專利名稱：一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法。
技術背景蔗糖等可以被正常人攝取、吸收、轉化。過量的蔗糖導致糖尿病患者血糖 上升，引起糖尿病并發(fā)癥，甚至危及到生命安全。目前糖尿病患者的數(shù)量呈逐年增加的趨勢，另外正常人過量攝取可吸收性 糖也不利于身體健康，為此具有與蔗糖口感相近，同時為非吸收性、無能量代 謝的甜味劑-天然糖的開發(fā)利用就成為今后的發(fā)展方向。甜葉菊糖苷在人體內(nèi)基 本上以原體排出，不會分解而產(chǎn)生葡萄糖，是一種極低熱量的甜味劑。隨著人 們生活水平的不斷提高，越來越傾向于使用天然植物無能量甜味劑是勢在必行。在世界上許可添加的幾大類甜味劑中， 一半來自化工合成，如糖精、甜蜜素 等；另一半來自于天然植物，如蔗糖、羅漢果糖苷等。在天然植物無能量甜味劑中甜度比較高的就有甜葉菊植物，其糖作為甜味 劑應用也是近十幾年的事，而且應用范圍越來越廣泛。由于其甜度高、無能量 等特性而被廣泛地應用于食品、保健品、藥品、化妝品、抗氧化食品、飼料添 加劑等行業(yè)。甜葉菊植物中有幾種甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(英文-. Stevioside)和450倍的RA (英文Rebaudioside A，或稱為甜葉菊A3,英文 SteviosideA3)。獲得高含量甜葉菊糖苷的品種，就可以降低工業(yè)化加工生產(chǎn)成本， 提高收率，增加效益。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法，即利 用本發(fā)明創(chuàng)建一個甜葉菊糖苷高含量的種質(zhì)資源品系。 本發(fā)明具體步驟為(1) 根據(jù)"節(jié)數(shù)平均24節(jié)，葉片大、莖桿粗壯、生長迅速、適應性強"的 原則對單林植抹進行初步篩選；(2) 將初選植抹的葉片使用直徑0.5-1.5cm打孔器打孔，避開葉片的主脈 打取1-10片，重量0.5士0.005克；將葉片破碎后，釆用下列測定糖苷的試劑組 成進行一般性測定。將200g酒石酸鉀鈉，10~30g氫氧化鈉溶于0.8L蒸餾水 中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸3 9g、結晶酚3-9g、亞硫酸鈉3 9g,先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀0.1-0.5g使其溶解，冷卻后加蒸餾水 定容至1L所得到的溶液；在上述的一般性測定數(shù)據(jù)結果中優(yōu)選出優(yōu)良單抹，優(yōu)良單抹占單抹的 0.1%~ 10%，利用高效液相色譜儀對優(yōu)良單抹葉片中的甜葉菊糖苷做進一步分析；(3) 初步獲得幾個甜葉菊糖苷含量較高的優(yōu)良植抹，以這些植株為材料進 行組織培養(yǎng)擴繁，甜葉菊再生體系的外植體為無菌苗的莖尖，培養(yǎng)基如下愈傷組織形成的培養(yǎng)基MS+6-BA0.6mg/L+NAA0.25mg/L; 不定芽分化的培養(yǎng)基MS+6-BA lmg/L +瓊脂6g/L+蔗糖30g/L; 不定芽繼代培養(yǎng)基MS +6-BA 0.5mg/L + NAA 0.05mg/L+瓊脂6g/L +蔗糖 30g/L;不定芽生根培養(yǎng)基1 /4MS + IB A 0.mg / L +NAA 0.1 mg / L; MS:植物組織培養(yǎng)中常用的完全營養(yǎng)培養(yǎng)基，6-BA: 6節(jié)基嘌呤；NAA: 萘乙酸；IBA: 丁基。票呤；(4) 將組培苗移植到大田種植，經(jīng)高效液相色諳儀檢測進一步分析；(5) 將所得的品系自交，經(jīng)過遺傳方法分析，獲得純合體植抹。 本方法的開發(fā)原理針對甜葉菊糖苷含量進行。分三次實施組織培養(yǎng)前、組織培養(yǎng)后以及收獲第一代種子。如下由于甜葉菊是異花授粉，長期以來嚴重退化，群體的形態(tài)、糖苷含量、生 長速度等明顯雜合。我們以糖苷含量6~11%的甜葉菊植物活體為材料，采用下 列測定糖苷的試劑組成進行一般性含量測定。通過測定獲得高糖苷含量的植抹； 再通過組織培養(yǎng)，獲得群體，高效液相色鐠儀檢測進一步檢驗糖苷含量，自交 獲得純合體植林，收獲種子。從該材料群體中測定植林的相同葉位做第一次單株選育，選出糖苷含量高 的單株進行組織培養(yǎng)。將組組織培養(yǎng)苗移栽定植到大田后再進行定林定葉位測 定糖苷含量，測定方法同前，作為第二次單抹選育。再進一步選出糖苷含量高 的單林進行扦插、無性繁殖；成林后進行第三次單抹選育，測定方法同前。干 葉總糖苷含量大于13%±2%，通過有性繁殖收獲種子，這是組織培養(yǎng)后的第一 代種子，從而得到甜葉菊新種質(zhì)資源品系。該甜葉菊種質(zhì)資源品系是生產(chǎn)高糖 苷含量的原料，糖苷含量從6~11%提高到13%±2%。本發(fā)明的方法可以應用如下1 )在甜葉菊栽培和遺傳育種中，以提高甜葉菊糖苷為目標的定向選育及其技術；2) 在羅漢果栽培和遺傳育種中，以提高羅漢果糖苷為目標的定向選育及其 技術；3) 在植物性藥物的開發(fā)中，該方法的選育路線同樣適用于某些植物藥用成 分的監(jiān)控與開發(fā)，以及藥用成分的富集。本發(fā)明所獲得的甜葉菊糖苷產(chǎn)量高，所培育甜葉菊糖苷高含量的種質(zhì)資源 品系由于提高了甜葉菊糖苦含量，因此作為工業(yè)化加工原材料，可以降低工業(yè) 化加工成本，^提高經(jīng)濟效益。


圖1為本發(fā)明中所涉及的兩種主要甜葉菊糖苷(St和RA)的分子結構。 圖2為本發(fā)明組織培養(yǎng)后選育出的高糖香含量甜葉菊植抹。 圖3為本發(fā)明組織培養(yǎng)后選育出的高糖苷含量甜葉菊植林的葉片形態(tài)。
具體實施方式
實施例現(xiàn)有甜葉菊種植基地所使用的栽培方法有2種①扦插育苗進行栽培；② 用種子育苗進行栽培。甜葉菊為自交不育的異花授粉作物，群體的基因組成始 終是雜合型，遺傳性不易穩(wěn)定，有利變異和有害變異同時被保留，因此我們使 用選擇有利變異優(yōu)良單株的方法。針對我國甜葉菊栽培現(xiàn)狀，依據(jù)"葉產(chǎn)量高、 總苷含量高、抗性強"的育種的目標，制定了選育優(yōu)良單抹，繁育優(yōu)良單株無性 系，選配優(yōu)良組合，繁育試驗推廣栽培的育種步驟。我們在甜葉菊不同的生長 階段，根據(jù)不同的生長性狀，選取單抹進行單林栽培和組織擴繁，對生長期各 個階段進行觀察、記載，對葉片內(nèi)含糖苷量進行測試，綜合考慮的方法選出優(yōu) 良單林。對有希望的優(yōu)良單抹，擴繁后再測試，以確保選出的優(yōu)良單抹的可靠 性。具有如下優(yōu)點① 所篩選出的品系葉內(nèi)總糖芬含量較高；② 比現(xiàn)行種植的品系生長旺盛、秸稈粗壯、葉間距短、抗性強、葉產(chǎn)量高；③ 根據(jù)甜葉菊既能有性繁殖，又能無性繁殖的特性，把選育的優(yōu)良單抹進 行無性繁殖以保持其優(yōu)良性狀，逐一形成單抹無性系，再通過單抹有性系的自 交收獲種子。具體實施過程如下① 初始糖苷含量甜葉菊以糖苷含量6 ~ 11%的甜葉菊植物群體為材料；② 取樣時間7-8月份的季節(jié)對本田內(nèi)進行單林個體取材。③ 確定群體群體在本田內(nèi)隨才幾地數(shù)出2萬林甜葉菊植物，掛牌做標記， 作為被篩選的群體；④ 確定個體從③中選出2千林明顯雜合個體，掛牌做標記，作為被篩選 測定用的個體；⑤ 確定葉位在④的每個個體植抹上，選取下位葉8-10的位置取葉片；⑥ 測定用材料取樣使用直徑為lcm的打孔器，避開葉片的主脈打取2片， 重量0.5克。將葉片置于5ml的離心管中，所使用的離心管材質(zhì)、重量等要一致；⑦ 一般性測定測定用專用i式劑；將200g酒石酸鉀鈉，10g氫氧化鈉溶于 0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸3g、結晶酚3g、亞硫酸鈉 3g,先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀0.1g使其溶解，冷卻后加蒸餾水 定容至1L所得到的溶液。測定專用試劑體積2ml于上述5ml的離心管中搖勻，100°C水浴加熱5分鐘， 取出后立即放入4。C冰箱中冷卻，之后各管在天平上加入蒸餾水約2ml，定重量 至4.0g,加蓋后混勻；比色、計算在540nm波長下，測定消光值；以濃度為橫坐標，消光值為 縱坐標作圖。比較來自每個單株個體葉片的消光值所對應的濃度，進行比較；⑧ 確定優(yōu)良單抹選育目標按照消光值大小排序，選出前20個大的數(shù)據(jù)。 因為有總數(shù)2千個單4朱個體，所以優(yōu)良單林占個體選出率的1%，占群體選出率 的0.1%,根據(jù)編號對應出優(yōu)良單4朱個體；用高效液相色譜法進一步分析4全測優(yōu) 良單林葉片內(nèi)的糖苷含量；⑨ 確定組織培養(yǎng)材料甜葉菊再生體系的最佳外植體為無菌苗的莖尖，進 行組織培養(yǎng)擴繁。取優(yōu)良單株個體的莖尖做組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基如下誘導愈傷組織形成的培養(yǎng)基MS+BA0.6mg/L+NAA0.25mg/L; 不定芽分化的培養(yǎng)基MS+6-BA(lmg/L)+瓊脂6g/L+蔗糖30g/L; 不定芽繼代培養(yǎng)基MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.05mg/L)瓊脂6g/L+蔗糖 30g/L;不定芽生根培養(yǎng)基1/4MS+IBA 0. lmg / L+NAA0.lmg / L。 組培苗培育成功后移植于大田種植，待長成大的植抹后，對來自上述20個 優(yōu)良單林個體培育出的群體葉片進行隨機取樣，用高效液相色譜法進一步分析 檢測，在比較高級的儀器上再確定總糖香含量。高效液相色語法按照國家標準 -甜葉菊糖香GB 8270-1999進行。⑩ 建立品系群體通過對上述個體的無性繁殖-扦插育苗進行栽培擴繁，擴大品系群體。在通過品系自交獲得種子，經(jīng)過遺傳方法分析，確定純合體植抹。這樣就得到了干葉總糖苷13%±2%含量的甜葉菊新種質(zhì)資源品系。該甜葉 菊種質(zhì)資源品系是生產(chǎn)高糖苷含量的原料,糖苷含量從6 11%提高到13%±2%, 從而降低工業(yè)化生產(chǎn)成本。
權利要求
1、一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法，其特征在于具體步驟為(1)對單株植株進行初步篩選；(2)將初選植株的葉片使用直徑0.5～1.5cm打孔器打孔，避開葉片的主脈打取1～10片，重量0.5±0.005克；將葉片破碎后，采用下列測定糖苷的試劑組成進行一般性測定；將200g酒石酸鉀鈉，10～30g氫氧化鈉溶于0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸3～9g、結晶酚3～9g、亞硫酸鈉3～9g，先后于溶液中溶解；最后再加入鐵氰化鉀0.1～0.5g使其溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1L所得到的溶液；在上述的一般性測定數(shù)據(jù)結果中優(yōu)選出優(yōu)良單株，優(yōu)良單株占單株的0.1％～10％，利用高效液相色譜儀對優(yōu)良單株葉片中的甜葉菊糖苷做進一步分析；(3)初步獲得幾個甜葉菊糖苷含量較高的優(yōu)良植株，以這些植株為材料進行組織培養(yǎng)擴繁；(4)將組培苗移植到大田種植，經(jīng)高效液相色譜儀檢測進一步分析；(5)將所得的品系自交，經(jīng)過遺傳方法分析，獲得純合體植株。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)進行組織培養(yǎng)擴繁 的培養(yǎng)基如下甜葉菊再生體系的外植體為無菌苗的莖尖；愈傷組織形成的培 養(yǎng)基MS+6-BA 0. 6mg/L+NAA 0. 25mg/L;甜葉菊不定芽分化的培養(yǎng)基MS+6-BA lmg/L +瓊脂6g/L+蔗糖30g/L;甜葉菊不定芽繼代培養(yǎng)基MS +6-BA 0. 5mg/L + NAA 0. 05mg/L，瓊脂6g/L +蔗糖30g/L;甜葉菊不定芽生根培養(yǎng)基1/4MS + IBA 0. lmg/L +腸0. lmg/L;上述MS:植物組織培養(yǎng)中常用的完全營養(yǎng)培養(yǎng)基，6-BA: 6千基嘌呤；NAA: 萘乙酸；IBA: 丁基噪呤。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育高含量甜葉菊糖苷遺傳材料的方法。(1)對單株植株進行初步篩選；(2)將初選植株的葉片進行一般性糖苷含量測定；優(yōu)選出優(yōu)良單株，占單株的0.1％～10％，利用高效液相色譜儀對糖苷做進一步分析；(3)初步獲得幾個糖苷含量較高的優(yōu)良植株，以這些植株為材料進行組織培養(yǎng)擴繁；(4)將組培苗移植到大田種植，經(jīng)高效液相色譜儀跟蹤檢測分析；(5)將所得的品系自交，獲得純合體植株。本方法能夠獲得甜葉菊糖苷產(chǎn)量高的植株，提高了糖苷含量，用于工業(yè)化加工，可以降低生產(chǎn)成本。
文檔編號G01N33/48GK101258834SQ20081009267
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月21日 優(yōu)先權日2008年4月21日
發(fā)明者王貴民, 董振紅, 郝再彬 申請人:桂林工學院