專利名稱：毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于殘留農(nóng)藥檢測領域，涉及一種適用于同時針對殘留毒死蜱和甲 基對硫磷進行分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體 及通用包被抗原的制備。 背景技術：
農(nóng)藥及其代謝物傳統(tǒng)的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)、高效液相 色譜(HPLC)、質(zhì)譜(MS)等物理化學分析手段，但由于農(nóng)藥使用規(guī)模不斷擴大， 農(nóng)藥殘留造成環(huán)境影響和人類健康的慢性和長期效應日益受到人們關注和擔 憂，對農(nóng)藥殘留的限制也越來越嚴格，對分析測定對象、種類、數(shù)量、范圍、 指標等諸方面都提出了新的要求和更高的標準，但傳統(tǒng)的理化分析方法通常繁 瑣復雜，工作量大，儀器昂貴，并要有熟練的技術人員及較長的分析周期。因 此人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及廉價的檢測技術能在野外和實驗室 內(nèi)進行大批量的檢測應用。免疫分析法正具備這些優(yōu)點，所以盡管將免疫分析 用于農(nóng)藥殘留分析的時間很短，仍然很快用于環(huán)境樣品和食品樣品中農(nóng)藥殘留 的分析。
毒死蜱(Chlorpyrifos)，自1965年由美國Dow公司開發(fā)推廣后即作為 一種廣 譜性高效殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)廣泛應用于糧食、棉花等經(jīng)濟作物的多種害蟲 防治，并且對地下害蟲、家畜害蟲以及衛(wèi)生害蟲也有很好的防治效果。但是由 于毒死蜱對人畜的毒性相當高，近年來，因毒死蜱中毒的報道，仍然屢見不鮮。 尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，對人體健康造成極大的危害，這已引起人 們的關注。甲基對硫磷(Parathion-methyl)由1944年德國希拉臺爾(G.Schrader) 化學家首先合成，1949年拜爾公司首先建廠生產(chǎn)，嗣后世界各地大量有多家公 司相繼投產(chǎn)，上世紀60年代之后我國產(chǎn)、用量都很大。甲基對硫磷作為一種廣 譜性高效殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)廣泛應用于糧食、棉花等經(jīng)濟作物的害蟲防治。 但是由于甲基對硫磷對人畜劇毒，因甲基對硫磷中毒的報道，屢見不鮮，目前 我國雖然已經(jīng)禁止生產(chǎn)和使用甲基對硫磷。開發(fā)一種簡單快速同時適用于毒死 蜱和甲基對硫磷農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。
檢測毒死蜱和甲基對硫磷殘留量常規(guī)方法為高效液相色譜法等。然而該方 法的靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，且該方法需要昂貴的儀器， 且過程繁瑣，不適合大批量樣品的檢測與分析。免疫分析為毒死蜱和甲基對硫 磷的殘留檢測提供了一個新的分析檢測途徑。目前的文獻和專利公開'了用于分析殘留毒死蜱的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒或分析殘留甲基對硫磷的酶聯(lián)免疫吸 附測定試劑盒及其制備方法，而現(xiàn)有技術中沒有同時分析殘留毒死蜱和甲基對 硫磷的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒及其制備方法的技術。
本發(fā)明正是針對這一空白，經(jīng)過發(fā)明人長時間的實驗和測試，得到了適用 于同時分析殘留毒死蜱和甲基對硫磷的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的關鍵原料毒 死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原的制備技術。使用本發(fā)明的毒死蜱
和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備的同時分析殘留毒死蜱和甲基對硫 磷的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒保質(zhì)期不低于1年，對殘留毒死蜱和甲基對硫磷
在蔬菜中的最低檢出濃度分別為12.0、 10.0ng/ml。
發(fā)明內(nèi)容要解決的問題
本發(fā)明的目的是提供一種毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原的 制備技術。
本發(fā)明的另一目的是本發(fā)明所制備的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用 包被抗原可以用于制備同時分析殘留毒死蜱和甲基對硫磷的酶聯(lián)免疫吸附測定 試劑盒。
毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原同時和牛血清白蛋白反應制備 毒死蜱和甲基對硫磷通用人工抗原是本發(fā)明的重要特征之一。
毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原同時和卵清蛋白反應制備毒死 蜱和甲基對硫磷通用包被抗原是本發(fā)明的另一重要特征。技術方案
毒死蜱和甲基對硫磷通用人工抗原制備毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷 人工半抗原同時和牛血清白蛋白反應，同時發(fā)生如下兩個反應
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操作步驟計算量的人工半抗原、三正丁胺分別溶于DMF中的兩混合物a 和b，將b加于a中得混合物c。將溶解有氯甲酸異丁酯的DMF溶液于4'C滴到c中，反應l小時得d。將計算量牛血清白蛋白溶于定量PH-8.7、 0.05M的 硼酸鹽緩沖溶液中，然后于18。C以下將d滴加其中，室溫反應12小時。所得反 應液裝入透析袋，于PH-7.4、 O.OIM緩沖溶液中4'C條件透析至透析液中檢不 出半抗原紫外吸收(OD282 ),精確量取透析后的蛋白質(zhì)溶液體積，測定蛋白質(zhì)濃 度和結合比為40~50，分裝，-2(TC保存。
毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原制備將毒死蜱和甲基對硫磷通用人工 抗原制備中的牛血清白蛋白換成卵清蛋白并且減半使用，用相同的操作方法即 可制得毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原，結合比為20~30，分裝，-2(TC保 存。
毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體的制備
將人工合成的毒死蜱和甲基對硫磷免疫原(即毒死蜱人工半抗原和甲基對硫 磷人工半抗原與牛血清白蛋白結合形成的偶聯(lián)物(CBRH-BSA))多次注射新西蘭 兔刺激其體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能對毒死蜱和甲基對硫磷農(nóng)藥分子或毒死蜱和甲基 對硫磷包被原(毒死蜱和甲基對硫磷半抗原與卵清蛋白人工合成的偶聯(lián)物 (CBRH-OVA))特異性識別結合的免疫球蛋白(IgG)。
一、 免疫原的選擇和制備
1、 選擇毒死蜱和甲基對硫磷半抗原與載體蛋白結合比在40-50的偶聯(lián)物作 免疫原。
2、 弗氏佐劑的制備石蠟油與羊毛脂3: 1混勻濕熱高壓滅菌得弗氏不完 全佐劑。在弗氏不完全佐劑中按規(guī)2mg/ml加卡介苗凍干粉混勻得弗氏完全佐劑。
3、 佐劑免疫原的制備將免疫原溶液慢慢解凍，用生理鹽水稀釋至 3mg/ml(以載體蛋白計)按免疫劑量吸入適當容積于注射器中，且免疫原與佐劑以 1: 1(V/V)混合，后以用無菌橡膠管相連的兩支5ml滅菌玻璃注射器(總體積不超 過4ml)交替推動，使佐劑與免疫原溶液充分混合乳化，形成油包水乳液，直至 滴入冰水中暫不擴散為止。
二、 免疫方案
選用健康純白新西蘭雄兔(體重約1.5kg左右)作為免疫動物。注射前耳靜脈 采血制備少時對照血清(l-2ml),低溫貯藏備用。然后將上述已制備好的佐劑免 疫原用背部皮內(nèi)多點注射法注射，以20-25點左右小劑量注射入兔體內(nèi)，總共注 射7次，時間間隔第一次與第二次為4個周，其后每次的時間間隔為2周。四 免后7-10天，耳緣靜脈采血制備少量抗血清，以陰性血清作對照，用瓊脂雙擴 散法和間接ELISA法檢測血清效價。待瓊擴散效價達1: 16以上，以間接ELISA 法測定抗血清終點效價達大于10萬，中點效價大于2萬。頸動脈全采血(無菌)制備抗血清于-2(TC凍存。 三、抗體的純化
1、 硫酸銨鹽法(1)50ml燒杯中，X毫升血清+Xml生理鹽水，置于電磁攪 拌器上。(2)緩慢滴入2X毫升飽和硫酸銨(PH7.0),使達到50%的飽和度?？刂?攪拌速度不出氣泡。滴加完畢，繼續(xù)攪拌5分鐘。(3)室溫放置30分鐘。(4)離心 3000轉/分x20分鐘。(5)棄去上清液，沉淀物溶于2X亳升生理鹽水，逐滴加飽 和硫酸銨Xml使達33。/。飽和度。(6)室溫放置M分鐘。(7)棄去上清液，將沉淀 物溶于2亳升生理鹽水，裝透析袋，置4nC冰箱0.01MPH7.0PB緩沖液透析， 換液數(shù)次，每次換液時用納氏試劑檢查NH";至不出現(xiàn)黃色沉淀為止。
2、 DEAE纖維素柱層析法(l)DEAE預處理(2)裝柱、加樣和洗脫(3)合并、 濃縮、測蛋白。
3、 免疫球蛋白(IgG)濃度的測定將純化后的抗體溶液用生理鹽水稀釋適當
倍數(shù)后測OD28Q，按下式計算兔IgG含量
OD280
IgG% = - x稀釋倍數(shù)
13.5
4、 抗體的純度鑒定快速染色聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為6.5% 。
酶標抗體的制備(釆用改良過碘酸鈉法)
具體操作如下稱5-10mgHRP溶解于lml蒸錮水中，于上液中加入0.2-0.4mL 新配的0.1mol/LNalO4溶液，室溫下避光攪拌15-30分鐘。將上述溶液裝入透析 袋中，用lmmol/LpH4.4的醋酸鹽緩沖液透析，4'C過夜。加20-40uL0.2mol/LpH9.5 碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入l-2ml含 有10-20mg純化抗體的0.01mol/L碳酸鹽緩沖液，室溫避光輕輕攪拌2 ~ 3小時。 加0.14).2mL新配的4mg/mLNaBH4液，混勻，再置4。C2-3小時。將反應液裝 入透析袋中，用0.15mol/LpH7.4PBS透析，4'C過夜。在攪拌下逐滴加入等體積 飽和硫酸銨溶液，置4。C1 2小時。3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半 飽和硫酸銨溶液洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4'C的PBS中。將 上述溶液裝入透析袋中，對0.15mol/LpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子 后(用萘氏試劑檢測)，10,000-12,000rpm離心30分鐘，上清液即為酶結合物，用 等量甘油分裝后，分別于-4X:、 -20°(:保存。經(jīng)直接ELISA法(E-Ab法)測定，效 價為62000。有益效果本發(fā)明的優(yōu)點是應用本發(fā)明毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體制備的試劑盒， 能用于水樣、土壤、中毒樣品、蔬菜等食品中毒死蜱和甲基對硫磷殘留的同時 檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本遠低于 傳統(tǒng)的檢測方法。試劑盒釆用強特異性、高效價的抗體，提高檢測的靈敏度、
準確度、精密度。試劑盒的保存期超過12個月。本發(fā)明簡單快速，適用于農(nóng)藥
殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法，具有重要的現(xiàn)實意義。 具體實施例方式
以下用實施例對本發(fā)明作進一步說明
人工抗原制備d毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原60mg、 72mg 溶于5.0mlDMF中。e三正丁胺0.2mL溶于5.0mlDMF中，e加于d中得f。氯 甲酸異丁酯0.16mL溶于10mLDMF中，4。C滴加到f中，反應1小時得g。牛血 清白蛋白120mg溶于60mLPH-8.7、 0.05M的硼酸鹽緩沖溶液中，然后于18°C 以下將g滴加其中，室溫(~20°C)反應12小時。所得反應液裝入透析袋，于 PH = 7.4、 0.01M緩沖溶液中4'C條件透析60小時，每8小時換一次PBS透析 液，每次1L。至透析液中檢不出半抗原紫外吸收(OD282 )。精確量取透析后的 蛋白質(zhì)溶液體積，測定蛋白質(zhì)濃度和結合比為46,分裝，-2(TC保存。
人工包被抗原制備d毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原60mg、 72mg溶于5.0mlDMF中。e三正丁胺0.2mL溶于5.0mlDMF中，e加于d中得f。 氯甲酸異丁酯0.16mL溶于10mLDMF中，4'C滴加到f中，反應l小時得g。卵 清蛋白240mg溶于60mLPH-8.7、 0.05M的硼酸鹽緩沖溶液中，然后于18。C以 下將g滴加其中，室溫( 20'C)反應12小時。所得反應液裝入透析袋，于PH =7.4、 O.OIM緩沖溶液中4'C條件透析60小時，每8小時換一次PBS透析液， 每次1L。至透析液中檢不出半抗原紫外吸收(OD282 )。精確量取透析后的蛋白 質(zhì)溶液體積，測定蛋白質(zhì)濃度和結合比為25，分裝，-20°(:保存。
權利要求
1. 一種適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備，其特征在于，毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原以一定比例與牛血清白蛋白結合制得通用人工抗原，按照常規(guī)方法使用新西蘭白兔免疫制備毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體，毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原以一定比例與卵清蛋白結合按照常規(guī)方法制備毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原。
2. 根據(jù)權利要求1的通用毒死蜱人工抗原和甲基對硫磷人工抗原，其特征 在于毒死蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原和牛血清白蛋白通過如下重量 比例反應制備毒死蜱人工半抗原甲基對硫磷人工半抗原牛血清白蛋白-87mg: 72mg: 120mg毒死蜱人工半抗原和甲基對硫磷人工半抗原化學結構如下毒死蜱人工半抗原 甲基對硫磷人工半抗原
3. 根據(jù)權利要求1的毒死蜱和甲基對硫磷通用包被抗原，其特征在于毒死 蜱人工半抗原、甲基對硫磷人工半抗原和卵清蛋白通過如下重量比例進行反 應制備毒死蜱人工半抗原甲基對硫磷人工半抗原卵清蛋白-87mg: 72mg: 240mg
4. 根據(jù)權利要求1所述的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原， 其特征在于該通用抗體及通用包被抗原用于制備同時分析毒死蜱和甲基對硫 磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備，它包括毒死蜱人半工抗原和甲基對硫磷人工半抗原結構以及毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原制備方法。本發(fā)明制備的毒死蜱和甲基對硫磷通用抗體及通用包被抗原可用于制備適用于同時分析毒死蜱和甲基對硫磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，該試劑盒能用于水、土壤、蔬菜等食品中及中毒樣品中毒死蜱殘留和甲基對硫磷的快速檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本低于傳統(tǒng)的檢測方法。
文檔編號G01N33/531GK101477115SQ20081018348
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者孫家隆 申請人:孫家隆