專利名稱：：戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及臨床體外診斷免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫測定試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：戊型肝炎病毒(h印atitisEvirus,HEV)是無包膜的單正鏈RNA病毒，經(jīng)糞口途徑傳播，引起的急性戊型肝炎(hepatitisE,HE),多表現(xiàn)為急性黃疽型肝炎，易發(fā)展為亞急性重癥肝炎或淤膽肝炎。近年來呈逐年上升趨勢。患者主要為成年人，病死率較高，尤其孕期最后3個月的妊娠婦女患病后，病死率可達IO%~39%,危害嚴重。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陸發(fā)現(xiàn)，中亞、東南亞、非洲、印度次大陸均有較大流行的報道。多數(shù)爆發(fā)流行為水源性的。食源性的報道亦見諸文獻。我國人群戊型肝炎的感染率約18%。急性散發(fā)性肝炎中戊肝約占10%,是我國乙類法定傳染病之一。在急性期血清中可測出高滴度的抗HEV-IgM,恢復期抗HEV-IgM滴度下降或消失。但取而代之的是血清中產(chǎn)生抗HEV-IgG。血清中抗-HEVlgM出現(xiàn)，是HEV急性感染和近期感染的血清學證據(jù)；具有比HEVIgG抗體更高的診斷價值，因此對戊型肝炎的早期診斷和預防有著重要意義。目前國內(nèi)常用的戊型肝炎診斷方法有免疫熒光法、免疫電子顯微鏡、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)、特異性抗體檢測法。免疫焚光法檢測肝組織中戊型肝炎病毒抗原，此方法須進行肝穿活檢；免疫電子顯微鏡檢測急性期患者的糞便及膽汁中病毒抗原或用已知患者血清中相應的抗體；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測戊型肝炎病毒核糖核酸(HEV-RNA)。戊型肝炎病毒特異性抗體酶聯(lián)免疫法檢測法是目前醫(yī)院主要的檢測方法，其測定抗HEV-IgM具有臨床意義。由于ELISA試劑方法的靈敏度不如化學發(fā)光試劑高，對HEV感染窗口期患者不能提早診斷；RT-PCR、免疫焚光法方法、免疫電子顯微鏡檢測法，操作繁瑣，穩(wěn)定性差、儀器昂貴、有局限性。鑒于此，本發(fā)明建立了一種快速、敏感、特異性、穩(wěn)定性強的化學發(fā)光酶促免疫分析方法來檢測戊型肝炎病毒抗體?，F(xiàn)在，化學發(fā)光免疫分析試劑盒多為進口封閉式全自動化學發(fā)光測量系統(tǒng)，設備昂貴，使用成本高，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明的試劑盒采用微孔板化學發(fā)光免疫分析技術，既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統(tǒng)，可實現(xiàn)大批量快檢測，使用成本低，更能適合在大、中、小醫(yī)院推廣應用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是:提供一種化學發(fā)光免疫分析測定戊型肝炎病毒IgG抗體的試劑盒。該發(fā)明試劑盒能夠簡便、快速、靈敏、設備簡單、重復性較好、無污染能穩(wěn)定地檢測戊型肝炎病毒IgM抗體，并適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應用。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品；包被固相載體；酶標記結(jié)合物；酶所作用的化學發(fā)光底物液；以及濃縮洗滌液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述包被固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒；所述酶為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶；所述化學發(fā)光底物液為1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾，其中所述1,2-二氧乙烷類衍生物為(金剛烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。本發(fā)明采用捕獲夾心法原理，利用化學發(fā)光免疫分析法測定戊型肝炎IgM抗體水平的變化。包被高純度抗人-(j鏈包被微孔板，酶標記特異性重組戊型肝炎病毒抗原。在包被板微孔中加入稀釋的待測樣本、酶標記物，溫育后形成固抗體-抗體-酶標抗原的復合物，充分洗滌后加入化學發(fā)光底物液，測定其發(fā)光強度(RLU)。根據(jù)樣本的RLU值隨抗-IgM抗體濃度的增加而升高，從而判定戊型肝炎病毒IgM抗體在人體里的變化情況。本發(fā)明的另一目提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟l)以戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性血清制配對照品戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對血清為經(jīng)HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗體測定均為陰性的多份混合血清，6(TC滅活1小時，適度稀釋配制(抗-HEVIgM抗體陽性效價〉1:500)2)以抗人-JLl鏈抗體(單抗或多抗)直接包被固相載體(微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒)用0.1MpH值為8.0的硼酸緩沖液配制成所需濃度的戊型肝炎病毒抗原包被液，并將包被液負載于固相載體上；用含O.1%酪蛋白，1°/。蔗糖，0.01%明膠，0.1%Proclin300,pH值為7.0~7.5，濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述的固相載體3)以酶標記重組戊型肝炎病毒抗原用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶偶聯(lián)重組戊型肝炎病毒抗原；4)配制酶所作用的化學發(fā)光底物液；用1，2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾配制酶所作用的化學發(fā)光底物液。5)配制濃縮洗滌液為PBST濃縮稀液。分裝上述戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品、酶標記的戊型肝炎病毒重組抗原、該酶所作用的化學發(fā)光底物及濃縮洗滌液；并組裝為成品。本發(fā)明"戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以非常專一地檢測出早期感染戊型肝炎病毒后人體中的戊型肝炎病毒IgM抗體，可以根據(jù)檢測戊型肝炎病毒IgM抗體變化，判斷治療效果及早期病情的變化根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，載體上包被的抗人-ia鏈抗體先捕獲被測樣品中特異性抗體(IgM抗體)，和加入的酶標記的重組戊型肝炎病毒特異性抗原結(jié)合，形成抗原抗體復合物，因此本發(fā)明采用的"捕獲夾心法"反應模式，既有效地利用了化學發(fā)光技術原理，又確保了檢測的靈敏度。另外，這種反應模式還便于操作。本發(fā)明的試劑盒應用的是酶催化發(fā)光底物，通過檢測發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物，因而具有比酶免疫分析特異性好，靈敏度高的特點；可為戊型肝炎病毒IgM抗體的診斷提供更為特異、快速、可靠的依據(jù)。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質(zhì)量鑒定，包括抗原標記物與包被抗體的活性、栽體(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩沖液和保護液，通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使抗原標記物長期保持活性穩(wěn)定的稀釋液。一、辣根過氧化物酶偶聯(lián)重組戊型肝炎病毒抗原制備重組戊型肝炎病毒抗原用二馬來酰亞胺(Dimaleimide)偶聯(lián)辣根過氧化物酶。具體操作如下將抗lgG抗體溶于0.1Mol/LPH5.0醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜，離心除去不溶性物質(zhì)，抗IgG(14mg/2ml)與10mloc-巰基乙胺在37。C溫育90min。過Sephadex后濃縮使每ml含3.Omg左右的還原抗IgG。在O'C中，按1:1滴加飽和N,、N'-O-苯二馬來酰亞胺溶液，混合，于3(TC溫育20min,過S印hadexG25柱，除去未反應的二馬來酰亞胺。收集二馬來酰亞胺"活化"的抗IgG,濃縮使?jié)舛葹镺D28。nm=l.0(光徑lcm),取lml溶液加20ju1(5mg/ml)辣根過氧化物酶，置30。C20min,用0.10Mol/LNaOH中和后，于4'C置24h-72h，再過Sepharose-6B柱(1.5x40cm),以pH7.OPBS洗脫，收集酶結(jié)合物，加疊氮鈉(NaN3)防腐，4'C保存?zhèn)溆?。酶標記重組戊型肝炎病毒抗原濃度選定基于1000ml酶標抗原稀釋液組份含量為2.9gNa2HP0412H20、0.3gNaH2P04.2H20、9gNaCl、25gBSA、lmlProclin300、lmlTween—20。將酶標記抗原結(jié)合物稀釋不同的稀釋度，采用方陣滴定法確定酶標抗原的工作濃度為1:6000二、戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照的制備混合6份以上經(jīng)ELISA試劑盒檢測戊型肝炎病毒IgM抗體陽性血清或陰性血清，經(jīng)抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗體陰性血清，60。C滅活1小時，適度稀釋配制(抗-HEVIgM抗體陽性效價〉l:500)，過濾除菌、分裝，低溫凍存。三、固相包被板的制備包被基于1000ml包被液組份含量為2.86g硼砂、4.33g硼酸，稱取所需組份量放入潔凈容器中雙蒸水溶解混勻后，調(diào)整至PH8.0,定溶1000ml。加入適量抗人-p鏈抗體混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔100uL,4'C過夜。包被微孔板為48或96孔的微孔板條。封閉每孔分別加入封閉液150j^L，4'C放置24小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。立即進行真空封袋。封袋后放置15分鐘檢查無漏氣，如果有漏氣需重新封袋。貼簽后置2-8。C保存?；?000ml封閉液組份含量為0.2gNaH2P04'2H20、2.9gNa2HP04.12H20、lg酪蛋白、10g蔗糖、0.lg明膠，lmlProclin300。稱量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.0~7.5,定容1000ml。四、化學發(fā)光底物A液基于1000mlA液組份含量為10mM魯米諾1.7716g、0.3mM4-羥基聯(lián)苯0.051g、0.05mM4-石典苯硼酸0.012g、硼酸11.4g、硼砂4.9g。稱量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為8.0~10.0,定容1000ml。五、化學發(fā)光底物B液基于1000mlA液組份含量為:3.5raM過氧化脲0.329g、lml0.l%Tween20、51.58gNa肌.12H20、8.74gNaH2P04.2H20、稱量好各組份量力丈入潔凈容器中,加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.0-7,6,定容1000ml。稱量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為8.0~10.0,定容1000ml。使用時A液與B液等比例混合。六、20倍洗滌液基于1000ml20倍洗滌液各組份含量為58gNa2HP04.12H20、2gNaH2P04.2H20、160gNaCl、lmLTween-20、lmLProclin300。稱量好各組份量放入潔凈容器中，加雙蒸水，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.2~7.4，定容1000ml。七、半成品及成品纟且成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。半成品經(jīng)特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成戊型肝炎病毒IgM抗體測定試劑盒(化學發(fā)光法)成品。組裝成成品試劑盒再經(jīng)特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格后方能應用。本發(fā)明的發(fā)明人通過對試劑盒的反應模式和反應條件進行的實驗研究，最終確定了捕獲法夾心反應模式，并就不同的反應時間對實驗結(jié)果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。通過對化學發(fā)光底物液發(fā)光持續(xù)時間的測定及不同發(fā)光時間對測定值的影響實-瞼表明在加入化學發(fā)光底物液后5-25分鐘之間進行測量為最佳，其結(jié)果也較為準確。實施例2~3制備本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以堿性磷酸酶標記戊型肝炎病毒重組抗原、以AMPPD作為化學發(fā)光底物、以塑料珠、塑料管作為栽體、包被液的pH值為4.5、封閉液的pH值為7.5夕卜，其余均以與實施例1相同的方法制備戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例4制備本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒除以磁性顆粒作為載體，用戊二醛偶聯(lián)法制備磁顆?？谷?m鏈抗體固相載體外，其余均以與實施例1相同的方法制備戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒。實施例5本發(fā)明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒的具體操作如下1)自4'C冰箱中取出試劑盒，室溫平衡15分鐘。血清樣本用生理鹽水l:1000稀釋備用。2)取出包被板條，插入板架上。3)除空白孔外，反應孔中分別加陰、陽對照品各兩孔，每孔50ul,各孔加稀釋后的待檢樣本50ul，然后每孔加酶結(jié)合物50)aL，用微量震蕩器充分振蕩混勻，37。C溫育1小時。4)甩去反應液，每孔加滿稀釋后的洗涂液，洗板5次，最后在干凈的吸水紙上扣干。5)各孔加化學發(fā)光底物液A、B各50pL,用微量震蕩器充分振蕩混合均勻，室溫(20~25。C)避光反應5分鐘。6)必須于加化學發(fā)光底物液后的第5~25分鐘內(nèi)測量，在化學發(fā)光測量儀上依序測量各孔的發(fā)光強度(RLU)，測量時間1秒/孔。9)CO值=2.1^，RLU值>CO值則樣本判定為陽性樣本；RLU值<CO值則樣本判定為陰性樣本。實施例6本發(fā)明的試劑盒的方法學鑒定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，見下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>說明"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"的靈敏度、特異性、精密性以及穩(wěn)定性完全符合檢定要求。本發(fā)明試劑盒各項指標均達到或高于ELISA試劑的檢測指標。實施例7本發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒的臨床應用與ELISA試劑盒比較臨床醫(yī)院使用實施例1的戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒和ELISA試劑盒檢測臨床樣本662份，以對比兩種試劑盒檢測的符合率。一、臨床血清標本的來源醫(yī)院臨床收集戊型肝炎病毒患者、非戊型肝炎病毒患者樣本及正常人血清標本。二、使用戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒與ELISA試劑盒比較一1、方法臨床分別使用本發(fā)明實施例1制備的"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗_HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"(按其說明書操作)和ELISA試劑盒(按其說明書操作)檢測臨床樣本662份(急性戊肝55例、戊肝IgG抗體陽性38例、健康人421例、類風濕因子陽性血樣42例、乙型肝炎陽性62例、曱型肝炎IgM抗體陽性43例)，以對比兩種試劑盒檢測的符合率。2、結(jié)果臨床醫(yī)院使用實施例1的"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"和ELISA試劑盒對比檢測結(jié)果(見表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>備注發(fā)明試劑檢出1例抗-HEVIgG血清樣，抗-HEVIgM陽性；確認為抗-HEVIgM陽性對比試劑檢出1例抗-HAVIgM血清樣，抗-HEVIgM陽性；確認為假陽性對比試劑檢出1例急性戊肝血清樣，抗-HEVIgM陰性；確認為假陰性臨床醫(yī)院使用"戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光法免疫分析測定試劑盒"與ELISA試劑盒對比檢測結(jié)果表明本發(fā)明試劑盒的各項指標均達到或超過了ELISA法，且該試劑盒的特異性100%,敏感性100°/。；臨床試驗中的1例抗-HEVIgG陽性血清樣本，本發(fā)明試劑檢出抗-HEVIgM陽性；1例急性HEV樣本血清ELISA試劑檢測抗—HEVIgM陰性、l例抗—HAVIgM血清標本ELISA試劑檢出陽性。3份血清樣經(jīng)臨床試驗確認，l例抗-HEVIgG陽性血清樣本結(jié)果為陽性，是屬于急性感染后期患者；1例急性HEV樣本血清臨床結(jié)果是陽性，ELISA試劑結(jié)果是灰區(qū)標本；1例抗-HAVIgM血清標本臨床結(jié)果是陰性。本試劑盒與類風濕因子陽性血清、乙肝陽性血清、曱肝IgM陽性血清無交叉反應。發(fā)明的戊型肝炎病毒IgM抗體(抗-HAVIgM)化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒特異性、靈敏性、穩(wěn)定性均高于ELISA試劑盒，可以推廣應用于臨床戊型肝炎疾病診斷。權利要求1、一種戊型肝炎病毒IgM抗體化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，本發(fā)明試劑盒包括戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品；包被固相載體；酶標記結(jié)合物；所述酶所作用的化學發(fā)光底物液；以及濃縮洗滌液。2、如權利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述包被固相載體為抗人-u鏈抗體(單抗或多抗)包被的微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。3、如權利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述酶標記結(jié)合物為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的戊型肝炎病毒重組抗原。4、如權利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾。5、如權利要求1所述本發(fā)明試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物包括A液和B液，其中，所述化學發(fā)光底物A液，包括10mM魯米諾、0.3mM4-羥基聯(lián)苯、0.05mM4-硪代苯基硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所述化學發(fā)光底物B液，包括3.5mM過氧化脲、0.l%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0-7.6。6、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟以戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性血清制備對照品；以抗人-jj鏈抗體(單抗或多抗)直接包被固相載體；以酶標記重組戊型肝炎病毒抗原；配制酶所作用的化學發(fā)光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝上述戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性對照品、酶標記的戊型肝炎病毒重組抗原、該酶所作用的化學發(fā)光底物液及濃縮洗滌液；以及組裝為成品。7、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相載體的步驟2)采用以下方法制備用0.1MpH值為8.0的硼酸緩沖液配制成所需濃度的抗人-p鏈抗體，并將包被液負載于固相載體上；用含0.1%酪蛋白，1%蔗糖，0.01%明膠，0.1%Proclin300,pH值為7.0-7.5,濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液作為封閉液封閉上述的固相載體。8、如權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包被抗人-n鏈抗體(單抗或多抗)的固相載體為微孔板、塑料珠、塑料管或磁性顆粒。9、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述標記酶為辣根過氧化物酶或石咸性》舞酸酶。10、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物為1,2-二氧乙烷類衍生物、魯米諾或異魯米諾；所述l,2-二氧乙烷類衍生物，為(金剛烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,.2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本發(fā)明屬于臨床體外診斷免疫分析
技術領域：
，涉及一種化學發(fā)光法免疫分析測定戊型肝炎病毒IgM抗體的劑盒及其制備方法，本發(fā)明試劑盒制備方法包括以下步驟以戊型肝炎病毒IgM抗體陰、陽性血清制備對照品；以抗人-μ鏈抗體(單抗或多抗)包被固相載體；以酶標記戊型肝炎病毒重組抗原；配制酶所作用的化學發(fā)光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝上述戊型肝炎病毒IgM抗體的陰、陽性對照品、標記結(jié)合物、化學發(fā)光底物及濃縮洗滌液；及組裝為成品。本發(fā)明制備試劑盒的性能指標(特異性、靈敏度、穩(wěn)定性)穩(wěn)定，可應用于戊型肝炎早期診斷。文檔編號G01N33/543GK101551395SQ20081010326公開日2009年10月7日申請日期2008年4月2日優(yōu)先權日2008年4月2日發(fā)明者于尚永,宋勝利,應希堂,楊俊峰,胡國茂,鄭金來申請人:北京科美東雅生物技術有限公司