專利名稱：豬圓環(huán)病毒pcv1和pcv2鑒別檢測試紙卡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬圓環(huán)病毒PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型 鑒定檢測試紙卡。
技術(shù)背景豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒，病毒粒子直徑約 17nm，為共價閉合，環(huán)狀，單股DNA病毒，具有兩種基因型豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬 圓環(huán)病毒2型(PCV2)。 PCV1無致病性，但廣泛存在于豬體內(nèi)和豬源傳代細(xì)胞系，其基因組 全長1759nt或1758nt， PCV2對豬有致病性，是引發(fā)一系列豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus diseases, PCVD)，特別是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原，導(dǎo)致豬群免疫抑制，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PCV2 基因組全長1768nt或1767nt，目前已知PCV2 ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，ORF2 編碼PCV2免疫相關(guān)的衣殼蛋白，ORF3編碼與PCV2復(fù)制無關(guān)、與致病性有關(guān)的蛋白。最近， 我們從疑似豬"高熱癥"患豬中分離鑒定一種基因組全長1766nt的新的PCV2毒株(,PCV2)。 1766PCV2在1059位缺失一個核苷酸G，弓|起ORF2 C末端密碼子移位，使得1766PCV2缺失 1767PCV2的特異性抗原表位。該特征性抗原表位可作為血清學(xué)標(biāo)志，用于n66PCV2、 1767PCV2 和，PCV2的抗原分型鑒定。目前，國內(nèi)外采用的PCV2抗原和抗體檢測技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)，間接免疫熒光 (IFA)，免疫酶單層試驗(IMPA),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，原位雜交(ISH)，聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)等等。上述技術(shù)和方法雖然可以檢測PCV2病毒，在實踐中也取得一定的效果，但均 無法實現(xiàn)以PCV2抗原亞型的鑒別診斷，并且存在試驗操作復(fù)雜，耗時長，需要特定的專業(yè) 技能和儀器設(shè)備等，常限于實驗室內(nèi)進行，很難在基層普及和推廣。因此，在分析鑒定PCV2 亞型抗原表位特征的基礎(chǔ)上，研制開發(fā)適用于養(yǎng)殖基層的快捷、簡便的PCV1和PCV2鑒別 診斷和抗原分型檢測器具，對診斷、監(jiān)控豬群PCV2感染，有效控制PCVD的發(fā)生和危害有 重要意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種適用于豬PCV1和PCV2感染快速鑒別檢測和PCV2抗原亞 型鑒定的試紙卡，在生產(chǎn)實踐中易于推廣應(yīng)用。本發(fā)明的PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡，包括用不吸水薄片條制成的支撐層1，反應(yīng)試 劑載體吸附層固定在支撐層1上，從樣品端11到手柄端12的反應(yīng)試劑載體吸附層依次為 纖維層2，金標(biāo)纖維層3，纖維素膜層4和吸水材料層5;金標(biāo)纖維層3為吸附膠體金標(biāo)記的 識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體的金標(biāo)玻璃棉，纖維素膜層4為 從樣品端11至手柄端12依次印制檢測印跡T1 6、檢測印跡T2 7和對照印跡C 8的硝酸纖維素膜，試紙卡固定在塑料卡10內(nèi)，在樣品端11設(shè)有加樣孔9;檢測印跡Tl 6為以識 別PCV1型特異性抗原表位的單克隆抗體溶液在纖維素膜上印制的條狀PCV1檢測印跡；檢測印跡T2 7為以識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體溶液印制的條 狀PCV檢測印跡，對照印跡C8為以抗小鼠IgG多克隆抗體溶液印制的條狀對照印跡，上述 3條印跡按序平行排列。本發(fā)明的PCV2亞型鑒定檢測試紙卡，包括用不吸水薄片條制成的支撐層1，反應(yīng)試劑 載體吸附層固定在支撐層1上，從樣品端11到手柄端12的反應(yīng)試劑載體吸附層依次為纖 維層2，金標(biāo)纖維層3，纖維素膜層4和吸水材料層5，金標(biāo)纖維層3為吸附膠體金標(biāo)記的識 別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體的金標(biāo)玻璃棉，纖維素膜層4為從 樣品端11至手柄端12依次印制檢測印跡T1 6、檢測印跡T2 7和對照印跡C 8的硝酸纖 維素膜，試紙卡固定在塑料卡10內(nèi)，在樣品端11設(shè)有加樣孔9;檢測印跡Tl 6為以識別 卩WPCV2亞型特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體溶液在纖維素膜上印制的1767亞型條 狀檢測印跡，檢測印跡T2 7為以識別1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單 克隆抗體溶液印制的1766和1767亞型條狀檢測印跡，對照印跡C 8為以抗小鼠IgG多克隆 抗體溶液印制的條狀對照印跡，上述3條印跡按序平行排列。以上方案詳述如下PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡含有支撐層和反應(yīng)試劑載體吸附層,支撐層為不吸水薄片 條，反應(yīng)試劑載體吸附層粘貼于支撐層上，由樣品端到手柄端依次為纖維層、金標(biāo)纖維層、 纖維素膜層和吸水材料層，纖維素膜層為從樣品端至手柄端依次印制檢測印跡T1，檢測印跡 T2和對照印跡C的硝酸纖維素膜，試紙卡固定在塑料卡內(nèi)，在樣品端設(shè)有加樣孔。支撐層的不吸水薄片條可用硬質(zhì)塑膠片條，或不吸水的硬紙條，纖維層可用玻璃棉，吸 水材料層可用吸水紙，纖維素膜層可用硝酸纖維素膜，金標(biāo)纖維層可用吸附金標(biāo)蛋白玻璃棉， 簡稱金標(biāo)玻璃棉，金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白 單克隆抗體mAbl, PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的檢測印跡Tl為以識別PCV1型特異性 抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb2溶液在纖維素膜上印制的PCVl檢測印跡"I "，檢 測印跡T2為以識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb3溶液印制的 PCV檢測印跡"I "，對照印跡C為以抗小鼠IgG多克隆抗體pAb溶液印制的對照印跡C" I "， 其組合排列為"III"; PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的檢測印跡T1為以識別n"PCV2亞型 特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb4溶液在纖維素膜上印制的1767亞型檢測印跡 "I "，檢測印跡T2為以識別1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體 mAb5溶液印制的1766和1767亞型檢測印跡"I "，對照印跡C為以抗小鼠IgG多克隆抗體pAb溶液印制的對照印跡"I "，其組合排列為"III "。 試紙卡具有下列各項優(yōu)點(1)特異性強，敏感性高。PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡以高親和力單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，抗衣殼蛋白單克隆抗體分別特異性識別PCV1和PCV2共 同抗原表位，PCV1型特異性抗原表位，以及PCV2亞型特異性抗原表位，有效區(qū)分PCV不 同抗原型和抗原亞型，有高度的特異性。(2) 操作簡便快速。使用PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡檢測PCV， 能有效鑒別檢測PCV1和PCV2感染，并進行PCV2抗原亞型鑒定，在5-10分鐘內(nèi)即可判定 檢測結(jié)果。(3) 顯示檢測結(jié)果形象、直觀準(zhǔn)確。PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙 卡以紅棕色"1"， " I I "或"I I I "作為陰性，抗原型和抗原亞型檢測標(biāo)記，通過PCV1 和PCV2鑒別檢測試紙卡可鑒別檢測PCV1和PCV2感染，即在PCV1和PCV2鑒別檢測試 紙卡上顯示一條棕紅色"I "印跡表示在被檢測樣品中未檢出PCV病毒，兩條棕紅色"I I " 印跡表示被檢樣品PCV2病毒陽性，三條棕紅色"III"印跡表示被檢樣品PCV1病毒陽 性；與PCV2亞型鑒定試紙卡的組合檢測，可進一步鑒定PCV2的抗原亞型，即在PCV2亞 型鑒定試紙卡上顯示一條棕紅色"I "印跡表示被檢測樣品中的PCV2病毒為1768抗原亞型， 兩條棕紅色"I I "印跡表示被檢樣品中的PCV2病毒為1766抗原亞型，三條棕紅色"I I I" 印跡表示被檢樣品中的PCV2病毒為1767抗原亞型，試紙卡無顯色印跡則表示檢測失敗或試 紙卡失效，結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性誤判。(4) 成本低，投資少。PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡可在檢測現(xiàn) 場完成操作，檢測一步到位，成本低廉，投資少，見效快。本發(fā)明有益的積極效果是操作簡單，普通技術(shù)人員可以操作，能滿足各種需要，如疫 病診斷、疫病監(jiān)測、口岸檢疫、衛(wèi)生防疫、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，易于大范圍推廣，具 有廣闊的市場前景。


圖1是PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡結(jié)構(gòu)示意圖。圖中，l.支撐 層，2.樣品端的纖維層，3.金標(biāo)纖維層(金標(biāo)玻璃棉)，4.纖維素膜層，5.手柄端的吸水材料 層，6.檢測印跡T1， 7.檢測印跡T2， 8.對照印跡C， 9.加樣孔，IO.塑料卡，ll.樣品端，12.手柄端。圖2是PCV1和PCV2鑒別檢測結(jié)果圖。圖中，1為PCV陰性，2為PCV2陽性，3為 PCV1陽性，4為檢測失敗或試紙卡失效。圖3是PCV2抗原亞型鑒定檢測結(jié)果圖。圖中，1為1768亞型PCV2，2為1766亞型PCV2， 3為1767亞型PCV2， 4為檢測失敗或試紙卡失效。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明進一步描述。PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡可應(yīng)用于豬PCV1和PCV2的鑒別 檢測以及PCV2抗原亞型鑒定。制備PCV2鑒別檢測和抗原亞型鑒定檢測試紙卡，首先需制備衣殼蛋白重組蛋白，進而制備抗衣殼蛋白單克隆抗體，篩選獲得識別PCV1和PCV2共同 抗原表位，PCV1型特異性抗原表位，1767亞型特異性抗原表位，以及1766和1767共同抗 原表位的單克隆抗體，其次需制備羊抗小鼠IgG多克隆抗體，分別用于制備PCV1和PCV2 鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的金標(biāo)玻璃棉，PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的PCV 檢測印跡T2， PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的PCV1檢測印跡Tl， PCV2亞型鑒定檢測試 紙卡的1767亞型檢測印跡Tl， PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的1766和1767亞型檢測印跡T2， 以及兩個試紙卡的對照印跡C。
實施例l衣殼蛋白重組蛋白的制備
用基因工程技術(shù)高效表達(dá)PCV1和PCV2衣殼蛋白，制備衣殼蛋白重組蛋白。根據(jù)PCV1 分離株(GenBankNo.AY193712)和1767PCV2分離株HZ0201(GenBankNo. AY188355)全基因序 列，分別設(shè)計PCV1和PCV2衣殼蛋白特異性引物，PCV1上游引物為PVlup: 5，-GCGGATCCACGGGTATCTTCAATTC-3，，含5a/nHI酶切位點，PCV1下游引物為PVldown: 5，國CCGCTCGAGTTATTTATTTAGAGGGTC-3'，含Wol酶切位點，PCV2上游引物為pGl: 5,-GCGGATCCAATGGCATCTTCAACAC-3，，含5awHI酶切位點；PCV2下游引物pG2: 5,-CCGCTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGG-3，，含Wol酶切位點。分別以PCV1和PCV2病 毒DNA為模板，擴增573bp和579bp的去核定位信號衣殼蛋白基因，反應(yīng)條件為95'C預(yù) 變性5min后，按95t: 30s，58或6rC 30s，72。C 45s進行30個循環(huán)，最后72'C再延伸10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)5flmHI和^oI雙酶切，分別連接到原核表達(dá)載體pET-28a和pGEX-4T-l的谷胱 甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)下游BamHI和^7wl位點間，轉(zhuǎn)化五.co/z'ToplO感受態(tài)細(xì)胞，涂布于 含100 g/mL卡那霉素(Kan)或氨芐青霉素(Amp)的LB平板，37'C培養(yǎng)16h,挑取單克隆菌 落，堿裂解法抽提重組質(zhì)粒，以PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，經(jīng)序列測定驗證鑒定。經(jīng)PCR 和酶切鑒定，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PCVl-dCap和pGEX-PCV2-dCap，其中PCV2衣殼蛋白 在N端與GST融合。分別將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PCVl-dCap和pGEX-PCV2-dCap轉(zhuǎn)化表達(dá)菌 ￡.co/Z BL21(DE3)和BL21 ，挑選單克隆接入5mL含100 g/mL Kan或Amp)的LB培養(yǎng) 基中，37°C、 250r/min振蕩培養(yǎng)10h，然后按1:100轉(zhuǎn)接500mL LB(100 g/mL Kan)或 2xYTA(100 g/mL Amp)的培養(yǎng)基，37°C 、 250r/min振蕩培養(yǎng)3h至A6(K)為0.6-0.8時，加入終 濃度為0.1 mmol/L的IPTG在37'C誘導(dǎo)表達(dá)4h， 4°C 4000r/min離心lOmin收集誘導(dǎo)表達(dá)菌 體。
利用QIAGEN公司的Ni-NTA親和純化柱，在變性條件下采用pH值梯度洗脫法純化 PCVl重組His-dCap蛋白，主要步驟如下將收集的菌體沉淀稱量，按8mL/g菌體沉淀的比 例重懸于緩沖液B(IOO mM NaH2P04,10 mM Tris*Cl， 8 M urea， pH8.0)中，在室溫下輕微振蕩 45 60min(避免氣泡產(chǎn)生)，400 W超聲波擊打30次，12000 rpm， 4。C離心30min，取上清加 入到含2mLNi-NTA填料的經(jīng)緩沖液B平衡的純化柱中，封閉純化柱，200 r/min, 37。C振蕩 30min，使重組蛋白和N產(chǎn)-NTA固相充分結(jié)合后，之后讓純化柱垂直放置，待Ni-NTA填料沉積后，將純化柱用10 mL緩沖液C(IOO mM NaH2P04, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea, 20 mM imidazol, pH6.3)洗脫2次后，再用10 mL buffer D( 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea， pH5.9)洗脫2次，最后用10 mL緩沖液E( 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris-Cl, 8 M urea, pH 4.5 ) 洗脫目的蛋白，收集洗脫液進行SDS-PAGE鑒定。采用BCA法測定純化His-dCap蛋白含量， 計算表達(dá)量。結(jié)果顯示，含pET-PCVl-dC叩重組質(zhì)粒的表達(dá)菌成功表達(dá)分子量為28kDa的 PCVlHis-dCap蛋白，其表達(dá)量為36mg/L培養(yǎng)物，可用于制備抗衣殼蛋白單克隆抗體。
采用GSTrap FF親和層析柱(Amersham公司)在天然條件下純化PCV2 GST-dCap蛋白， 主要步驟為按每毫升培養(yǎng)菌液加入50pL 4'C預(yù)冷的Binding buffer(140 mmol/L NaCl， 2.7 mmol/L KCl， 10 mmol/L Na2HP04， 1.8 mmol/L KH2P04， pH 7.3)將收集的細(xì)菌沉淀重新懸浮， 超聲波裂解破碎(0.2-0.3kw， 120次)直至菌液呈均一、半透明狀或云霧狀消失；加入終濃度為 1%的Triton X-100，冰上振蕩混勻30min， 4°C、 12000rpm離心30 min，取上清液進一步用 0.45 nm濾器過濾。取上清過用Binding buffer預(yù)平衡的GSTrap FF純化柱，流速為 0.5mL/min(中間不能引入氣泡)。用20-30倍柱床體積Binding buffer洗滌柱子(流速為1 mL/min)，用10倍柱床體積的Elution buffer(50 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L reduced glutathione, pH 8.0)洗脫(流速為1 mL/min)，或者用80U凝血酶(Thrombin)柱上酶解PCV2 GST-dCap融合蛋白，純化重組的dCap蛋白，用eppendorf管收集洗脫液，每管l.OmL，取樣 作SDS-PAGE分析，并用Bradford法測蛋白含量，計算表達(dá)量。結(jié)果顯示，含pGEX-PCV2-dCap 重組質(zhì)粒的表達(dá)菌成功表達(dá)分子量為48kDa的GST-dCap融合蛋白，其表達(dá)量為6.14 mg/L培 養(yǎng)物，可用于制備抗衣殼蛋白單克隆抗體。
實施例2抗衣殼蛋白單克隆抗體的制備與篩選
分別將重組PCV1和PCV2衣殼蛋白與弗氏佐劑等量混合，充分乳化，以50 g-100 g/ 只免疫BALB/c系小鼠3次，每次間隔15-30天；第3次加強免疫后3-4天，將免疫小鼠眼球 放血，拉頸致死，于75%酒精浸泡5-10min，無菌取其脾細(xì)胞；剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾， 1000r/min離心10min，收集脾細(xì)胞；將1X 108的脾細(xì)胞與2-5 X107的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞混合， 1000r/min離心lOmin，棄上清，在37。C的水浴中將0.7-lml的40%-50% PEG 4000 (pH8.5-9.0) 緩緩加入細(xì)胞，溫育lmin后，緩慢加入無血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG的作用，37 。C水浴5-10min， 1000r/min離心10min，棄上清，將細(xì)胞重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入 96孔培養(yǎng)板(IOO 1-200 1/孔)，置37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7-10天后，分別用 5 g-10 g/ml的PCVl和PCV2衣殼蛋白重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板，以ELISA檢測雜交 瘤的培養(yǎng)上清，挑取強陽性細(xì)胞克隆(OD49H).8以上)，經(jīng)連續(xù)3次的有限稀釋法克隆化，建 立雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞腹腔注射經(jīng)降植烷致敏一周的BALB/c系小鼠，每只小鼠注 射5xl()S個細(xì)胞，誘生小鼠腹水，制備抗衣殼蛋白單克隆抗體。所建立的25株雜交瘤細(xì)胞株 染色體數(shù)為92-98，其分泌的單克隆抗體特異識別PCV1和/或PCV2衣殼蛋白，與GST及其 它菌體蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)10-9，輕鏈亞型為K或X，重鏈亞型為IgGl，IgG2a，IgG2b或IgG3。
實施例3抗衣殼蛋白單克隆抗體的篩選
以間接免疫熒光(IFA)對所制備的25株抗衣殼蛋白單克隆抗體進行篩選和鑒定。分別將 PCV1分離株，1768PCV2分離株，1767PCV2分離株和1766PCV2分離株按1:10接種胰酶消化的 無PCV污染的PK-15細(xì)胞，將病毒細(xì)胞混合液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 nL， 37°C 5% C02培養(yǎng)96h，加入1:1混合的甲醇丙酮固定液100 pL， -20°(:固定20min。將固定液棄去， 自然干燥。用5%的脫脂奶粉封閉lh，每孔加入待檢雜交瘤細(xì)胞上清100 pL， 37t:孵育lh， PBST洗滌5次，加入1:400稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG 50 ^L， 37。C孵育40min， PBST 洗滌5次。加入50pLPBS，用倒置熒光顯微鏡觀察陽性細(xì)胞，篩選識別不同PCV基因型和 抗原亞型的單克隆抗體。經(jīng)IFA檢測和篩選，單克隆抗體3F6和4C3均能識別感染PK-15細(xì) 胞的PCV1 , 1768PCV2， 1767PCV2和1766PCV2病毒粒子，為識別PCV1和PCV2共同抗原表 位的單克隆抗體mAbl和mAb3，單克隆抗體3F11特異性識別感染PK-15細(xì)胞的PCV1病毒 粒子，而不與""PCV2， 1767PCV2和1766PCV2感染細(xì)胞反應(yīng)，為識別PCV1型特異性抗原表 位的單克隆抗體mAb2，單克隆抗體8A12僅特異性識別感染PK-15細(xì)胞的1767PCV2病毒粒 子，而不與其他三株病毒感染細(xì)胞反應(yīng)，為特異識別1767PCV2亞型單克隆抗體mAb4，單克 隆抗體6H9識別感染PK-15細(xì)胞的1767PCV2和1766PCV2病毒粒子，但不與m8PCV2和PCV1 感染細(xì)胞反應(yīng)，為識別1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的單克隆抗體mAb5，上述識別 PCV1和PCV2共同抗原表位，PCV1型特異性，1767PCV2亞型特異性，以及1766PCV2和 1767PCV2共同抗衣殼蛋白單克隆抗體分別用于制備PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒 定檢測的金標(biāo)玻璃棉，PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的檢測印跡T2， PCV1和PCV2鑒別檢 測試紙卡的檢測印跡T1，以及PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的1767亞型檢測印跡T1， PCV2 亞型鑒定檢測試紙卡的1767亞型和1766亞型檢測印跡T2的印制。
實施例4抗衣殼蛋白單克隆抗體識別抗原表位的鑒定
以合成多肽分析鑒定抗衣殼蛋白單克隆抗體識別的抗原表位。根據(jù)PCV2 HZ0201衣殼 蛋白的氨基酸序列，設(shè)計由18肽組成的氨基酸重疊多肽片段，每條肽之間重疊8個氨基酸， 移位10個氨基酸(aa)，跨越PCV2衣殼蛋白氨基酸位25-233(未包含核定位信號NLS中的前 24個氨基酸)，共計20條肽，于每條肽N端加一半胱氨酸Cys，用于載體蛋白偶聯(lián)，所設(shè)計 多肽由上海波泰生物技術(shù)有限公司合成，每條合成多肽10mg，純度大于90%，凍干保存。
用無菌的蒸餾水或去離子水、無氧水溶解凍干多肽，濃度為lmg/ml，應(yīng)用異型雙功能試 劑Sulfo-SMCC(分子量436.37，美國Pierce公司產(chǎn)品)通過多肽N端Cys上的-SH基團與載體 蛋白牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)，步驟為I)稱量4mg BSA,溶于500n偶聯(lián)緩沖液(O.l M phosphate, 0.15MNaCl， lmMEDTA， pH7.2); 2)加入lmg Sulfo-SMCC于載體蛋白溶液； 3)RT孵育60min或37'C孵育30min，并不時混勻；4)對偶聯(lián)緩沖液充分透析，以除去多余的偶聯(lián)劑，用偶聯(lián)緩沖液調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml; 5)取20^1(1 OOpg) Sulfo-SMCC活化的載 體蛋白，加入N末端含Cys的溶解多肽10(Hig，充分混勻，于4'C孵育4h或過夜，完成偶聯(lián) 反應(yīng)，4'C保存?zhèn)溆谩?br> 采用Peptide-ELISA分析抗衣殼蛋白單克隆抗體識別的抗原表位。以50mMTris-HCl緩沖 液(pH8.6)作包被液稀釋BSA偶聯(lián)多肽至lpg/ml，包被96孔酶標(biāo)板，每孔10(Hd， 4'C孵育過 夜，PBST洗滌3次；用5X的脫脂奶PBS封閉酶標(biāo)板，200pl/孔，37。C封閉3h， PBST洗滌 3次；加入用5%的脫脂奶1:500-1000稀釋的抗衣殼蛋白單克隆抗體，100^1/孔，重復(fù)3個孔， 37'C孵育1.5h， PBST洗滌6次；加入1:10000稀釋的HRP羊抗鼠IgG， 100(al/孔，37。C孵育 lh， PBST洗滌6次；加入TMB顯色溶液100nl，室溫孵育10min，觀察顯色結(jié)果，每孔加 入50pl 2M硫酸溶液終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取450nm吸收值。對于Peptide-ELISA陽性多 肽，進一步設(shè)計合成系列截短多肽，偶聯(lián)于載體蛋白BSA，同上以Peptide-ELISA分析截短 多肽與相應(yīng)單克隆抗體的反應(yīng)性，精確定位所獲得抗衣殼蛋白單克隆抗體識別的抗原表位。 合成多肽的抗原表位分析結(jié)果表明，單克隆抗體mAbl識別的PCV1和PCV2共同抗原表位 為PCV1和PCV2衣殼蛋白的156YHSRYFT162，單克隆抗體mAb2識別的PCV1型特異性抗 原表位為PCV1衣殼蛋白的92LPFQYYRIRKVK1()3，單克隆抗體mAb3識別的PCV1和PCV2 共同抗原表位為PCV1和PCV2衣殼蛋白的175QPNNKRNQLWLRLQTAGN192，單克隆抗體 mAb4識別的，PCV2亞型特異性抗原表位為PCV2衣殼蛋白C末端226LKDPPLNP233，是 1767PCV2新的血清學(xué)標(biāo)志，單克隆抗體mAb5不能識別PCV2衣殼蛋白的任何一條合成多肽， 表明該單克隆抗體識別的1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位為構(gòu)象型抗原表位。
實施例5抗小鼠IgG多克隆抗體的制備
采取小鼠血液，分離血清，以辛酸-硫酸銨法粗提小鼠血清IgG，并用Superdex200凝膠 層析進行純化。首先用4倍血清體積的0.06MpH4.8醋酸緩沖液稀釋血清，以lMNaOH調(diào) pH至4.5;在室溫下邊攪拌邊逐滴加入辛酸，每毫升血清加入25 辛酸，4。C靜置2h， 12000 r/min離心30 min，取上清；在溶液中加10倍體積磷酸鹽緩沖液PBS，用5 M NaOH調(diào)pH 至7.4，冰浴至4°C;按每毫升混合液加0.277 g硫酸銨并攪拌30 min， 4'C靜置4h， 12000 r/min 離心30min，棄上清；沉淀以0.05MPBS pH7.4重懸于，透析除鹽，直至用BaCl2檢測無 白色沉淀為止，用PEG8000進行濃縮。利用GE公司AKAT purifier蛋白純化系統(tǒng)以Hiload 16/60 Superdex 200 prep pg凝膠過濾預(yù)裝柱純化粗提的小鼠IgG。用0.22|im濾器過濾粗提的 小鼠血清IgG溶液，并經(jīng)超聲波除氣；將Hiload 16/60 Superdex 200 prep pg凝膠過濾預(yù)裝柱 與AKAT purifier蛋白純化系統(tǒng)相連接，先用ddH20清洗柱子，接著用含0.15MNaCl的0.05M 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH8.0)平衡柱子，流速為2 mL/min，直至UV280的吸光值和電導(dǎo)值基線 穩(wěn)定，平衡柱子時要清洗各閥位。將過濾的豬血清IgG樣品用注射器(上樣前注意排空注射器 里的氣泡，以免損害柱子)注入樣品環(huán)中，設(shè)置洗脫速度和報警壓，進行上樣和洗脫，流速為 lmL/min。觀察UV280值基線的變化，收集紫外吸收峰的洗脫峰，每管收集2mL， SDS-PAGE電泳檢測脫蛋白，合并收集液，裝入透析袋，放入PEG8000中濃縮，用Nanodrop 1000分光 光度儀測OD28Q和OD26o吸光值，并根據(jù)公式計算IgG含量蛋白含量 (mg/mL"(1.45xOD28o-0.74xOD26o)x稀釋倍數(shù)，測得小鼠IgG的蛋白含量為12.0mg/mL，用于
羊抗小鼠IgG多克隆抗體的制備。 —
以50~10(Hig/kg體重的小鼠IgG蛋白加弗氏佐劑充分乳化，經(jīng)皮下和肌肉注射免疫健康 山羊3 4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上時， 心臟采血或頸動脈放血，收集高免血清；以辛酸-硫酸銨法粗提免疫山羊血清IgG，并用 Superdex 200凝膠層析進行純化，不重述。所制備的抗小鼠IgG多克隆抗體用于PCVl和PCV2 鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡對照印跡的印制。
實施例6金標(biāo)玻璃棉的制備
以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在沸騰的50-100ml 0.01-0.05%氯金酸水溶液中加入 2-4ml的0.5-2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的膠體金。以O(shè).lmol/L &(:03調(diào)膠體 金pH至8.5-9.5，以1:1000-1:1300的標(biāo)記比將待標(biāo)記的單克隆抗體mAbl加入pH8.5-9.5金 溶膠中，標(biāo)記lOmin后，力[]20% PEG 10000至終濃度0.05%， 4°C 1500-3000g離心20min, 除去未結(jié)合的金顆粒，4°C 15000g離心lh，棄上清，獲初步純化金標(biāo)蛋白混合物后，用丙烯 葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得膠體金標(biāo)記的抗PCV2衣殼蛋白單克隆抗體。 將1:100-1:1500稀釋的膠體金標(biāo)記蛋白吸附于精制玻璃棉中，4'C低溫真空干燥，制備PCVl 和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的金標(biāo)玻璃棉。
實施例7 PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的實施結(jié)構(gòu) PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的實施結(jié)構(gòu)參見圖1，圖中，1為 支撐層用不吸水薄片條，實施中可采用塑膠薄片條或采用不吸水的硬質(zhì)紙片材，反應(yīng)試劑載 體吸附層由2， 3， 4， 5，組合而成，從樣品端2開始，到手柄端5依次粘貼在支撐層l上面； 其中2為樣品端纖維層，實施中可使用玻璃纖維棉簡稱玻璃棉，3為吸附金標(biāo)蛋白的纖維層， 金標(biāo)蛋白為膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAM， 可采用精制玻璃纖維棉，簡稱為金標(biāo)玻璃棉，4為纖維素膜層，實施中可采用硝酸纖維素膜， 5為手柄端吸水材料層，釆用吸水紙，如濾紙或其它吸水紙均可，2， 3, 4， 5各層彼此之間 交界處纖維互相交叉滲透;PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的6為用識別PCV1型特異性抗原 表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb2溶液在纖維素膜上印制的PCV1檢測印跡Tl " I "， 7 為用識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb3溶液印制的PCV檢測 印跡T2 " I "， PCV2亞型鑒定檢測試紙卡的6為識別1767 PCV2亞型特異性抗原表位的抗衣 殼蛋白單克隆抗體mAb4溶液在纖維素膜上印制的1767亞型檢測印跡T1 " | "， 7為用識別 1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb5溶液印制的1766和1767 亞型檢測印跡T2" I "， 8為用抗小鼠IgG多克隆抗體pAb溶液印制的對照印跡C" I "，在纖維素膜上的檢測印跡T1，檢測印跡T2和對照印跡C組合排列為"I I l"，9為樣品溶液 的加樣孔，IO為塑料卡，ll為樣品端，12為手柄端。
實施例8 PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡實施檢測的反應(yīng)原理 PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的反應(yīng)原理為待檢測樣品溶液加入樣品孔后，待檢溶液 通過虹吸帶動待檢抗原與金標(biāo)蛋白一起向硝酸纖維素膜擴散，并最終滲透到濾紙層中，在擴 散過程中PCV1或PCV2病毒抗原與膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣 殼蛋白單克隆抗體mAbl相結(jié)合，形成金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合物，該復(fù)合物可與檢測印跡Tl中 的識別PCV1型特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb2相結(jié)合，生成紅棕色"I " 標(biāo)記，同時也可與檢測印跡T2中的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗 體mAb3結(jié)合，生成另一條紅棕色"I "標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)蛋白不能與檢測印 跡結(jié)合而繼續(xù)擴散，在纖維膜上與對照印跡C中的抗小鼠IgG多克隆抗體pAb結(jié)合，生成紅 棕色標(biāo)記"I "，三種標(biāo)記組合疊加，形成三條紅棕色陽性標(biāo)記"111"，代表樣品為PCV1 病毒陽性；同理，樣品中的PCV2病毒抗原與膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表 位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAbl相結(jié)合形成金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合物，但該復(fù)合物不能與檢測 印跡Tl中的識別PCV1型特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb2結(jié)合，不能形成紅 棕色標(biāo)記，復(fù)合物繼續(xù)擴散與檢測印跡T2中的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋 白單克隆抗體mAb3相結(jié)合，生成紅棕色"I "標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)蛋白不能與 檢測印跡結(jié)合而繼續(xù)擴散，在纖維膜上與對照印跡C中的抗小鼠IgG多克隆抗體pAb結(jié)合， 生成紅棕色標(biāo)記"I "，從而形成兩條紅棕色陽性標(biāo)記"I I "，代表樣品為PCV2病毒陽性， 而PCV1病毒陰性；如果樣品溶液中既不含PCV1病毒，又不含PCV2病毒，則沒有金標(biāo)蛋 白-抗原復(fù)合物形成，不能與檢測印跡T1或T2結(jié)合，只有金標(biāo)蛋白與對照印跡C相結(jié)合， 生成一條紅棕色標(biāo)記"I "，代表樣品為PCV1和PCV2病毒陰性。如果纖維素膜上沒有紅棕 色標(biāo)記顯現(xiàn)，則表明檢測失敗或PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡失效。
PCV2亞型鑒定檢測試紙卡檢測的反應(yīng)原理為待檢測樣品溶液加入樣品孔后，待檢溶 液通過虹吸帶動待檢抗原與金標(biāo)蛋白一起向硝酸纖維素膜擴散，并最終滲透到濾紙層中，在 擴散過程中PCV2病毒抗原與膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白 單克隆抗體mAbl相結(jié)合，形成金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合物，1767PCV2形成的復(fù)合物與檢測印跡 Tl中的識別i^PCV2亞型特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb4相結(jié)合，生成紅棕 色"I"標(biāo)記，同時也與檢測印跡T2中的識別1766PCV2和1767PCV2共同抗原表位的抗衣殼 蛋白單克隆抗體mAb5結(jié)合，生成另一條紅棕色"I "標(biāo)記，部分未與抗原結(jié)合的金標(biāo)蛋白 不能與檢測印跡結(jié)合而繼續(xù)擴散，在纖維膜上與對照印跡C中的抗小鼠IgG多克隆抗體pAb 相結(jié)合，生成紅棕色標(biāo)記"I "，三種標(biāo)記組合疊加，形成三條紅棕色陽性標(biāo)記"III "， 代表樣品中PCV2病毒的抗原亞型為1767亞型；同理，,PCV2形成的金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合 物不能與檢測印跡T1中的識別，PCV2亞型特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb4識別，不能形成紅棕色標(biāo)記，復(fù)合物繼續(xù)擴散與檢測印跡T2中的識別1766PCV2和1767PCV2 共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb5相結(jié)合，生成紅棕色"I "標(biāo)記，部分未與抗 原結(jié)合的金標(biāo)蛋白不能與檢測印跡結(jié)合而繼續(xù)擴散，在纖維膜上與對照印跡C中的抗小鼠IgG 多克隆抗體pAb結(jié)合，生成紅棕色標(biāo)記"I "，從而形成兩條紅棕色陽性標(biāo)記"I I "，代表 樣品中PCV2病毒的抗原亞型1766亞型；而1768PCV2形成的金標(biāo)蛋白-抗原復(fù)合物既不能與 檢測印跡Tl中的識別1767PCV2亞型特異性抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體mAb4結(jié)合， 也不能與檢測印跡T2中的識別n^PCV2和吣PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體 mAb5識別，因此兩條檢測印跡均不能形成紅棕色檢測標(biāo)記，只能形成一條對照印跡C標(biāo)記 "I "，代表樣品中PCV2病毒的抗原亞型為1768亞型。如果纖維素膜上沒有紅棕色標(biāo)記顯 現(xiàn)，則表明檢測失敗或PCV2分型試紙卡失效。
實施例9 PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡檢測的實例操作方法
采集待檢豬淋巴結(jié)或脾臟，以樣品稀釋液或生理鹽水1:5倍稀釋，充分研磨，制備樣品 溶液。取50pl樣品溶液分別加入PCV1和PCV2鑒別檢測和PCV2亞型鑒定檢測試紙卡，水 平放置約2-5分鐘，檢測結(jié)果見圖2和圖3。 PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡的顯現(xiàn)一條紅棕 色標(biāo)記"I "為PCV陰性，顯現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記"I I "為PCV2陽性而PCV1陰性，顯現(xiàn) 三條紅棕色標(biāo)記"I I I"為PCV1陽性，如果PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡沒有標(biāo)記顯 示，則表明檢測失敗或試紙卡失效(圖2);當(dāng)PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡顯現(xiàn)兩條紅棕色 標(biāo)記"I I "時，PCV2亞型鑒定檢測試紙卡顯現(xiàn)一條紅棕色標(biāo)記"I "表示PCV2的抗原亞 型為1768亞型，顯現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記"I I"表示PCV2的抗原亞型為1766亞型，顯現(xiàn)三 條紅棕色標(biāo)記"l i I"表示PCV2的抗原亞型為1767亞型，如果PCV2分型試紙卡沒有標(biāo) 記顯示，則表明檢測失敗或試紙卡失效(圖3)。序列表 <110>浙江大學(xué)
<120>豬圓環(huán)病毒PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡
<160> 4
<210> 1
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<223> PCV1上游引物PVlup
<400> 1
GCGGATCCAC GGGTATCTT CAATTC
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223> PCV1下游引物PVldown
<400> 2
CCGCTCGAGT TATTTATTTA GAGGGTC
<210〉3
<211〉25
〈212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉PCV2上游引物pGl
〈400〉3
GCGGATCC AA TGGCATCTTC AACAC
<210>4
〈211〉25
<212〉DNA
〈213〉人工序列
〈223〉PCV2下游引物pG2
〈400〉4
CCGCTCGAGT TAAGGGTTAA GTGGG
權(quán)利要求
1.PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡，包括用不吸水薄片條制成的支撐層(1)，反應(yīng)試劑載體吸附層固定在支撐層(1)上，從樣品端(11)到手柄端(12)的反應(yīng)試劑載體吸附層依次為纖維層(2)，金標(biāo)纖維層(3)，纖維素膜層(4)和吸水材料層(5)，其特征在于金標(biāo)纖維層(3)為吸附膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體的金標(biāo)玻璃棉，纖維素膜層(4)為從樣品端(11)至手柄端(12)依次印制檢測印跡T1(6)、檢測印跡T2(7)和對照印跡C(8)的硝酸纖維素膜，試紙卡固定在塑料卡(10)內(nèi)，在樣品端(11)設(shè)有加樣孔(9)；檢測印跡T1(6)為以識別PCV1型特異性抗原表位的單克隆抗體溶液在纖維素膜上印制的條狀PCV1檢測印跡；檢測印跡T2(7)為以識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體溶液印制的條狀PCV檢測印跡，對照印跡C(8)為以抗小鼠IgG多克隆抗體溶液印制的條狀對照印跡，上述3條印跡按序平行排列。
全文摘要
PCV1和PCV2鑒別檢測試紙卡適用于豬PCV2感染快速鑒別檢測。其反應(yīng)試劑載體吸附層包括纖維層，金標(biāo)纖維層，纖維素膜層和吸水材料層；金標(biāo)纖維層為吸附膠體金標(biāo)記的識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體的金標(biāo)玻璃棉，纖維素膜層為依次印制檢測印跡T1、T2和對照印跡C的硝酸纖維素膜；檢測印跡T1為識別PCV1型特異性抗原表位的單克隆抗體溶液印制的條狀PCV1檢測印跡；T2為識別PCV1和PCV2共同抗原表位的抗衣殼蛋白單克隆抗體溶液印制的條狀PCV檢測印跡，對照印跡C為抗小鼠IgG多克隆抗體溶液印制的條狀對照印跡。試紙卡特異性強，敏感性高，簡便快速，檢測結(jié)果形象直觀，在生產(chǎn)實踐中易于推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N33/577GK101408548SQ20081016244
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者周繼勇, 商紹彬, 金玉蘭, 焰 顏 申請人:浙江大學(xué)