一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡的制作方法
【專利摘要】一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡，其特征在于檢測(cè)卡由內(nèi)部的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試紙和外部的配套專用卡殼組成。試紙由含有膠體金標(biāo)記的抗人IgG抗體或SPA的膠體金墊、包被有TB38、TB16、Lam三種結(jié)核特異性混合抗原(T線)和抗鼠IgG(C線)的NC膜、樣品墊、吸樣墊和塑料底板組成。稀釋液墊、膠體金墊、NC膜和吸樣墊從塑料底板一端依次排列至另一端。卡殼內(nèi)部用來(lái)放置檢測(cè)試紙，上蓋的下部對(duì)應(yīng)稀釋液墊部分設(shè)置了稀釋液孔；中間部分應(yīng)對(duì)試紙NC膜中下部分設(shè)置了視窗口；中上部分應(yīng)對(duì)試紙NC膜上部設(shè)置了樣品孔。檢測(cè)時(shí)在樣品孔加入樣本，稀釋液孔加入稀釋液，15分鐘完成檢測(cè)。具有操作簡(jiǎn)便、快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型是涉及醫(yī)學(xué)臨床診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種以免疫膠體金快速檢測(cè)方法制備的一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是由結(jié)核桿菌(tubercle bacillus)感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis)。
[0003]全球現(xiàn)有6億人，感染有結(jié)核桿菌。大多數(shù)的受感染者沒(méi)有病癥，稱為潛伏結(jié)核感染，但其中約5-10%的潛伏感染者會(huì)發(fā)展至活動(dòng)性結(jié)核；若無(wú)適當(dāng)治療，一個(gè)活動(dòng)病例平均每年可使10?15人新受感染,病例本人的死亡率則超過(guò)50%。
[0004]結(jié)核病目前的主要檢測(cè)或診斷方法有:
[0005]1、痰結(jié)核菌檢查:痰涂片檢查或痰結(jié)核菌培養(yǎng)。是結(jié)核病診斷的確診方法之一，檢查簡(jiǎn)便易行，準(zhǔn)確性較高，但這種方法診斷的陽(yáng)性率很低，靈敏度在40%以下，若培養(yǎng)則需6-8周時(shí)間，診斷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
[0006]2、結(jié)核病的影像學(xué)診斷:如胸部X射線和CT等。X射線可以早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病，確定病灶的部位、性質(zhì)、范圍，了解發(fā)病情況及用于治療效果的判斷，胸部CT可以發(fā)現(xiàn)較小的或隱蔽部位的病變，可以彌補(bǔ)一般X線檢查的不足。X線檢查對(duì)肺結(jié)核病的初篩、診斷等起重要輔助作用，但存在需要大型設(shè)備，費(fèi)用較高，胸片存在20%左右的低讀率和讀過(guò)率。
[0007]3、分子生物學(xué)技術(shù)診斷:主要指結(jié)核桿菌聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，該方法的靈敏度很高，但存在較高的假陽(yáng)性，特異性差，并且診斷費(fèi)用較高。
[0008]4、免疫學(xué)診斷:免疫學(xué)診斷有結(jié)核菌素純蛋白衍化物(PPD)試驗(yàn)和抗體診斷等方法。pro試驗(yàn)較為傳統(tǒng)的診斷方法之一，在臨床上經(jīng)常使用。該試驗(yàn)陽(yáng)性是感染過(guò)結(jié)核菌的證據(jù)之一,不能很好的區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染?？贵w診斷方法:檢測(cè)血清中抗TB免疫球蛋白(IgG)抗體，該方法的靈敏度為60%-80%，特異性為90%。是結(jié)核臨床診斷上常用的方法之一，抗體診斷試劑主要為ELISA試劑和免疫層析膠體金快速診斷試劑。
[0009]免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，基本原理如下:利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)T線，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
[0010]目前利用膠體金技術(shù)檢測(cè)結(jié)核抗體的試劑已有部分報(bào)道。但本專利擬公開(kāi)檢測(cè)卡試劑在設(shè)計(jì)和檢測(cè)方法上均和目前所有的報(bào)道不同。主要體現(xiàn)在4個(gè)方面:1)檢測(cè)卡的加樣孔設(shè)置在檢測(cè)卡的中上部；2)采用了 TB16，TB38和Lam三種抗原混合包被檢測(cè)線，使得產(chǎn)品的性能提高。3)加樣孔設(shè)置在檢測(cè)卡的中上部，利用NC膜分離血清，可以直接檢測(cè)全血樣本，無(wú)需作任何前處理。4)加樣孔設(shè)置在檢測(cè)卡的中上部，實(shí)現(xiàn)了不同的反應(yīng)原理，樣本將先和抗T線上的抗原反應(yīng)，樣本中無(wú)關(guān)的IgG絕大部分會(huì)被稀釋液洗滌，不和膠體金標(biāo) 記的抗體反應(yīng)，消除倒溝效應(yīng)，這和所有從下部加樣的試劑反應(yīng)原理不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本實(shí)用新型發(fā)明目的是提供一種新型一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡，用來(lái)檢測(cè)血清、血漿和全血樣本中的TB抗體。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
如下:
[0012]—種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡,其特征在于檢測(cè)卡由內(nèi)部的結(jié)核分枝桿菌(TB)抗體檢測(cè)試紙和外部的配套專用卡殼組成。
[0013]所述的TB抗體檢測(cè)卡，其特征在于檢測(cè)試紙由含有膠體金標(biāo)記的抗人IgG抗體或SPA的膠體金墊、包被NC膜、稀釋液墊、吸樣墊和塑料底板組成，稀釋液墊、膠體金墊、NC膜和吸樣墊從塑料底板一端依次連接排列至另一端；其中包被NC膜的結(jié)構(gòu)為:以NC膜為基質(zhì)，在NC膜的T線位置包被了結(jié)核特異性抗原，C線位置包被了抗鼠IgG ;配套專用卡殼包含上蓋和下蓋兩個(gè)部分，卡殼內(nèi)部用來(lái)放置TB抗體檢測(cè)試紙；卡殼上蓋的下部對(duì)應(yīng)稀釋液墊部分設(shè)置了稀釋液孔，卡殼上蓋的中間部分應(yīng)對(duì)試紙NC膜中下部分設(shè)置了視窗口 ；卡殼上蓋的中上部分應(yīng)對(duì)試紙NC膜上部設(shè)置了樣品孔。
[0014]所述的TB抗體檢測(cè)卡，其特征在于檢測(cè)試紙的寬度為3-5mm，總長(zhǎng)度為7-9cm ;稀釋液墊長(zhǎng)度2-2.5cm，膠體金墊長(zhǎng)度為0.6-lcm，NC膜長(zhǎng)度2-3cm，吸樣墊長(zhǎng)度為1.5-2.5cm。
[0015]所述的TB抗體檢測(cè)卡，其特征在于NC膜是一種由硝酸纖維素構(gòu)成的多孔結(jié)構(gòu)的膜，孔徑為6-12 μ m，稀釋液墊為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊為吸水濾紙。
[0016]所述的TB抗體快速檢測(cè)卡，結(jié)核特異性抗原為T(mén)B38、TB16和Lam混合抗原，抗原的包被方法為:以0.0lM pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)將TB38、TB16和Lam混合抗原配制成合適的濃度，優(yōu)選混合抗原濃度為T(mén)B38、TB16和Lam為0.5,0.3和0.1mg / ml，在噴膜儀在NC膜上以1.2-1.5ul / cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T線，同時(shí)在NC膜上部包被l-2mg /ml的抗鼠IgG作為C線。干燥,備用。
[0017]所述的TB抗體快速檢測(cè)卡，標(biāo)記膠體金顆粒的方法為:取IOOml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0.2M K2C03調(diào)至ρΗ7.0-8.0,按IOOml膠體金液加入Img抗人IgG或SPA，室溫?cái)嚢鐸小時(shí)，封閉，12000rpm離心30分鐘，棄上清，用工作液復(fù)溶至60ml，按每毫升溶液鋪20cm2的比例分別均勻地鋪在膠體金墊上，干燥備用。
[0018]所述的TB抗體快速檢測(cè)卡，檢測(cè)卡裝配方法為:在相對(duì)濕度小于30%的條件下，取塑料底板，將已包被的NC膜粘貼在底板的中部，在NC膜T線一側(cè)粘貼膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)粘貼稀釋液墊；在NC膜C線一側(cè)粘貼吸樣墊；各粘貼組分接口相互疊壓l_2mm，粘貼好的大板切成3-5mm寬的試紙條。放置于卡殼下蓋的槽中，然后蓋上上蓋，壓緊，完成裝配。
[0019]所述的TB抗體快速檢測(cè)卡，檢測(cè)方法為:檢測(cè)時(shí)將少量(3-10ul)被檢樣本如血清、血漿、全血、胸水、腹水或腦脊液等加入到對(duì)應(yīng)NC膜加樣孔中，樣本將在NC膜上由上至下層析，經(jīng)過(guò)NC膜的C、T線，然后在稀釋液孔加入樣品稀釋液，稀釋液將溶解膠體金，在NC膜上由下至上層析，推動(dòng)樣本回流，并在NC膜上形成免疫反應(yīng)。在15分鐘內(nèi)根據(jù)C、T線的出現(xiàn)情況判定檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)TB抗體的快速檢測(cè)。
[0020]本實(shí)用發(fā)明的有益效果是:提供一種利用免疫膠體金技術(shù)制備一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡及其檢測(cè)方法，適用于對(duì)人血清、血漿和全血或其它樣本中TB抗體的檢測(cè)，并適合臨床上單人份檢測(cè)。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0021]圖1是結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡結(jié)構(gòu)圖
[0022]圖2是結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)圖
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例:結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡制備及檢測(cè)
[0024]I主要材料
[0025]1.1TB抗原TB38、TB16和Lam抗原，從有資質(zhì)的供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi)；鼠抗人IgG抗體，羊抗鼠IgG:自制；氯金酸:Sigma公司產(chǎn)品；NC膜:Millipore公司產(chǎn)品；水解酪蛋白，聚乙二醇PEG20000 =Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純?cè)噭?br> [0026]1.2臨床樣本由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，共200份，其中陰性血清樣本50份，血漿樣本20份，全血樣本30份，陽(yáng)性血清樣本50份，血漿樣本20份，全血樣本30份。
[0027]1.3卡殼、比色卡:由本公司設(shè)計(jì)，相關(guān)公司按要求生產(chǎn)、提供。
[0028]2 方法
[0029]2.1鼠抗體IgG抗體膠體金標(biāo)記采用氯金酸-檸檬酸三鈉法制備直徑為30_40nm的膠體金溶液，取三份膠體金溶液，分別用0.2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7.0、pH7.5和pH8.0，然后將膠體金緩慢攪拌,按每ml溶液加入5ug、10ug、20ug將鼠抗人IgC抗體加入到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌30分鐘，再加入到終濃度為0.5%的PEG2000和0.5%的水解酪蛋白進(jìn)行封閉，標(biāo)記結(jié)束后以IOOOOrpm離心,棄上清,沉淀按50%原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液中(PH8.0，含水解酪蛋白，羊血清，蔗糖和表面活性劑)。然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無(wú)紡布上，在溫度20_25°C，相對(duì)濕度在〈30%的干燥間干燥3-5小時(shí)，制成膠體金墊。
[0030]2.2NC膜包被用0.0lM pH7.4PBS將TB38、TB16和Lam抗原配制成不同濃度及比例的混合物，羊抗鼠IgG分別稀釋成Img / ml、2mg / ml,然后用噴膜儀在NC膜上按1.2ul /cm進(jìn)行分別劃線包被，包被完成后將NC膜在在溫度20-25°C，相對(duì)濕度在〈30%的干燥間干燥3-5小時(shí)。
[0031]2.3在相對(duì)濕度小于30%的條件下，取塑料底板，將已包被的NC膜粘貼在底板的中部，在NC膜T線一側(cè)粘貼膠體金墊，在膠體金墊另一側(cè)粘貼稀釋液墊；在NC膜C線一側(cè)粘貼吸樣墊；各粘貼組分接口相互疊壓1_2_，粘貼好的大板切成3-5_寬的試紙條。放置于卡殼下蓋的槽中，然后蓋上上蓋，壓緊，完成裝配。
[0032]2.4檢測(cè)卡工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對(duì)，制備小樣，利用質(zhì)控抗體對(duì)試劑進(jìn)行測(cè)試，尋找最佳組合。
[0033]2.5檢測(cè)方法將少量被檢血清、血漿或全血樣本(3-10ul)加入到對(duì)應(yīng)NC膜加樣孔中，樣本將在NC膜上由上至下層析，經(jīng)過(guò)NC膜的C、T線，然后在稀釋液孔加入樣品稀釋液，稀釋液將溶解膠體金，在NC膜上由下至上層析，推動(dòng)樣本回流，并在NC膜上形成免疫反應(yīng)。在15分鐘內(nèi)根據(jù)C、T線的出現(xiàn)情況判定檢測(cè)結(jié)果，
[0034]2.6臨床樣本檢測(cè)試劑制備完成后，按檢測(cè)方法對(duì)所有臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并分析檢測(cè)結(jié)果。
[0035]3 結(jié)果
[0036]3.1試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測(cè)結(jié)果，確定了鼠抗人IgG的最佳標(biāo)記pH值為
7.0-8.0 ;最佳標(biāo)記量為IOug / ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為0.1MTris鹽緩沖液，pH8.0，含0.5%水解酪蛋白、5%蔗糖，1% Tween20 ;最佳包抗原的濃度為T(mén)B38、TB16和Lam為0.5、0.3和0.1mg / ml的混合抗原，。檢測(cè)結(jié)果的最佳判定時(shí)間為10-15分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時(shí)因生物原料活性變化可能需要適當(dāng)調(diào)整。
[0037]3.2臨床樣本檢測(cè)對(duì)100份臨床陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)，血清、血漿和全血檢測(cè)的總符合率為92.00% (84.79%?96.10% )，不同類型樣本無(wú)明顯差異；對(duì)100份臨床陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)，血清、血漿和全血檢測(cè)的總符合率為79.00% (69.95%?85.90% ),不同類型樣本無(wú)明顯差異；一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.71。根據(jù)文獻(xiàn)資料,可以判定檢測(cè)卡的性能良好，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，適合用于個(gè)人自測(cè)或臨床檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡，其特征在于檢測(cè)卡由內(nèi)部的結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試紙和外部的配套專用卡殼組成:檢測(cè)試紙由含有膠體金標(biāo)記的抗人IgG抗體或SPA的膠體金墊、包被NC膜、稀釋液墊、吸樣墊和塑料底板組成，稀釋液墊、膠體金墊、NC膜和吸樣墊從塑料底板一端依次連接排列至另一端；其中包被NC膜的結(jié)構(gòu)為:以NC膜為基質(zhì)，在NC膜的T線位置包被了結(jié)核特異性抗原，C線位置包被了抗鼠IgG ;配套專用卡殼包含上蓋和下蓋兩個(gè)部分，卡殼內(nèi)部用來(lái)放置TB抗體檢測(cè)試紙；卡殼上蓋的下部對(duì)應(yīng)稀釋液墊部分設(shè)置了稀釋液孔，卡殼上蓋的中間部分應(yīng)對(duì)試紙NC膜中下部分設(shè)置了視窗口 ；卡殼上蓋的中上部分應(yīng)對(duì)試紙NC膜上部設(shè)置了樣品孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡，其特征在于檢測(cè)試紙的寬度為3-5mm，總長(zhǎng)度為7-9cm ;稀釋液墊長(zhǎng)度2-2.5cm，膠體金墊長(zhǎng)度為0.6-lcm, NC膜長(zhǎng)度2_3cm,吸樣墊長(zhǎng)度為1.5-2.5cm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌抗體快速檢測(cè)卡，其特征在于所述NC膜是一種由硝酸纖維素構(gòu)成的多孔結(jié)構(gòu)的膜，孔徑為6-12 μ m，稀釋液墊為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊為吸水濾紙。
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK203443962SQ201320447609
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月20日
【發(fā)明者】李洲, 楊發(fā)青, 王朝南 申請(qǐng)人:天津中新科炬生物制藥有限公司