專利名稱：檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒及制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景在最近十幾年內(nèi)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一些進入水生生態(tài)系統(tǒng)中的污染物，能夠擾亂野生 生物和人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。這一類化合物可能是自然存在的，如大豆木黃 酮、金雀異黃素等；也可能是人工合成的化合物，如垸基酚類化合物、多氯聯(lián)苯類 化合物和殺蟲劑等；還有的是工業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品，如二噁英等，這一類化合物統(tǒng)稱 為內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)。內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)能夠干擾人和動物體內(nèi)激素的合成、 釋放、運輸、代謝，以及激素與受體的結(jié)合、功能的表達等一系列生物過程，從而 擾亂人和動物內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的機能，甚至對生物后代生殖功能 也能產(chǎn)生危害。這一類化合物都具有相似的性質(zhì)如脂溶性、難于自然降解、生物放 大和生物累積，因而可以隨著食物鏈逐級傳遞，對處于海洋食物鏈頂端的魚類影響 尤其嚴(yán)重。最近研究表明魚類出現(xiàn)的雄魚雌性化、雌性貝類的雄性化、魚類精子數(shù) 量的降低、種群的衰退等都與內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的污染密切相關(guān)；更為嚴(yán)重的是 人類食用了受內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)污染的魚類后，這些化合物能夠轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)， 對人類的健康產(chǎn)生嚴(yán)重的危害，能夠造成人類癌癥的增加、精子數(shù)量和質(zhì)量的降低、 新生兒畸形及神經(jīng)系統(tǒng)的疾病等。因而需要開發(fā)篩選和檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物 質(zhì)的試劑盒，并開展海洋環(huán)境的生態(tài)安全評價、養(yǎng)殖魚類的食品安全評價。魚類是海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，處于食物鏈的頂端，是開展海洋內(nèi)分泌 擾亂化學(xué)物質(zhì)評價的重要對象，由于魚類與哺乳動物具有相似的內(nèi)分泌系統(tǒng)，因而 還可以外推內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)對人類產(chǎn)生的影響。雄性魚類卵黃原蛋白的產(chǎn)生是 指示內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)污染的重要生物標(biāo)志物。卵黃原蛋白是卵黃蛋白的前體， 是一種大分子量的脂磷聚糖蛋白。卵黃形成期，在雌激素的刺激下卵黃原蛋白由肝 臟合成，并通過血液運輸?shù)桨l(fā)育的卵巢中，被卵巢吸收；在卵巢內(nèi)，卵黃原蛋白裂 解成為兩種卵黃蛋白卵黃脂磷蛋白和卵黃高磷蛋白，這兩種蛋白貯存在卵中，作 為胚胎發(fā)育的營養(yǎng)源。卵黃原蛋白是雌魚的特異性蛋白，只能在雌魚卵黃形成期檢 測到。但是由于雄魚的肝臟中也有卵黃原蛋白基因，因而雌激素也能誘導(dǎo)雄魚肝臟
合成和分泌卵黃原蛋白。除內(nèi)源雌激素外，某些具有環(huán)境雌激素活性的內(nèi)分泌擾亂 化學(xué)物質(zhì)，即使低濃度的內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)也能誘導(dǎo)雄魚卵黃原蛋白的產(chǎn)生，起 到類似于內(nèi)源雌激素的作用。與其他生物標(biāo)志物相比，卵黃原蛋白檢測方法簡便， 能夠直接指示內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的污染，而且還可以應(yīng)用到魚類食品安全的檢測 與評價；此外在養(yǎng)殖領(lǐng)域還能指示雌魚的生殖周期和性腺發(fā)育程度。真鯛在我國海 域廣泛分布，同時也是主要的養(yǎng)殖魚類，而且真鯛為肉食性，處于海洋食物鏈的頂 端，能夠富集持久性有機污染物，因而可以用于監(jiān)測近海內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)污染 和實驗室內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)篩選等研究中。雖然國外也建立了針對海洋魚類卵黃原蛋白的酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，但是 這些試劑盒檢測的魚類在我國沒有分布，不能用于檢測我國海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物 質(zhì)的污染程度。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒及制備方法 和應(yīng)用，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點。一種檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒，包括1個盒體，盒體內(nèi)有空白96 孔酶標(biāo)板1塊，以及陰性對照組血清、包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯 色液、終止劑和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它還裝有鼠 抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體1支、真鯛卵黃原蛋白純品1支。上述檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒的制備方法，其特征在于由下述步 驟組成l)制備真鯛卵黃原蛋白純品；2)制備鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體；3) 將步驟l)中得到的真鯛卵黃原蛋白純品1支、步驟2)得到的鼠抗真鯛卵黃原蛋白多 克隆抗體1支、空白96孔酶標(biāo)板1塊，以及陰性對照組血清、封閉液、包被液、樣 品稀釋液、洗漆液、顯色液、終止劑及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗各1支放 在盒體內(nèi)，得到檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒。上述檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒在海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)調(diào)査中 的應(yīng)用。本發(fā)明利用酶聯(lián)免疫吸附原理，提供了一種簡便、高效、靈敏地檢測海洋內(nèi)分 泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒。該試劑盒操作簡便、快速，為檢測我國海洋環(huán)境中的內(nèi) 分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)提供了一種新的分析手段，還可以分析判斷海洋環(huán)境中的魚類受 到內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的影響以及內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的生態(tài)風(fēng)險評價，此外還可　以用于養(yǎng)殖魚類食品安全檢測和卵巢性成熟程度測定。
具體實施方式
制備檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒時分為以下步驟(1) 制備真鯛卵黃原蛋白純品將10mgl7"-雌二醇(17^estradiol,E2)溶于0.5mL無水乙醇，再加入0.5mL花生 油，充分混勻，配制17^-雌二醇乳狀液。用17P-雌二醇乳狀液進行真鯛腹腔注射， 注射劑用量為0.5mL/條，10天后再進行尾靜脈取血，4°C8000g離心5min，獲得含 卵黃原蛋白的血漿。取血漿lmL加入分子篩層析柱，填料為Sephacryl S-300,用含 0.07 MNaCl的25 mM Tris-HCl (pH7.5)洗脫，收集含真鯛卵黃原蛋白的樣品用于離 子交換層析，填料為DEAE Sepharose Fast Flow,用含0.1M和0.2M NaCl的25 mM Tris-HCl進行不連續(xù)洗脫，采用部份收集器收集洗脫液，電泳鑒定后把含有真鯛卵 黃原蛋白純品的等分試樣-8(TC保存。(2) 制備鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體取純化的真鯛卵黃原蛋白50mg與0.1 mL弗氏完全佐劑充分混勻，進行小鼠腹 腔注射進行第1次免疫。兩周后進行第2次免疫，取純化的真鯛卵黃原蛋白10 mg 與0.1mL弗氏不完全佐劑充分混勻，進行小鼠腹腔注射。以后每周注射l次，注射 液的劑量與第2次相同。于第5次注射后，在l周內(nèi)連續(xù)注射兩次，以加強免疫效 果，注射液的劑量均與第2次相同。小鼠尾靜脈取血，采用雙向擴散法測定抗血清 效價。小鼠眼眶動脈取血，獲得抗血清用于制備鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體。 采用親和層析法制備鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體，所用的親和層析填料為 CNBr-activated Sepharose 4B，取上述純化的真鯛卵黃原蛋白與之結(jié)合；將鼠抗血清 用PBS(由0.14M NaCl、 0.015M KH2P04、 0.075M Na2HP04、 0.027M KC1所組成， pH7.3)稀釋后，加入層析柱中循環(huán)過夜；用0.1M甘氨酸(pH2.8)洗脫抗體，收集抗 體加入保存劑，-S(TC保存。(3) 將制備的真鯛卵黃原蛋白純品1支、鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體1支、 空白96孔酶標(biāo)板1塊，以及陰性對照組血清、封閉液、包被液、樣品稀釋液、洗滌 液、顯色液、終止劑及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗各1支裝入盒體，構(gòu)成本 發(fā)明的試劑盒。其具體組成如下1) 空白96孔酶標(biāo)板1塊；2) 真鯛卵黃原蛋白純品l支，使用前用包被液稀釋到所需濃度；　3) 陰性對照組血清1支，使用前用樣品稀釋液按1:200的體積比稀釋；4) 鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體1支，使用前用樣品稀釋液按1:500的體積比 稀釋；5) 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗1支，使用前用樣品稀釋液按1:1000的體 積比稀釋；6) 包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止劑各1支，所述的包 被液為50mM碳酸鹽緩沖液，pH 9.6;封閉液為含1% BSA和0.1% Tween-20的 150mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.4;樣品稀釋液為含0.1% Tween-20的150mM磷酸鹽 緩沖液，pH7.4;洗滌液為含0.05%Tween-20的150mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4;顯 色液為用碳酸鹽-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配置的0.4mg mL—1的鄰苯二胺(OPD)溶液，使 用前加入H202 0.015mL;終止劑為0.5M H2S04。本發(fā)明的檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒在使用時分為以下步驟1) 在空白96孔酶標(biāo)板中加入用包被液稀釋了的真鯛卵黃原蛋白純品、陰性對照 血清和待測血漿，100nL/孔，室溫孵育2小時。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液洗滌96孔 酶標(biāo)板4次02) 在96孔酶標(biāo)板中加入封閉液，30(HiL/孔，室溫下孵育0.5小時。棄去孔內(nèi)溶 液，用洗滌液洗滌96孔酶標(biāo)板4次。3) 在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液稀釋了的鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗 體，100nL/ L， 4t:靜置過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液洗漆96孔酶標(biāo)板4次。4) 在96孔酶標(biāo)板中加入用樣品稀釋液稀釋了的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二 抗，10(HiL/孔，室溫孵育2小時。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液和三蒸水各洗滌96孔酶 標(biāo)板2次。5) 在96孔酶標(biāo)板中加入新配制的顯色液，10(HiL/孔，于室溫暗處反應(yīng)5 30min。6) 待標(biāo)準(zhǔn)品呈現(xiàn)明顯的黃色后加入終止劑，5(HiL/孔。7) 用酶標(biāo)儀測定492nm波長下各孔的吸光值。8) 根據(jù)樣品的光吸收強度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出其相應(yīng)的濃度。9) 根據(jù)測定的雄性真鯛血漿中卵黃原蛋白濃度的高低，可以判定該魚生活海域內(nèi) 分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)污染的程度。
權(quán)利要求
1、一種檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒，包括1個盒體，盒體內(nèi)有空白96孔酶標(biāo)板1塊，以及陰性對照組血清、包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止劑和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗各1支，其特征在于它還裝有真鯛卵黃原蛋白純品1支、鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體1支。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的真鯛卵黃原蛋白純品為標(biāo) 準(zhǔn)濃度的真鯛卵黃原蛋白純品。
3、 權(quán)利要求1所述的檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒的制備方法，其特 征在于由下述步驟組成l)制備真鯛卵黃原蛋白純品；2)制備鼠抗真鯛卵黃原蛋白多 克隆抗體；3)將步驟l)中得到的真鯛卵黃原蛋白純品1支、步驟2)得到的鼠抗真鯛 卵黃原蛋白多克隆抗體1支、空白96孔酶標(biāo)板1塊，以及陰性對照組血清、包被液、 封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止劑及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二 抗各1支共同放在盒體內(nèi)，得到檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒。
4、 權(quán)利要求1所述的試劑盒在海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒及制備方法和應(yīng)用。制備時，首先制備真鯛卵黃原蛋白純品，其次制備鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體；然后將真鯛卵黃原蛋白純品1支、鼠抗真鯛卵黃原蛋白多克隆抗體1支、空白96孔酶標(biāo)板1塊，以及陰性對照組血清、包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止劑及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗各1支共同放在盒體內(nèi)，得到檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒。本發(fā)明的檢測海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的試劑盒可以應(yīng)用到海洋內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)的檢測中，能夠靈敏、準(zhǔn)確、方便的定量檢測真鯛血液中、肝臟組織及肝細(xì)胞培養(yǎng)液中的卵黃原蛋白。
文檔編號G01N33/543GK101398425SQ200810158209
公開日2009年4月1日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者汝少國, 潘宗保, 欣 邴 申請人:中國海洋大學(xué)