一種快速檢測黃曲霉毒素b1和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙的制作方法
【專利摘要】一種快速檢測黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙，由背板、吸水板、硝酸纖維素膜、樣品吸液板、微孔試劑組成；從硝酸纖維素膜靠近樣品吸液板的那一端開始依次設置T2試驗線、T1試驗線、和一條控制線；T1試驗線和T2試驗線分別由黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被；控制線由羊抗鼠多克隆抗體包被；微孔試劑為凍干后的膠體金標記黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮單克隆抗體。本實用新型在傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙基礎上進行了改進，將膠體金標記抗體復合物直接凍干于微孔中，使得檢測過程中待測樣本與金標抗體充分反應，提高檢測靈敏度，可經(jīng)濟、快速地檢測糧食和飼料樣品中的黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮殘留。
【專利說明】
一種快速檢測黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙
技術領域
[0001]本實用新型涉及糧食和飼料中黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮快速檢測領域，尤其 是涉及一種快速檢測黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素(aflatoxin，AFT)主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒 次生代謝物。在世界不同地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了這些真菌大量存在于供人類食用的食品中，黃曲霉 毒素污染已導致嚴重的食品安全問題。黃曲霉毒素是一類毒性極強的物質，具有強致癌性 和強免疫抑制性。1993年AFT被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為I類致癌物。黃曲 霉毒素廣泛的分布于發(fā)霉的糧食及其制品中，特別是花生、花生油、玉米及其制品、乳及乳 制品，發(fā)霉的飼料中也有發(fā)現(xiàn)含有較多的黃曲霉毒素。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素至 少包含黃曲霉毒素8132、61、62、]\11、]\12等17種結構相似且特征已知的化合物。其中黃曲霉 毒素 B1是(AFTB1)是自然發(fā)生潛力最大、最為常見的一種毒素。是黃曲霉毒素中的主要成 份，其毒性和致癌性也最強。
[0003] 玉米赤霉稀酮(Zearalenone，ZEN)又稱F-2毒素，主要成分為禾谷鐮刀菌和黃色鐮 刀菌等產(chǎn)生的2,4_二羥基苯甲酸內酯類化合物。ZEN主要污染玉米、麥類、谷物等作物，具有 很強的雌性激素作用，可引起豬、大鼠、小鼠、家禽等動物的雌激素過多癥和嚴重的生殖道 癥狀及不孕癥，還具有免疫毒性、基因毒性等，對人也有雌激素作用。
[0004] 目前黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮常用的檢測方法主要有高效液相色譜法 (HPLC)、氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)和免疫分析法。由于高效液相色譜法和氣質聯(lián)用法 儀器昂貴，操作繁瑣，很難廣泛地應用到真菌毒素的檢測中。免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫 法，雖然靈敏度高，但還是存在檢測費用高、操作復雜的缺點，不適合基層單位大規(guī)模使用。
[0005] 因此，對黃曲霉毒素 B1、玉米赤酶稀酮快速檢測技術的研究迫在眉睫。對玉米赤酶 稀酬殘留的快速檢測能適時的保障糧食、伺料及其制品中的質量，將毒素超標的廣品控制 在市場之外，減少對人們的危害。因此，快速檢測技術對于掌握糧食中黃曲霉毒素 B1、玉米 赤酶烯酮的殘留情況，有效控制其殘留量，具有非?，F(xiàn)實的意義。近年來已有利用膠體金法 檢測糧食和飼料中黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮殘留的報道，但只能檢測單一品種，且靈 敏度較低。 【實用新型內容】
[0006] 針對現(xiàn)有技術存在的上述問題，本
【申請人】提供了一種快速檢測黃曲霉毒素 B1和玉 米赤霉烯酮的膠體金試紙。本實用新型在傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙基礎上進行了改進， 將膠體金標記抗體復合物直接凍干于微孔中，使得檢測過程中待測樣本與金標抗體充分反 應，提高檢測靈敏度，可經(jīng)濟、快速地檢測糧食和飼料樣品中的黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯 酮殘留。
[0007] 本實用新型的技術方案如下：
[0008] 一種快速檢測黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙，由背板（1)、吸水板 (2)、硝酸纖維素膜(3)、樣品吸液板(4)、微孔試劑(8)組成；
[0009] 所述硝酸纖維素膜(3)疊放在背板1的中部上面;所述吸水板(2)疊放在背板（1)的 其中一端的端頭部分上面，所述樣品吸液板(4)疊放在背板(1)的另一端的端頭部分上面；
[0010] 所述硝酸纖維素膜(3)兩端分別與吸水板(2)和樣品吸液板(4)相交疊，且所述硝 酸纖維素膜(3)位于吸水板(2)和樣品吸液板(4)的下方；
[0011] 從所述硝酸纖維素膜(3)靠近樣品吸液板(4)的那一端開始，依次設置T2試驗線 (6)、T1試驗線(5)、和一條控制線(7);所述T1試驗線(5)和T2試驗線(6)分別由黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮人工抗原包被;所述控制線(7)由羊抗鼠多克隆抗體包被；
[0012]所述微孔試劑(8)為凍干后的膠體金標記黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮單克隆抗 體。
[0013]所述背板（1)是PVC背板，樣品吸液板(4)是玻璃纖維材料，微孔試劑(8)的微孔是 聚苯乙烯材料。
[0014]微孔試劑(8)由凍干后的金納米棒標記黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮單克隆抗體 復合物代替。
[0015] 普通的膠體金試紙在使用時容易出現(xiàn)顯色條顯色較淺，或者暈色的問題，這是由 于吸水板(2)的吸水能力較差導致的。為了克服這一問題，在背板(1)和硝酸纖維素膜(3)之 間設置一層潤濕墊(9);所述潤濕墊(9)為3層多孔吸水布疊加而成，所述多孔吸水布上的孔 的直徑為20~40nm，每個孔的邊緣的距離均為2 5~50nm 〇
[0016]使用時稱取5g玉米、小麥、或者其他飼料樣品研磨至20目，加入0.1~0.5g鹽，加入 10~30mL 60~80 %甲醇-水溶液，振蕩2~10分鐘，于5000~lOOOOrpm離心2~5分鐘，棄沉 淀，取l〇〇yl上清液加入50~200yL純水混勻待檢。水相待測樣品，加入微孔中充分混合溶 解，樣品中若含有黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮，樣品中的黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮 將與微孔中黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮單克隆抗體-膠體金標記物發(fā)生特異性結合，插 入試紙條，由于毛細管作用樣品將沿著試紙條吸水板端移動，當移動至試驗線T1、T2時，由 于黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮單克隆抗體-膠體金標記物與樣品中黃曲霉毒素 B1或玉米 赤霉烯酮優(yōu)先結合成復合物而不能與黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮-大分子蛋白偶聯(lián)物結 合，因此顯色的膠體金不能滯留于試驗線上，試驗線處沒有色帶顯示，即只有一條控制線為 陽性。T1或T2任意一條顯色結果也判斷為陽性。相反如果樣品中沒有黃曲霉毒素 B1或玉米 赤霉烯酮，黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮金標單克隆抗體移動到試驗線上，相應的黃曲霉 毒素 B1或玉米赤霉烯酮單克隆抗體就會與黃曲霉毒素 B1或玉米赤霉烯酮-大分子蛋白偶聯(lián) 物發(fā)生特異結合，使膠體金滯留于試驗線上，即三條色帶為陰性。
[0017] 本實用新型有益的技術效果在于：
[0018] 本膠體金試紙改變了以往在樣品洗液板和硝酸纖維素膜之間設置膠體金結合墊 的方法，而是將待測樣品先放入一個微孔試劑中。這個微孔試劑是膠體金標記了待測毒素 的抗體和膠體金后凍干后得到的，冷凍干燥在低溫下進行，不會發(fā)生變性或失去生物活力。 在凍干過程中，微生物的生長和酶的作用無法進行，因此能保持原來的性狀。由于在凍結的 狀態(tài)下進行干燥，因此制品的體積、形狀幾乎不變，保持了原來的結構，不會發(fā)生濃縮現(xiàn)象。 干燥后的物質疏松多孔，呈海綿狀，加水后溶解迅速而完全，幾乎立即恢復原來的性狀。本 實用新型具有一次檢測黃曲霉毒素 B1/玉米赤霉烯酮殘留、靈敏度高、操作簡便、方便攜帶、 成本低、檢測結果可靠等特點。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本膠體金試紙的主視結構圖；
[0020] 圖2為本膠體金試紙的使用圖；
[0021 ]圖3為本膠體金試紙的陰性結果圖；
[0022] 圖4~6為本膠體金試紙的陽性結果圖；
[0023] 圖7為背板和硝酸纖維素膜之間設置一層潤濕墊；
[0024] 圖中1、背板，2、吸水板，3、硝酸纖維素膜，4、樣品吸液板，5、試驗線T1，6、試驗線 T2,7、控制線，8、微孔試劑。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖，對本實用新型進行具體描述。
[0026] 一、本快速檢測黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮膠體金試紙的組成：
[0027] 如圖1所示，本膠體金試紙由背板1、吸水板2、硝酸纖維素膜3、樣品吸液板4、微孔 試劑8組成。其中硝酸纖維素膜3疊放在背板1的中部上面。
[0028] 吸水板2疊放在背板1的其中一端的端頭部分上面，樣品吸液板4疊放在背板1的另 一端的端頭部分上面。
[0029] 硝酸纖維素膜3兩端分別與吸水板2和樣品吸液板4相交疊，且硝酸纖維素膜3位于 吸水板2和樣品吸液板4的下方。
[0030] 從硝酸纖維素膜3靠近樣品吸液板4的那一端開始，依次設置T2試驗線6、T1試驗線 5、和一條控制線(C線)7,即控制線7靠近吸水板端。
[0031]微孔試劑8為凍干后的膠體金標記黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮單克隆抗體。微 孔試劑8也可以由凍干后的金納米棒標記黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮單克隆抗體復合物 代替。
[0032]二、黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮膠體金檢測試紙的制作：
[0033] 1、免疫原合成:利用活潑酯法合成玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素 B1免疫原。
[0034] 2、黃曲霉毒素 B1/玉米赤霉烯酮單克隆抗體采用如下步驟取得：
[0035] (1)免疫動物
[0036]選擇6周齡雌性BALB/C小鼠，將抗原與福氏完全佐劑等量混合、乳化，經(jīng)腹部皮下 多點注射進行基礎免疫。分別隔4周，進行第二、三次免疫。第三次免疫后第7~10天，斷尾取 血，分離血清，用ELISA方法檢測血清效價。用生理鹽水稀釋免疫原對高效價小鼠進行連續(xù) 加強免疫。
[0037] (2)細胞融合
[0038] 將50%PEG 4000、無血清培養(yǎng)液、HAT篩選培養(yǎng)液置37°CC02培養(yǎng)箱中預熱。收獲對 數(shù)生長期的Sp2/0細胞，用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，作活細胞計數(shù)。無菌條件下分離脾細胞， 作活細胞計數(shù)。將1 X 108脾細胞與1 X 107Sp2/0細胞在50mL尖底離心管中混勻，離心棄去上 清液。將含有脾細胞和Sp2/0瘤細胞的50mL尖底離心管放于水杯中，用lmL吸管吸取0.7mL PEG 4000緩慢加入到細胞混懸液中，靜置90秒，加15mL 37°C預熱的無血清培養(yǎng)液，離心棄 去上清液，加入37°C預溫HAT培養(yǎng)液充分混勻。接種于含有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，置37 °C、5 % C02及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0039] (3)雜交瘤細胞的篩選和雜交瘤細胞的克隆
[0040] 融合5天觀察有小集落后，用HAT篩選培養(yǎng)液換液，10天后換HT培養(yǎng)液。集落長至1/ 3~1/2孔時，取培養(yǎng)上清液，用間接ELISA法檢測陽性孔。0D4 5Q值大于1時，判定為陽性孔。將 陽性孔細胞轉至24孔含有巨噬細胞的培養(yǎng)板，待集落長至1/3~1/2孔時，取培養(yǎng)上清液，用 間接ELISA法檢測特異性。檢出無交叉陽性株，進行克隆化培養(yǎng)，同時轉入培養(yǎng)瓶。
[0041]采用有限稀釋法分別對陽性的雜交瘤細胞株進行了 3次克隆，用ELISA法篩選陽性 率達到100 %的細胞株，且OD450值最高的細胞株。擴大培養(yǎng)，凍存，建立細胞株系。
[0042] (4)腹水獲得
[0043]將篩選得到的細胞株生產(chǎn)細胞復蘇后，培養(yǎng)擴增。于兩周前給小鼠腹腔注射降植 烷。然后將擴增的雜交瘤細胞接種于用降植烷處理過的BALB/C小鼠腹腔內。7~11天后小鼠 開始產(chǎn)生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，離心，棄去上層油脂，吸取淡黃色腹水，分 裝，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0044] (5)抗體的分離純化和鑒定
[0045] 純化抗體;SDS-PAGE電泳法鑒定抗體純度，抗體純度良好;ELI SA方法鑒定抗體活 性，〇D45Q值大于1，均合格;ELISA方法鑒定抗體特異性，檢測單抗只針對該毒素抗原特異，與 其它抗原不發(fā)生反應，具有較好的特異性;抗體親和力測定。
[0046] 采用上述步驟獲得黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮單克隆抗體，該抗體可用于膠體 金標記。
[0047] 3、微孔試劑的制備
[0048]把黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮單克隆抗體混合，標記膠體金液，吸附微孔上，凍 干后備用。
[0049]微孔試劑8也可以由凍干后的金納米棒標記黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉烯酮單克隆 抗體復合物代替，金納米棒的制備方法如下：
[0050] 2.5ml 2.5X104的HAuCl4溶液與2.5ml 2.5X104的CTAB溶液混合，然后加入0.6ml 的冰凍的0.01M NaBH4溶液并攪拌lOmin得到種子溶液。5ml的0.08M十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)水溶液與4ml的0.25ml的5 X 104的氯金酸水溶液混合，加入0~50微升的0.01M硝酸 銀(AgN03)溶液，攪拌均勻然后加入20微升0.1M抗壞血酸，攪拌2min得到無色透明的生長溶 液。lml種子溶液加入到9ml的生長溶液中，攪拌lmin，然后靜置一周，得到深紫藍色納米金 棒溶液。
[00511把黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮單克隆抗體標記的金納米棒液，加入微孔上，凍干 后得到金納米棒標記的微孔試劑8備用。
[0052] 4、試驗線和控制線的制備
[0053]試紙的試驗線和控制線平行于硝酸纖維素膜上。試紙的T2試驗線6、T1試驗線5和 控制線7平行于硝酸纖維素膜3上。T1試驗線5和T2試驗線6分別由黃曲霉毒素 B1和玉米赤霉 烯酮人工抗原包被。控制線7由羊抗鼠多克隆抗體包被制成。
[0054] 5、檢測試紙的組合
[0055]試紙在背板1 一端端頭為吸水板2，另一端頭為樣品吸液板4，背板中部為硝酸纖維 素膜3,硝酸纖維素膜上有三條檢測線，分別為T2試驗線6、T1試驗線5和控制線7,控制線7靠 近吸水板2端，硝酸纖維素膜3兩端分別與吸水板2和樣品吸液板4相交疊，且位于它們下方。 背板1是PVC背板，樣品吸液板4是玻璃纖維材料，微孔試劑8的微孔是聚苯乙烯材料。
[0056] 6、普通的膠體金試紙在使用時容易出現(xiàn)顯色條顯色較淺，或者暈色的問題，這是 由于吸水板2的吸水能力較差導致的。為了克服這一問題，在背板1和硝酸纖維素膜3之間設 置一層潤濕墊9;所述潤濕墊9為3層多孔吸水布疊加而成，所述多孔吸水布上的孔的直徑為 20~40nm，每個孔的邊緣的距離均為25~50nm。這一設計的原理是通過吸水布上與黃曲霉 素和膠體金的尺寸適配的空洞，多層疊加，可以很好的吸附并存留住試樣中的黃曲霉素和 膠體金，使其與試驗線6更好的接觸，從而顯色更深、更清晰。
[0057]三、使用方法
[0058] (1)使用時稱取5g玉米、小麥、飼料樣品研磨至20目，加入0.1~0.5g鹽，加入10~ 30mL 60~80 %甲醇-水溶液，振蕩2~10分鐘，于5000~lOOOOrpm離心2~5分鐘，棄沉淀，取 100yl上清液加入50~200yL純水混勻待檢。
[0059] (2)用移液槍移取40iil待檢液加入微孔試劑8后反復吹打直至金標孔中紅色固體 充分溶解混勻；插入本檢測試紙的樣品吸液端4,如圖2所示，同時開始計時；3分鐘讀取結 果，5分鐘后結果無效。
[0060]四、結果判讀
[0061 ] (1)陰性:T1、T2線色度比C線深或一樣深，表示樣品中待檢物濃度低于檢測限，或 不含待檢物，即三條色帶為陰性，如圖3所示。
[0062] (2)陽性：只有一條控制線顯色為陽性。T1或T2任意一條顯色結果也判斷為陽性， 如圖4~6所示。
[0063] (3)無效:未出現(xiàn)質控線C線顯色，表明操作過程不正確或檢測卡已失效。
[0064] 8、測試結果
[0065] 本實用新型可測出待測毒素的最低濃度如表1所示：
[0066] 表 1
【主權項】
1. 一種快速檢測黃曲霉毒素 BI和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙，其特征在于由背板（1)、 吸水板(2)、硝酸纖維素膜(3)、樣品吸液板(4)、微孔試劑(8)組成； 所述硝酸纖維素膜(3)疊放在背板1的中部上面;所述吸水板(2)疊放在背板（1)的其中 一端的端頭部分上面，所述樣品吸液板(4)疊放在背板(1)的另一端的端頭部分上面； 所述硝酸纖維素膜(3)兩端分別與吸水板(2)和樣品吸液板(4)相交疊，且所述硝酸纖 維素膜(3)位于吸水板(2)和樣品吸液板(4)的下方； 從所述硝酸纖維素膜(3)靠近樣品吸液板(4)的那一端開始，依次設置T2試驗線(6)、T1 試驗線(5)、和一條控制線（7);所述Tl試驗線(5)和Τ2試驗線(6)分別由黃曲霉毒素 BI和玉 米赤霉烯酮人工抗原包被;所述控制線(7)由羊抗鼠多克隆抗體包被； 所述微孔試劑(8)為凍干后的膠體金標記黃曲霉毒素 Bl和玉米赤霉烯酮單克隆抗體。2. 根據(jù)權利要求1所述的快速檢測測黃曲霉毒素 Bl和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙，其 特征在于所述背板（1)是PVC背板，樣品吸液板(4)是玻璃纖維材料，微孔試劑(8)的微孔是 聚苯乙烯材料。3. 根據(jù)權利要求1所述的快速檢測測黃曲霉毒素 Bl和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙，其 特征在于所述微孔試劑(8)由凍干后的金納米棒標記黃曲霉毒素 Bl和玉米赤霉烯酮單克隆 抗體復合物代替。4. 根據(jù)權利要求1所述的快速檢測測黃曲霉毒素 Bl和玉米赤霉烯酮的膠體金試紙，其 特征在于:在背板(1)和硝酸纖維素膜(3)之間設置一層潤濕墊(9);所述潤濕墊(9)為3層多 孔吸水布疊加而成，所述多孔吸水布上的孔的直徑為20~40nm，每個孔的邊緣的距離均為 25~50nm〇
【文檔編號】G01N33/558GK205506834SQ201620012472
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年1月7日
【發(fā)明人】倫麗麗, 何奚君, 蔣少華, 賈敏
【申請人】江蘇美正生物科技有限公司