(cè)線、羊抗鼠抗體作為質(zhì)檢線。制備的犬弓形蟲感染檢測(cè)膠體金試紙條具有快捷、便于操作、不需要特殊儀器等特點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果清晰，可以較快的進(jìn)行判斷，并能區(qū)分是既往感染還是現(xiàn)癥感染，適合于臨床現(xiàn)場(chǎng)的快速診斷和牧區(qū)等大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。
【專利說(shuō)明】
一種犬弓形蟲感染膠體金檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明提供一種膠體金檢測(cè)試紙條，用于犬弓形蟲感染循環(huán)抗原(CAg)的檢測(cè)，本發(fā)明還公開了上述試紙條的制備方法，屬于血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]弓形蟲屬于細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，能感染絕大多數(shù)的脊椎動(dòng)物，是一種人獸共患寄生蟲。犬是弓形蟲的中間宿主之一。弓形蟲在犬組織內(nèi)進(jìn)行無(wú)性繁殖，當(dāng)弓形蟲侵入免疫力正常犬機(jī)體時(shí)，蟲體在犬體內(nèi)緩慢形成可寄生長(zhǎng)達(dá)終生的包囊。只有當(dāng)受感染犬免疫力低下時(shí)，體內(nèi)的弓形蟲便趁機(jī)迅猛繁殖，從而引發(fā)其全身性的感染，不僅造成犬機(jī)體嚴(yán)重受損，也使得與患病犬親密接觸的人群和公共環(huán)境遭受弓形蟲的侵染和破壞。建立快速、敏感和特異的檢測(cè)方法具有重要意義。SAG3蛋白在弓形蟲的各個(gè)時(shí)期表達(dá)，用于診斷弓形蟲病時(shí)則能較為全面的檢測(cè)各個(gè)階段的弓形蟲感染。目前尚未見利用SAG3蛋白進(jìn)行犬弓形蟲檢測(cè)研究的相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是公開一種檢測(cè)犬弓形蟲循環(huán)抗原(CAg)膠體金試紙條，解決了當(dāng)前犬弓形蟲感染缺乏理想檢測(cè)方法問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明還提供了上述試紙條的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明檢測(cè)試紙條的制備方法如下:
本發(fā)明檢測(cè)弓形蟲CAg膠體金檢測(cè)試紙條，是以本實(shí)驗(yàn)室制備的42#抗弓形蟲SAG3單抗(單克隆細(xì)胞抗體效價(jià)為204800，亞類為Gl)為捕獲抗體標(biāo)記膠體金制作金標(biāo)墊，以29#抗弓形蟲SAG3單抗(單克隆細(xì)胞抗體效價(jià)為204800，亞類為G2a)包被硝酸纖維膜(NC膜)作為檢測(cè)線(T)，用羊抗鼠抗體作為質(zhì)控線(C)。
[0006]本發(fā)明用42#抗弓形蟲SAG3單抗作為捕獲抗體，用29#抗弓形蟲SAG3單抗為檢測(cè)抗體，能特異性的檢測(cè)出犬血清中是否含有弓形蟲CAg。用兩株單抗制備出膠體金試紙條，保留了其特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并增強(qiáng)了其靈敏度高、穩(wěn)定性。
[0007]本發(fā)明弓形蟲CAg檢測(cè)膠體金試紙條的積極效果在于:檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單、易于判斷和保存，且無(wú)需任何儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)并能區(qū)分是既往感染還是現(xiàn)癥感染。適合于臨床的快速診斷和基層等應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明涉及的一種檢測(cè)犬弓形蟲感染膠體金試紙條，主要包括玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙、PVC底板;其特征在于:
金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體為42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的指示線T線包被29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體，建立了一種雙抗體夾心膠體金試紙條檢測(cè)方法。
[0009]本發(fā)明涉及的一種檢測(cè)犬弓形蟲感染膠體金試紙條的制備方法，是通過(guò)克隆、表達(dá)純化SAG3重組蛋白，制備并純化單克隆抗體，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金對(duì)42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體標(biāo)記，制備金標(biāo)墊，組裝試紙條，29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體作為檢測(cè)線、羊抗鼠抗體作為質(zhì)檢線，其中:
一、弓形蟲SAG3基因的克隆、表達(dá)及純化
1、SAG3基因的引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中弓形蟲的SAG3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異的寡核苷酸引物。
[0010]上游引物:5-TATGAATTCGAGCACGGACTGTTCGTC-37下游引物:5-ATAAAGCTTTTAGGCAGCCACATGCACAAG-37。
[0011]2、SAG3基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收
以弓形蟲cDNA為模板，進(jìn)行體外擴(kuò)增。按小量膠回收試劑盒說(shuō)明(TAKARA)進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。
[0012]3、SAG3基因的表達(dá)及鑒定
將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)中。后將已經(jīng)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，膠回收目的片段并進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)，在含Kan的LB瓊脂平板上涂板，挑取單個(gè)菌落，菌液培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。
[0013]4、SAG3基因在大腸桿菌中表達(dá)及鑒定
將SAG3基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。利用8M尿素純化SAG3蛋白。經(jīng)Western blot分析得知該重組蛋白可被犬弓形蟲陽(yáng)性血清識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。
[0014]二、抗弓形蟲SAG3蛋白單克隆抗體的制備
1、動(dòng)物免疫
利用純化后的弓形蟲SAG3蛋白按60yg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只BALB/c雌性小鼠。之后每隔13-15天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共三次。免疫量為30yg蛋白/只。最后一次加強(qiáng)免疫10天后，利用間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠的抗體效價(jià)。
[0015]2、骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合
取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0016]3、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選
用間接ELISA方法進(jìn)行抗體的檢測(cè)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行克隆。
[0017]4、單克隆細(xì)胞亞型鑒定
利用抗體亞型鑒定試劑盒，對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。結(jié)果單抗的29#亞類均為G2a，42#亞類為Gl。
[0018]5、單克隆抗體的大量制備將雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔，收集腹水。
[0019]三、膠體金試紙條的制備
硝酸纖維素膜21mm，樣品墊24mm、金標(biāo)墊9mm、吸水紙32mm從下到上依次粘貼于PVC底板上，樣品墊壓金標(biāo)墊2mm，金標(biāo)墊壓NC膜2mm，吸水紙壓NC膜2mm;依次粘貼好后，用切紙機(jī)將組裝的試紙板切成每條寬度為4mm的試紙條，T線包被29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體即可。
[0020]本發(fā)明的積極效果在于:
制備的犬弓形蟲感染檢測(cè)膠體金試紙條具有快捷、便于操作、不需要特殊儀器等特點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果清晰，可以較快的進(jìn)行判斷，并能區(qū)分是既往感染還是現(xiàn)癥感染，適合于臨床現(xiàn)場(chǎng)的快速診斷和牧區(qū)等大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。
[0021 ]高特異性和敏感性:本發(fā)明用42#抗弓形蟲SAG3單抗作為捕獲抗體，用29#抗弓形蟲SAG3單抗為檢測(cè)抗體，能特異性的檢測(cè)出犬血清中是否含有弓形蟲CAg。用兩株單抗制備出膠體金試紙條，保留了其特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，并增強(qiáng)了其靈敏度、穩(wěn)定性。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1膠體金試紙條T線條件的確定圖2膠體金試紙條C線條件的確定；
圖3膠體金試紙條的特異性試驗(yàn)；
圖4膠體金試紙條的敏感性試驗(yàn)；
圖5膠體金試紙條的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；
圖6膠體金試紙條的批間重復(fù)性試驗(yàn)；
圖7膠體金試紙條的穩(wěn)定性試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1
犬弓形蟲感染檢測(cè)膠體金試紙條的制備
(I)膠體金的燒制
采用檸檬酸鈉還原法，量取99 mL四蒸水加入到硅化過(guò)的錐形瓶中，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，調(diào)節(jié)磁力加熱攪拌器，使轉(zhuǎn)子勾速轉(zhuǎn)動(dòng)，保持恒定高溫。當(dāng)觀察到瓶底開始起氣泡時(shí)，加Al %的氯金酸溶液I mL，調(diào)節(jié)攪拌旋鈕至適當(dāng)轉(zhuǎn)速，讓攪拌轉(zhuǎn)子的速度降至沸騰的液面不打漩渦，避開易出漩渦的中間部位迅速加入2.6 mL的1%檸檬酸三鈉，隨后可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液很快變成灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約6 min，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后用去離子水補(bǔ)足體積至100 mL。即制備出30nm膠體金顆粒。
[0025](2)金標(biāo)抗體最佳pH確定
用0.2 mo I/L K2CO3結(jié)合精密pH試紙調(diào)節(jié)膠體金溶液pH依次為3.0-10.0，每隔I個(gè)pH值為一個(gè)檢測(cè)梯度。每管加入2.73 !^/!^的單抗3.7 nL，在振蕩器上混勻，室溫下放置30分鐘。觀察膠體金顏色變化，記錄保持和空白對(duì)照顏色一致的最低PH，即為最佳的標(biāo)記pH。
[0026](3)金標(biāo)抗體的制備
將最適K2⑶3的量加入膠體金溶液，再對(duì)42#抗弓形蟲SAG3單抗進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的金標(biāo)抗體溶解于復(fù)溶液中，混勻后即為金標(biāo)抗體，將其滴加于金標(biāo)墊上。
[0027](4) NC膜上T線單抗包被濃度的確定
將T線29#抗弓形蟲SAG3單抗稀釋成1、0.5、0.25、0.125yg/yL，每個(gè)試紙條包被0.8仙，按照常規(guī)條件進(jìn)行操作，觀察T線的顯色情況，確定T線單抗的最佳包被濃度。
[0028](5) NC膜上C線羊抗鼠抗體包被濃度的確定
將C線羊抗鼠抗體稀釋成1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每個(gè)試紙條包被0.8 yL，按照常規(guī)條件進(jìn)行操作，觀察結(jié)果C線的顯色情況，確定C線羊抗鼠抗體的最佳包被濃度。
[0029]、結(jié)果 (I)膠體金的燒制
膠體金溶液顏色均勻透明，透射電鏡觀察顆粒大小基本一致，約30 nm左右，分散均勻，沒有聚集，可用于下一步試驗(yàn)。
[0030](2)金標(biāo)抗體最佳pH確定
確定膠體金標(biāo)記抗體的最適0.2 mol/L K2CO3加入量為4 yL。
[0031](3)金標(biāo)抗體的制備
通過(guò)透射電鏡觀察，金顆粒周圍有一圈蛋白暈，分散性較好，無(wú)聚集現(xiàn)象，表明標(biāo)記成功。
[0032](4)NC膜上T線單抗最佳包被濃度的確定
29#抗弓形蟲SAG3單抗?jié)舛认♂尩?.5 yg/yL時(shí)T線顯色仍較為明顯，故選擇0.5 yg/yL為T線最佳包被濃度(見圖1)。
[0033](5) NC膜上C線抗體最佳包被濃度的確定
結(jié)果顯示當(dāng)羊抗鼠抗體濃度稀釋到0.5 yg/yL包被時(shí)C線顯色最明顯，故選擇0.5 yg/μL為C線最佳包被濃度(見圖2 )。
[0034]實(shí)施例2膠體金免疫層析試紙條性能測(cè)試
為了測(cè)試試紙條的試驗(yàn)性能，需要進(jìn)行一系列的試驗(yàn)，其中包括特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、保存期試驗(yàn)。
[0035](I)特異性試驗(yàn)
分別取犬弓形蟲感染參考陽(yáng)性血清、犬心絲蟲、犬蛔蟲、犬等孢球蟲、犬巴貝斯蟲陽(yáng)性血清，按照常規(guī)方法進(jìn)行操作，判斷各種血清之間有無(wú)交叉反應(yīng)，從而評(píng)價(jià)試紙條的特異性(見圖3)。
[0036](2)敏感性試驗(yàn)
將犬弓形蟲感染參考陽(yáng)性血清(1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、)，按常規(guī)操作觀察試紙條顯色情況。當(dāng)用肉眼無(wú)法觀察到T線，并且C線依舊清晰可見時(shí)，此時(shí)的稀釋度即為該方法的最低檢出濃度(見圖4)。
[0037](3)重復(fù)性試驗(yàn) I)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)
取犬弓形蟲感染參考陽(yáng)性血清，同一批試紙條，對(duì)3份參考陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)I次，根據(jù)試紙條顯色情況，確定該方法的重復(fù)性情況。
[0038](2)批間重復(fù)性試驗(yàn)
取犬弓形蟲感染參考陽(yáng)性血清，3批試紙條，對(duì)3份參考陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)2次，根據(jù)試紙條顯色情況，確定該方法的重復(fù)性情況。
[0039](4)穩(wěn)定性試驗(yàn)
將試紙條密封保存分別于4°C、37°C、室溫。分別在7 d、15 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)犬弓形蟲感染參照陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，觀察三種環(huán)境各試紙條的顯色情況，從而判斷試紙條檢測(cè)的穩(wěn)定情況。
[0040](5)試紙條的初步應(yīng)用
用膠體金試紙條方法檢測(cè)76份待檢犬血清樣本(均來(lái)自長(zhǎng)春地區(qū)某寵物醫(yī)院)。
[0041]、結(jié)果 (1)特異性試驗(yàn)
結(jié)果只有犬弓形蟲參照陽(yáng)性血清T線顯色，犬心絲蟲、犬蛔蟲、犬等孢球蟲、犬巴貝斯蟲陽(yáng)性血清T線均無(wú)顯色，表明無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。(見圖3)
(2)敏感性試驗(yàn)
結(jié)果1:64倍稀釋時(shí)T線仍有顯色，所以該試紙條敏感性為1:64。(見圖4)
(3)重復(fù)性試驗(yàn)
I)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn):同一批試紙條，對(duì)3份犬弓形蟲參考陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)I次，試紙條的檢測(cè)結(jié)果相一致(見圖5)。
[0042]2)批間重復(fù)性試驗(yàn):3批試紙條，對(duì)3份犬弓形蟲參考陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)2次，檢測(cè)試紙條的診斷結(jié)果相一致(見圖6)。
[0043]說(shuō)明該方法具有可重復(fù)性。
[0044](4)保存期試驗(yàn)
結(jié)果表明將試紙條密封保存分別于4°C、37°C、室溫時(shí)，于15 d后依舊能夠顯示正確結(jié)果，T/C線顯色情況均也無(wú)太大區(qū)別，說(shuō)明該試紙條至少可以存放15 d以上(見圖7)。
[0045](5)膠體金試紙條的初步應(yīng)用
應(yīng)用已經(jīng)建立的膠體金試紙條檢測(cè)方法，76份待檢犬血清樣本(均來(lái)自長(zhǎng)春地區(qū)某寵物醫(yī)院)。結(jié)果顯示有4份血清樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，所以檢出率為5.26%(4/76)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種檢測(cè)犬弓形蟲感染膠體金試紙條，主要包括玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水紙、PVC底板;其特征在于: 金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體為42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體，硝酸纖維素膜上的指示線T線包被29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體。2.如權(quán)利要求1所說(shuō)的一種檢測(cè)犬弓形蟲感染膠體金試紙條的制備方法，通過(guò)克隆、表達(dá)純化SAG3重組蛋白，制備并純化單克隆抗體，利用檸檬酸三鈉還原法燒制膠體金溶液，之后利用膠體金對(duì)42#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體標(biāo)記，制備金標(biāo)墊，組裝試紙條，29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體作為檢測(cè)線、羊抗鼠抗體作為質(zhì)檢線，其中: 弓形蟲SAG3基因的克隆、表達(dá)及純化 I )SAG3基因的引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中弓形蟲的SAG3基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異的寡核苷酸引物； 上游引物:5-TATGAATTCGAGCACGGACTGTTCGTC -37 ； 下游引物:5-ATAAAGCTTTTAGGCAGCCACATGCACAAG-37 ； . 2) SAG3基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收 以弓形蟲cDNA為模板，進(jìn)行體外擴(kuò)增;進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收； . 3)SAG3基因的表達(dá)及鑒定 將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)中；后將已經(jīng)鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，膠回收目的片段并進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)，在含Kan的LB瓊脂平板上涂板，挑取單個(gè)菌落，菌液培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定； . 4 ) SAG3基因在大腸桿菌中表達(dá)及鑒定 將SAG3基因經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá);進(jìn)行SDS-PAGE鑒定;利用8M尿素純化SAG3蛋白； 經(jīng)Western blot分析得知該重組蛋白可被犬弓形蟲陽(yáng)性血清識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性； 抗弓形蟲S AG 3蛋白單克隆抗體的制備 1)動(dòng)物免疫 利用純化后的弓形蟲SAG3蛋白按60yg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只BALB/c雌性小鼠；之后每隔13-15天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共三次;免疫量為30yg蛋白/只；最后一次加強(qiáng)免疫10天后，利用間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠的抗體效價(jià)；. 2)骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合；. 3)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選 用間接ELISA方法進(jìn)行抗體的檢測(cè)，篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行克?。? 4)單克隆細(xì)胞亞型鑒定 利用抗體亞型鑒定試劑盒，對(duì)單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定； 結(jié)果單抗的29#亞類均為G2a，42#亞類為Gl ；. 5)單克隆抗體的大量制備 將雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔，收集腹水； 膠體金試紙條的制備 硝酸纖維素膜21mm，樣品墊24mm、金標(biāo)墊9mm、吸水紙32mm從下到上依次粘貼于PVC底板上，樣品墊壓金標(biāo)墊2mm，金標(biāo)墊壓NC膜2mm，吸水紙壓NC膜2mm;依次粘貼好后，用切紙機(jī)將組裝的試紙板切成每條寬度為4mm的試紙條，T線包被29#抗弓形蟲SAG3單克隆抗體、C線包被羊抗鼠抗體即可。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK106018817SQ201610382820
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】張西臣, 宋慧琦, 楊升, 高珺珊, 李建華, 宮鵬濤, 寇金華, 楊舉, 李 赫, 李棕松, 楊正濤, 尹繼剛
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)