專利名稱：：一種可視化結(jié)核抗體檢測蛋白芯片、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片，具體涉及一種多耙點結(jié)核抗體檢測的蛋白芯片，還涉及該芯片的制備方法及醫(yī)療用途。
背景技術(shù)：
：近年來，結(jié)核病死灰復(fù)燃，全球大約l/3的人口感染結(jié)核桿菌，每年死于結(jié)核病的人數(shù)約300萬人。我國第四次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)査報告顯示，我國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者451萬，菌陽肺結(jié)核患者196萬。而且近年來我國結(jié)核病感染人數(shù)呈逐漸上升趨勢，其數(shù)量居傳染病首位。因此，結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療顯得尤為重要。傳統(tǒng)的細菌學診斷技術(shù)是結(jié)核病診斷的"金標準"，被沿用至今，但由于它存在檢測耗時長、敏感性低、特異性較差等缺點，一直難以滿足臨床診斷的需要。血清學免疫診斷技術(shù)由于其操作簡便、快速、穩(wěn)定性好等固有優(yōu)勢，仍然是結(jié)核病輔助診斷的重要工具。然而，目前結(jié)核抗體檢測試劑在特異性和敏感性方面仍存在一些問題，主要原因是所采用的抗原不能滿足高特異敏感性診斷試劑的要求。在先前的研究中，我們克隆表達了七種特異性強并具有互補性的結(jié)核桿菌抗原(38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和MtM6.3)，在本研究中我們進一步通過生物信息學軟件分析篩選優(yōu)勢表位，并成功克隆表達了優(yōu)勢表位抗原。利用這些優(yōu)勢表位抗原研制成檢測結(jié)核抗體的可視化抗體檢測蛋白芯片。該方法與傳統(tǒng)痰涂片和痰菌培養(yǎng)方法相比，大大提高了結(jié)核病檢測的敏感性和特異性，有望用于結(jié)核病輔助診斷。38kD抗原是一種脂蛋白和主要免疫原，是目前最為常用的結(jié)核病診斷抗原之一。WHKinson報道用38kD抗原檢測肺結(jié)核病人血液，敏感性與特異性分別為65.6%和95.8%(JClinMicrobiol,35(3):553國557(1997))。早期分泌性抗原性耙(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)是結(jié)核病免疫診斷中兩個很有前途的抗原，具有較強的細胞免疫活性，在抗結(jié)核感染的免疫回憶應(yīng)答中起重要作用。這兩個抗原均由RD1區(qū)編碼，該區(qū)只存在于致病性結(jié)核桿菌基因組中，所有BCG菌株基因組中均缺乏該區(qū)域。聯(lián)合應(yīng)用ESAT-6和CFP10診斷結(jié)核病發(fā)現(xiàn)混合抗原敏感性較單抗原增加，而不降低其特異性。所以，ESAT-6和CFP10可有望成為診斷動物和人致病性結(jié)核桿菌感染的特異性抗原。MPT64是結(jié)核桿菌生長最早分泌的主要蛋白，僅在結(jié)核桿菌及牛型桿菌中存在。雖然Lyashchenko等的研究結(jié)果表明，以MPT64蛋白作為抗原檢測抗結(jié)核抗體的陽性率在各種結(jié)核桿菌分泌性蛋白中是較低的，但如果與其它蛋白形成融合蛋白則有可能具有較好的穩(wěn)定性(ClinDiagnLabImmunol,7(2):155-160(2000))。因此，MPT64蛋白有希望成為結(jié)核病血液學診斷的組合抗原的候選者之一。Mtb8.4(Rvll74c)、Mtb8(Rv0379)和Mtbl6.3(Rv2185c)廣泛存在于結(jié)核桿菌中，其在結(jié)核病診斷方面的意義仍然不清楚。Mtb8.4是新近從結(jié)合桿菌培養(yǎng)物濾液中純化分離得到的一種的低分子量蛋白抗原，Coler等學者的研究更進一歩揭示Mtb8.4是患有潛伏結(jié)合桿菌感染的個體中重要的免疫活性T細胞抗原，在確定致病性結(jié)合桿菌感染中具有重要作用(JImmunol.,161:2356-2364(1998))。Mtb8可能是轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，僅在Houghton的研究中將Mtb8與其它幾種抗原(Mtbll、Mtb48、38kD等)組成融合抗原用于檢測結(jié)核病，表明Mtb8與其它幾種抗原一起有可能增強38kD抗原的反應(yīng)活性(ClinDiagnoLabImmun，9(4):883-89I(2002))。而MtM6.3是一種未知功能蛋白質(zhì)，有研究表明Mtbl6.3與Mtb9.7組合有助于提高對與HIV混合感染的結(jié)核病患者的檢出率。不同結(jié)核桿菌抗原檢測同一病人血液，其反應(yīng)性有所不同，而且各抗原之間存在一定的互補性。其原因可能在于結(jié)核桿菌抗原多而復(fù)雜，在宿主體內(nèi)表達的數(shù)量、種類或時機可能隨病人的個體免疫背景和病程而異，表現(xiàn)出不同的抗體譜。因此，將多種抗原制備成蛋白芯片，聯(lián)合檢測可以在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高檢測敏感性，是研制高特異性和高敏感性診斷試劑的發(fā)展方向。王海波等應(yīng)用3種結(jié)核抗原建立結(jié)核桿菌抗體檢測蛋白芯片，并與ELISA進行比較，敏感性和特異性分別為69.9%和84.9%。我們將結(jié)核桿菌7種優(yōu)勢表位抗原制備成多靶點蛋白芯片，建立的免疫金銀可視化抗體檢測蛋白芯片檢測結(jié)核病人血液樣品技術(shù)，該技術(shù)簡便易行、敏感性高、特異性強。我們初步結(jié)果分析，本結(jié)核桿菌可視化抗體檢測蛋白芯片與痰涂片檢測方法相比，敏感性為98.5%，顯著高于痰涂片檢測方法的敏感性35.4%;與痰菌培養(yǎng)檢測方法相比，敏感性為96.6%，顯著高于痰菌培養(yǎng)檢測方法的敏感性48.3%。其原因可能在于兩方面，一方面是我們選用了七種結(jié)核桿菌抗原，抗原之間存在互補性，有助于提高檢出率；另一方面，免疫金銀染色可視化蛋白芯片檢測技術(shù)基本原理是利用銀顯影液和膠體金顆粒的催化作用，理論上只要有2個金原子存在便可以有效催化銀的氧化還原反應(yīng)，具有很強的信號放大效應(yīng)。因此，本可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片可以用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，提高痰涂片和痰菌培養(yǎng)陰性患者的檢出率。此外，由于本研究采用結(jié)核桿菌特異的優(yōu)勢表位抗原，在一定程度上保證了檢測的特異性。通過對獻血員血液樣本的檢測，計算本可視化多耙點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片的特異性為93.3%，也證明可以滿足臨床需求。生物芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，是融微電子學、生物學、物理學、化學、計算機科學為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。蛋白芯片是用于蛋白質(zhì)功能研究及其相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機械點樣或共價結(jié)合等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于基片形成分子點陣。利用生物分子與蛋白芯片的探針分子發(fā)生雜交或相互作用，檢測和分析蛋白質(zhì)的一項技術(shù)。目前對蛋白芯片反應(yīng)信號的檢測主要有熒光法、酶顯色法和免疫金一銀顯色法。熒光法是蛋白芯片通常采用的信號檢測系統(tǒng)，主要利用激光共聚焦掃描儀對雜交信號進行高通量檢測和分析，具有自動化程度高、靈敏度高的特點，但需要購買昂貴的芯片掃描儀和專業(yè)人員，無法在基層醫(yī)療單位推廣。酶顯色法主要利用標記的辣根酶或者其他生化酶與特定的顯色液相互作用，根據(jù)芯片矩陣的顏色變化對反應(yīng)結(jié)果進行分析的過程，但靈敏度和特異性低。免疫金一銀顯色法主要利用膠體金進行蛋白質(zhì)標記并通過銀進行直接顯色，該方法既具有高的靈敏度和特異性，同時又無需增添設(shè)備，是可視化芯片的重要模式，具有廣泛的應(yīng)用潛力和前景。但目前國內(nèi)外尚無應(yīng)用可視化免疫金銀蛋白芯片檢測結(jié)核病的相關(guān)報道。
發(fā)明內(nèi)容為了解決目前結(jié)核病檢測檢出率低、特異性差的缺點，本發(fā)明提供了一種利用克隆表達的七種結(jié)核桿菌特異優(yōu)勢表位抗原，制備可視化多耙點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片的制備方法及用途。本發(fā)明的蛋白芯片采用免疫金銀檢測系統(tǒng)顯色芯片。為了實現(xiàn)多靶點結(jié)核抗體的高效平行檢測的目的，本發(fā)明通過對蛋白芯片領(lǐng)域的深入研究，提出了一種用于檢測結(jié)核抗體，采用的多耙點可視化蛋白芯片技術(shù)，同時檢測結(jié)核患者血清中多種抗體，從而建立可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片。本發(fā)明的可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片，不同于以往的結(jié)核抗體檢測芯片，是建立在七種特異的結(jié)核桿菌特異表位抗原基礎(chǔ)上的結(jié)核抗體多靶點蛋白芯片，并利用"膠體金一銀染"顯色系統(tǒng)達到芯片檢測結(jié)果可視化目的。本發(fā)明提供的蛋白芯片，僅用1滴樣本就可以檢測到血清與7個多個靶點抗原的反應(yīng)情況，實現(xiàn)了檢測的高通量、平行性和高效性。為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人設(shè)計了由7個多靶點結(jié)核抗原組成的矩陣，每個矩陣上點有7種結(jié)核桿菌抗原，每種抗原設(shè)2個平行點。陰性對照點為抗原空白對照和pBVILl空載體，陽性對照點為人IgG。采用點接觸法將7種結(jié)核抗原固定于芯片基片上，與結(jié)核并患者血清相互作用，采用"膠體金一銀染"使芯片顯色，通過結(jié)果判斷，研究結(jié)核患者血清與各個靶點抗原的反應(yīng)情況，統(tǒng)計患者血清中結(jié)核抗體反應(yīng)性，并分析其臨床意義。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的首先制備結(jié)核表位抗原，利用分子生物學方法進行制備，將制備的結(jié)核抗原純化后進行預(yù)處理，采用點接觸法制備結(jié)核抗體多靶點檢測芯片，封閉并干燥，獲得本發(fā)明的蛋白芯片。在使用該芯片進行結(jié)核抗體檢測時，將結(jié)核病患者血清與芯片進行反應(yīng)，漂洗后采用膠體金標記蛋白反應(yīng)，用硝酸銀溶液顯色，可以目視或用普通圖像掃描儀記錄結(jié)果，分析其臨床意義。本發(fā)明可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片可以對患者血清中7種抗結(jié)核桿菌抗體進行檢測，結(jié)果顯示，與痰涂片和痰菌培養(yǎng)檢測方法的敏感性相比，可視化多耙點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片敏感性分別為98.5%和96.6%,特異性為93.3%，顯著高于現(xiàn)有金標準檢測方法。所制備的可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，大大提高痰涂片和痰菌培養(yǎng)陰性患者的檢出率與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點1.本發(fā)明建立在可視化蛋白芯片檢測技術(shù)基礎(chǔ)上本發(fā)明所涉及的結(jié)核桿菌特異優(yōu)勢表位抗原共有7種，采用蛋白芯片法可通過一次加樣就能達到檢測患者血清中7種抗體反應(yīng)程度，檢測效率遠高于現(xiàn)有的酶聯(lián)檢測技術(shù)和金標試劑，采用"膠體金一銀染"可實現(xiàn)蛋白芯片檢測結(jié)果的可視化，無需購買昂貴的芯片掃描儀，適合臨床推廣。2.本發(fā)明具有一定的臨床意義。本發(fā)明所采用的多靶點抗原是具有結(jié)核桿菌特異的表位，它集中了目前大部分檢測用抗原。7種抗體具有各自的臨床意義，與臨床研宄關(guān)系密切。圖1純化后結(jié)核桿菌特異表位抗原的SDS-PAGE分析，其中1.ESAT-6;2.CFP10;3.38kD;4.Mtb8;5.Mtb8.4;6.Mtbl6.3;7.MPT64;M.低分子量蛋白標準。圖2可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片反應(yīng)矩陣設(shè)計圖，其中l(wèi)a和lb為ESAT-6抗原；2a和2b為Mtb8抗原；3a和3b為Mtb8.4抗原；4a和4b為CFP10抗原；5a和5b為Mtbl6,3抗原；6a和6b為38kD抗原；lc和ld為MPT64抗原；2c、2d、3c和3d為ILl陰性對照；4c、4d、5c和5d為pBVILl空載體陰性對照；6c和6d為IgG陽性對照。圖3可視化多耙點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片檢測結(jié)果及判定，其中A為85729號TB患者血清樣本，判定為陽性；B為85518號TB患者血清樣本，判定為可疑；C為1號Donor血清樣本，判定為陰性。具體實施例方式實施例1可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片反應(yīng)矩陣設(shè)計和芯片制備一、材料原核表達載體pBVILI由本室構(gòu)建。結(jié)核桿菌7種特異抗原基因質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存。實驗所需PyrobestDNA聚合酶和TaqDNA聚合酶為TaKaRa公司產(chǎn)品，DNA限制性內(nèi)切酶SalI、XhoI和XbaI，以及T4DNA連接酶均購自Promega公司。陰離子交換柱Q-SepharoseFF和凝膠過濾柱SephardexG-50購自于PharmaciaBiotech公司，脲、蔗糖購自于北京化學試劑公司，溶菌酶、BSA購自于Promega公司，修飾的玻璃基片由深圳益盛堂公司提供。二、方法結(jié)果1.結(jié)核桿菌7種特異表位抗原的制備根據(jù)特異表位抗原肽段的核苷酸序列設(shè)計合成上下游引物，所使用的限制性內(nèi)切酶分別為Bom/n和J^oI。用于擴增特異表位抗原肽段38kD的引物序列如下38kD-F:5，-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3'38kD-R:5，-GCTCGAGGCTGGAAATCGTCGCGA-3，用于擴增特異表位抗原肽段ESAT6的引物序列如下ESAT6-F:5，-GGGATCCCATTCCCTCCTTGACGA畫3'ESAT6-R:5，-GCTCGAGGTTCAGCTCGGTAGCCGT-3，用于擴增特異表位抗原肽段CFP10的引物序列如下CFP10-F:5，-CGGATCCGAAGCAGCCAATAAGCAG陽3，CFP10-R:5，-GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3，用于擴增特異表位抗原肽段MPT64的引物序列如下MPT64-F:5，-GGGATCCCCCAAGACCTACTGCGA國3，MPT64畫R:5'-GCTCGAGCGGCGCTATCGATACCT-3，用于擴增特異表位抗原肽段Mtb8的引物序列如下Mtb8畫F:5，-GGGATCCACCAGCCCCACATCCT-3'Mtb8國R:5，國GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA國3，用于擴增特異表位抗原肽段Mtb8.4的引物序列如下Mtb8.4-F:5，-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3'Mtb8.4-R:5,-GCTCGAGTTGCGCGGCCATGGCA-3'用于擴增特異表位抗原肽段Mtb16.3的引物序列如下Mtb16.3-F:5，-GGGATCCCGGACAAGACGACACAGA-3，Mtb16.3畫R:5，-GCTCGAGGCCCTCGACTCGTTTCTT-3'以結(jié)核桿菌7種特異抗原基因質(zhì)粒為模板，分別擴增了38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特異表位抗原肽段的基因片段。PCR擴增條件如下預(yù)變性95i:2分鐘，變性94。C30秒；復(fù)性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(隨基因長度不同而不同)，擴增32個循環(huán)，再72。C延伸7分鐘。PCR擴增所得的片段通過電泳鑒定，表明均得到相應(yīng)大小的基因片段。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切并連接入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pBVILl載體，測序由利嘉富誠生物技術(shù)有限公司完成。用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a，熱誘導(dǎo)表達，收集菌體，將沉淀稱濕重，用10倍體積的20mmol/LpH8.0TE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。8°C，1,2000rpm，離心20分鐘，棄上清，沉淀用lmol/LNaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1%3-巰基乙醇。再于20。C1,2000rpm離心IO分鐘，去沉淀取上清。將上述溶解的包涵體溶液過Q-SepharoseFF陰離子交換柱，用平衡液(pH8.0,20mmol/LTE含6mol/L脲，0.1%0-巰基乙醇)清洗后，用不同濃度的NaCl(用平衡液配制)洗脫，收集各洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，收集0.05mol/LNaCl洗脫峰。再過SephardexG-50凝膠過濾10柱，收集第一洗脫峰。純化的抗原進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明獲得了純度較高的特異表位抗原肽段(圖l)。2.可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片反應(yīng)矩陣的設(shè)計設(shè)計了由7中結(jié)核桿菌特異表位抗原組成的反應(yīng)矩陣，每個矩陣上點有7種結(jié)核桿菌抗原、IL1陰性對照、pBVILl空載體陰性對照和IgG陽性對照，每種抗原設(shè)2個平行點。圖2為可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片反應(yīng)矩陣設(shè)計圖模式圖，其中l(wèi)a和lb為ESAT-6抗原；2a和2b為Mtb8抗原；3a和3b為Mtb8.4抗原；4a和4b為CFP10抗原；5a和5b為Mtbl6.3抗原；6a和6b為38kD抗原；lc和ld為MPT64抗原；2c、2d、3c和3d為IL1陰性對照；4c、4d、5c和5d為pBVILl空載體陰性對照；6c和6d為IgG陽性對照。3.可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片的制備運用點接觸法進行點樣，每點點樣量為1nL，抗原濃度為lmg/mL，0.01mol/LPBS(pH=7.4)溶解稀釋抗原。點樣后將芯片室溫放置4h，封閉液O.lmol/LPBS(1%BSA,pH=7.4)封閉2小時，以封閉基片表面未結(jié)合的空白位點。用濾紙將微陣列周圍的液體吸干后干燥，4t:保存?zhèn)溆?。實施?結(jié)核病患者和正常獻血員血液樣品抗體的檢測及信號采集一、材料膠體金標記蛋白A、對苯二酚檸檬酸鈉、檸檬酸、硝酸銀購自北京化學試劑公司。二、方法結(jié)果1.膠體金制備采用檸檬酸三鈉還原法制備成15nm粒徑膠體金溶液，取1%四氯化金lml加入99ml去離子水稀釋成濃度為0.01%,取100ml0.01%四氯化金水溶液加熱至沸騰，迅速加入1%檸檬酸三鈉1.0ml，煮沸約5分鐘后出現(xiàn)透明橙紅色時停止加熱，待冷卻后加入去離子水補充至原體積。制備好的膠體金溶液應(yīng)為透明橙紅色，無沉淀。電鏡下觀察無聚集，分散均勻，測定其平均直徑為15nm。合格的膠體金溶液4t:保存?zhèn)溆谩?.膠體金標記A蛋白探針制備用去離子水配制0.1M碳酸鉀和3%的聚乙二醇(分子量20,000)。首先用(UM碳酸鉀調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至6.0，按膠體金溶液與A蛋白的最佳比例(一般按lml膠體金溶液標記10ligA蛋白)。室溫攪拌15分鐘后，加入3%的PEG使其終濃度為0.05%，繼續(xù)充分攪拌混勻15分鐘，室溫靜置30分鐘，4°C14000rpm離心45分鐘，沉淀用含0.01MPBS(1%BSA、0.2%疊氮鈉，pH7.2-7.4)溶解，再次4"14000rpm離心45分鐘，沉淀加入初始體積1/10的0.01MPBS(1%BSA、0.2%疊氮鈉，pH7.2-7.4)緩沖液溶解，0.22um硝酸纖維素膜除菌過濾后，4-C保存?zhèn)溆谩?.結(jié)核病患者和正常獻血員血液樣品抗體的檢測及信號采集分別將結(jié)核病患者和正常獻血員血液樣品1:10稀釋，每矩陣30PL，與芯片室溫孵育lh。用PBST洗滌5次，加入膠體金標記A蛋白探針，每矩陣30uL室溫孵育30分鐘，洗滌5次后，再用雙蒸水洗滌2次。加入新鮮配制的銀顯影A液20uL，B液20yL，輕輕振蕩，避光作用10分鐘。用雙蒸水洗滌后涼干。目視或使用CanonLiDE20掃描儀分析各點的顯色強度。結(jié)果判斷原則7種抗原中任何2種或2種以上抗原陽性均判定為陽性，僅1種抗原陽性判定為可疑，7種抗原均為陰性判定為陰性(圖3)。實施例3可視化多耙點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片臨床應(yīng)用一、材料實施例2所研制的可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片。臨床結(jié)核病患者陽性血液樣本和正常獻血員血液樣本。二、方法結(jié)果用所研制的可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片檢測結(jié)核病患者和獻血員的血液樣品，按照結(jié)果判定原則判定陰性或陽性結(jié)果，并與痰涂片和痰菌培養(yǎng)結(jié)果進行比較，結(jié)果見表l。在48例臨床確診結(jié)核病人中，痰涂片陽性17例，陰性31例，敏感性為35.4%。而可視化抗體檢測蛋白芯片檢測陽性47例，可疑1例，敏感性為98.5%。其中痰涂片17例陽性樣品，可視化抗體檢測蛋白芯片也均為陽性；而在痰涂片31例陰性樣品中，可視化抗體檢測蛋白芯片檢測29份陽性，2份可疑，見表2。在29例臨床確診結(jié)核病人中，痰菌培養(yǎng)陽性14例，陰性15例，敏感性48.3%。而可視化抗體檢測蛋白芯片檢測陽性28例，l例可疑，敏感性96.6%。其中痰菌培養(yǎng)14例陽性樣品，可視化抗體檢測蛋白芯片也均為陽性；而在痰菌培養(yǎng)15例陰性樣品中，可視化抗體檢測蛋白芯片檢測14例陽性，l例可疑，見表3。30份獻血員樣品中可視化抗體檢測蛋白芯片檢測出l例陽性，l例可疑。特異性為93.3%。表1可視化多耙點結(jié)核抗體蛋白芯片檢測結(jié)核病患者和獻血員血液樣品與痰涂片和痰菌培養(yǎng)結(jié)果的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>ND:nodetection表2結(jié)核桿菌可視化抗體檢測蛋白芯片與痰涂片檢測結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3結(jié)核桿菌可視化抗體檢測蛋白芯片與痰菌培養(yǎng)檢測結(jié)果H<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所〈120〉一種可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片、其制備方法及用途<160〉7〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉354〈212〉PRT〈213>結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)〈400〉2AlaAlaGlyCysGlySerLysProProSerGlySerProGluThrGly151015AlaGlyAlaGlyThrValAlaThrThrProAlaSerSerProValThr202530LeuAlaGluThrGlySerThrLeuLeuTyrProLeuPheAsnLeuTrp354045GlyProAlaPheHisGluArgTyrProAsnValThrlieThrAlaGin505560GlyThrGlySerGlyAlaGlylieAlaGinAlaAlaAlaGlyThrVal65707580AsnlieGlyAlaSerAspAlaTyrLeuSerGluGlyAspMetAlaAla859095HisLysGlyLeuMetAsnlieAlaLeuAlalieSerAlaGinGinVal100105110AsnTyrAsnLeuProGlyValSerGluHisLeuLysLeuAsnGlyLys115120125ValLeuAlaAlaMetTyrGinGlyThrlieLysThrTrpAspAspPro130135140GinlieAlaAlaLeuAsnProGlyValAsnLeuProGlyThrAlaVal145150155160ValProLeuHisArgSerAspGlySerGlyAspThrPheLeuPheThr165170175GinTyrLeuSerLysGinAspProGluGlyTrpGlyLysSerProGly180185190PheGlyThrThrValAspPheProAlaValProGlyAlaLeuGlyGlu195200205AsnGlyAsnGlyGlyMetValThrGlyCysAlaGluThrProGlyCys210215220ValAlaTyrlieGlylieSerPheLeuAspGinAlaSerGinArgGly225230235240LeuGlyGluAlaGinLeuGlyAsnSerSerGlyAsnPheLeuLeuPro245250255AspAlaGinSerlieGinAlaAlaAlaAlaGlyPheAlaSerLysThr260265270ProAlaAsnGinAlalieSerMetlieAspGlyProAlaProAspGly275280285TyrProlielie,AsnTyrGluTyrAlalieValAsnAsnArgGinLys290295300AspAlaAlaThrAlaGinThrLeuGinAlaPheLeuHisTrpAlalie305310315320ThrAspGlyAsnLysAlaSerPheLeuAspGinValHisPheGinPro325330335LeuProProAlaValValLysLeuSerAspAlaLeulieAlaThrlie340345350SerSer〈210>2<211〉41〈212〉PRT〈213〉結(jié)核桿菌〈400〉4HisSerLeuLeuAspGluGlyLysGinSerLeuThrLysLeuAlaAla1015AlaTrpGlyGlySerGlySerGluAlaTyrGinGlyValGinGinLys202530TrpAspAlaThrAlaThrGluLeuAsn3540〈210〉3〈211〉37〈212〉PRT<213>結(jié)核桿菌〈400〉6GluAlaAla1AsnLys5GinLysGinlieArgGinAlaGly20ValGinTyrGinAlaLeu35SerSer〈210〉4〈211〉154〈212〉PRT〈213〉結(jié)核桿菌<400>8ProLysThr1TyrCys5GluGluLeuCysLeulieGinMet20SerAspProProSerTyr35TyrProAspGinLys40ThrArgAsp50LysPheLeuSerAla55AlaProTyr65GluLeuAsnlieThr70101525301015253045607580ProProArgGlyThrGinAlaValValLeuLysValTyrGinAsnAla859095GlyGlyThrHisProThrThrThrTyrLysAlaPheAspTrpAspGin100105110AlaTyrArgLysProlieThrTyrAspThrLeuTrpGinAlaAspThr115120125AspProUuProValValPheProlieValGinGlyGluLeuSerLys130135140GinThrGlyGinGinValSerlieAlaPro145150<210〉5〈211〉30〈212〉PRT〈213〉結(jié)核桿菌〈400〉10ThrSerProThrSerTrpGluGinAlaAlaAlaGluAlaValGinArg151015AlaArgAspSerValAspAsplieArgValAlaArgVallie202530<210>6〈211〉64〈212〉PRT〈213〉結(jié)核桿菌〈400〉12AlaGlyValAlaSerAlaAspProValAspAlaVallieAsnThrThr151015CysAsnTyrGlyGinValValAlaAlaLeuAsnAlaThrAspProGly202530AlaAlaAlaGinPheAsnAlaSerProValAlaGinSerTyrLeuArg354045AsnPheLeuAlaAlaProProProGinArgAlaAlaMetAlaAlaGin505560<210〉7<211>143<212〉PRT〈213〉結(jié)核桿菌<400>14AlaAspLys1ThrThrGinThrlieTyrlieAspAlaAspProGlyGlu51015ValMetLysAlalieAlaAsplieGluAlaTyrProGinTrplieSer202530GluTyrLysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGluGlyTyrPro354045LysArgAlaArgMetLeuMetAspAlaAlaliePheLysAspThrLeu505560lieMetSerTyrGluTrpProGluAspArgGinSerLeuSerTrpThr65707580LeuGluSerSerSerLeuLeuLysSerLeuGluGlyThrTyrArgLeu859095AlaProLysGlySerGlyThrGluValThrTyrGluLeuAlaValA印100105110LeuAlaValProMetlieGlyMetLeuLysArgLysAlaGluArgArg115120125LeulieAspGlyAlaLeuLysAspLeuLysLysArgValGluGly130135140權(quán)利要求1.一種可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片，其特征在于蛋白芯片上固定有SEQIDN01-7所示的7種結(jié)核桿菌特異優(yōu)勢表位抗原。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述蛋白芯片，其特征在于還固定有陽性對照抗原和陰性對照抗原。3.制備權(quán)利要求1或2所述蛋白芯片的方法，包括以下步驟(1)制備SEQIDNO:1-7所示的7種結(jié)核桿菌特異優(yōu)勢表位抗原；(2)將制備的抗原固定于芯片基片；(3)用封閉液進行封閉，然后干燥。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其中固定上述抗原于芯片基片采用點接觸法。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其中所述芯片基片為氨基硅垸化的玻片。6.權(quán)利要求1或2所述蛋白芯片在檢測抗結(jié)核桿菌抗體中的用途。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用克隆表達的七種結(jié)核桿菌特異優(yōu)勢表位抗原研制的可視化多靶點結(jié)核抗體檢測蛋白芯片，還公開了該蛋白芯片的制備方法及用途。本發(fā)明將七種結(jié)核桿菌特異優(yōu)勢表位抗原點于修飾的基片上，制備可檢測七種結(jié)核抗體的多靶點蛋白微陣列，建立免疫金銀染色檢測系統(tǒng)替代芯片原有熒光標記物。通過本發(fā)明檢測系統(tǒng)的應(yīng)用，無需使用芯片熒光掃描儀，通過目測及簡單的圖像掃描即可對芯片的反應(yīng)結(jié)果進行判斷，達到對結(jié)核病檢測之目的?？梢暬喟悬c結(jié)核抗體檢測蛋白芯片敏感性分別為98.5％和96.6％，特異性為93.3％，顯著高于痰涂片和痰菌培養(yǎng)方法，并且顯著提高了痰涂片和痰菌培養(yǎng)陰性患者的檢出率，可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷，具有一定的臨床應(yīng)用前景。文檔編號G01N33/53GK101639476SQ20081013480公開日2010年2月3日申請日期2008年7月31日優(yōu)先權(quán)日2008年7月31日發(fā)明者馮曉燕,宋曉國,張賀秋,王國華,坤陳申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所