專利名稱：同時分析多種有機(jī)磷的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時適用于針對殘留多種有機(jī)磷進(jìn)行分析的酶聯(lián)免疫吸附 測定試劑盒，該試劑盒主要適用于快速測定批量的水樣、土壤等環(huán)境樣品和中 毒樣品及蔬菜等食品樣品中的多種有機(jī)磷殘留。屬于殘留農(nóng)藥檢測領(lǐng)域。 背景技術(shù)：
農(nóng)藥及其代謝物傳統(tǒng)的殘留分析方法主要是依靠氣相色譜(GC)、高效液相 色譜(HPLC)、質(zhì)譜(MS)等物理化學(xué)分析手段，但由于農(nóng)藥使用規(guī)模不斷擴(kuò)大， 農(nóng)藥殘留造成環(huán)境影響和人類健康的慢性和長期效應(yīng)曰益受到人們關(guān)注和擔(dān) 憂，對農(nóng)藥殘留的限制也越來越嚴(yán)格，對分析測定對象、種類、數(shù)量、范圍、 指標(biāo)等諸方面都提出了新的要求和更高的標(biāo)準(zhǔn)，但傳統(tǒng)的理化分析方法通常繁 瑣復(fù)雜，工作量大，儀器昂貴，并要有熟練的技術(shù)人員及較長的分析周期。因 此人們迫切希望有一種簡單、快速、靈敏及廉價的檢測技術(shù)能在野外和實驗室 內(nèi)進(jìn)行大批量的檢測應(yīng)用。免疫分析法正具備這些優(yōu)點，所以盡管將免疫分析 用于農(nóng)藥殘留分析的時間很短，仍然很快用于環(huán)境樣品和食品樣品中農(nóng)藥殘留 的分析。
多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥為廣譜性高效殺蟲劑，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用于糧食、棉 花等經(jīng)濟(jì)作物的多種害蟲防治，并且對地下害蟲、家畜害蟲以及衛(wèi)生害蟲也有 很好的防治效果。但是由于很多有機(jī)磷農(nóng)藥品種對人畜的毒性相當(dāng)高，近年來， 因有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的報道，仍然屢見不鮮。尤其是在作物和蔬菜上的大量使用， 對人體健康造成極大的危害，這已引起人們的關(guān)注。因此，開發(fā)一種簡單快速 適用于多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。
檢測有機(jī)磷殘留量常規(guī)方法為高效液相色譜法等，該方法的靈敏度受樣品 的凈化、濃縮等步驟的影響很大，且該方法需要昂貴的儀器，且過程繁瑣，不 適合大批量樣品的檢測與分析。免疫分析為有機(jī)磷的殘留檢測提供了一個新的 分析檢測途徑。要將免疫分析方法運(yùn)用到實際中，則需要將其制備成試劑盒。 現(xiàn)有技術(shù)公開了多種試劑盒，其中包括了檢測多種有機(jī)磷殘留物的試劑盒及其 制備方法。而現(xiàn)有技術(shù)中沒有關(guān)于方便同時檢測多種有機(jī)磷的酶聯(lián)免疫吸附測 定試劑盒技術(shù)。
本發(fā)明正是針對這一空白，經(jīng)過發(fā)明人長時間的實驗和測試，得到了一種 適用于同時針對多種有機(jī)磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容要解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測多種有機(jī)磷殘留的酶聯(lián)免疫吸附測定試 劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種具有高特異性、高靈敏度，操作方法簡單快 速，并能用于大批量樣品同時快速檢測殘留多種有機(jī)磷的試劑盒。對殘留多種 有機(jī)磷如甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫嫌、乙酰甲胺磷、樂果、馬拉硫磷等農(nóng)
藥在蔬菜中的最低檢出濃度分別為6.0、 10.0、 13.0 、 12.0、 10.0、 16.0ng/ml。技術(shù)方案
本發(fā)明涉及一種同時用于多種有機(jī)磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑 盒，它基于免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)，包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和/或試管和 設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于，在酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)含有抗多種有機(jī)磷通用 包被抗原，盒內(nèi)試劑包含抗多種有機(jī)磷共同抗體、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo) 記抗多種有機(jī)磷共同抗體。盒內(nèi)試劑還包含洗滌液、底物稀釋液、底物溶液和 反應(yīng)終止液。
在具體的實施方案中，本發(fā)明試劑盒包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的96孔/40孔 酶標(biāo)板/試管和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑。在所述酶標(biāo)板的每個孔內(nèi)，吸附著由包被液 包被能與抗多種有機(jī)磷共同抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的通用包被抗原，并用5%明膠 進(jìn)行封閉，盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗多種有機(jī)磷共同抗體 (間接ELISA)、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)多種有機(jī)磷共同抗體例如辣根過氧化 物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(適用于間接竟?fàn)嶦LISA法)或辣根過氧化物酶標(biāo)記抗 多種有機(jī)磷兔共同抗體(適用于直接竟?fàn)嶦LISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。
其中固相通用包被抗原的制備及盒體內(nèi)試劑組成如下
將通用包被抗原用pH9.6， 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(含1 2g碳酸鈉和 2-4g碳酸氫鈉，雙蒸水1L,即包被液)稀釋成0.5~4ug/mL，點于96孔/40孔 酶標(biāo)板上，100ug/孔，并用5%明膠封閉；其中通用包被抗原為例如N-(oc-萘乙 酰基)-6-氨基己酸與卵清蛋白的復(fù)合物；
洗滌液(稀釋液)一瓶，40-80mL/瓶，組成比例為磷酸二氫鉀0.1-0.3g、磷酸 氫二鈉2-4g、氯化鉀0.1-0.3g、吐溫-20 0.5-3mL、雙蒸水500ml-1000ml,為正常 使用的15-30倍濃縮液；
底物稀釋液一瓶，30-50mL/瓶，配制如下檸檬酸3-6g,磷酸氫二鈉l-3g， 雙蒸水，為正常使用的5-10倍濃縮液；
酶底物為30%過氧化氫，10-15mL/瓶和鄰苯二胺固體粉末4』支，10-20mg/
支；
抗多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)4瓶，100ml/瓶，工作濃度為1: 500-1000(間接ELISA法)；所述的抗多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)為通過特殊有機(jī)磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn)生的能與多種有機(jī)磷分子、多種有機(jī)磷包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(IgG);
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(直接ELISA法)或者辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(間接ELISA法)一瓶，200-400uL/瓶，為正常使用時800-1500倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體為多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；
反應(yīng)終止液一瓶，30-50ml/瓶，為2mol/L硫酸；
多種有機(jī)磷不同濃度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，l-4mL/瓶，甲醇定容，使用時用PBST稀釋10倍。
本發(fā)明的同時適用于多種有機(jī)磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，能夠同時檢測水樣、土壤、中毒樣品、蔬菜等食品中多種有機(jī)磷的殘留。試劑盒測定原理首先將有機(jī)磷農(nóng)藥類似分子與大分子載體(如蛋白質(zhì))偶聯(lián)制得的復(fù)合物作為通用包被抗原吸附于固相載體上，然后加入待測農(nóng)藥和抗多種有機(jī)磷共同抗體(間接ELISA法)或酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體(直接ELISA法)。通用包被抗原、待測農(nóng)藥與抗多種有機(jī)磷共同抗體(或酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體)進(jìn)行竟?fàn)幏磻?yīng)，待測農(nóng)藥含量多，則被結(jié)合在通用包被抗原上的共同抗體少，最終酶促反應(yīng)顯色淺，反之結(jié)合在通用包被抗原的共同抗體(或酶標(biāo)共同抗體)多，最終酶促反應(yīng)顯色深。上述通用包被抗原、待測農(nóng)藥、抗多種有機(jī)磷共同抗體或酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體竟?fàn)幗Y(jié)合反應(yīng)后，再加入底物溶液出現(xiàn)顯色反應(yīng)加以測定(間接ELISA法，加底物溶液前不需再加入酶標(biāo)2抗)。當(dāng)共同抗體或酶標(biāo)共同抗體量一定時，樣品中的待測農(nóng)藥量越多，與通用包被抗原結(jié)合的酶標(biāo)共同抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，抑制率增高；反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)，抑制率減低，因而根據(jù)已知量農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)線和待檢樣品的抑制率，再根據(jù)抑制率與農(nóng)藥濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推算出待測農(nóng)藥的濃度?？苟喾N有機(jī)磷共同抗體的制備
將人工合成的多種有機(jī)磷免疫原(即特殊有機(jī)磷人工半抗原與牛血清白蛋白結(jié)合形成的偶聯(lián)物)多次注射家兔刺激其體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能對多種有機(jī)磷農(nóng)藥分子或多種有機(jī)磷包被原(特殊有機(jī)磷人工半抗原與卵清蛋白人工合成的偶聯(lián)物)特異性識別結(jié)合的免疫球蛋白(IgG)。
一、免疫原的選擇和制備
1、選擇特殊有機(jī)磷人工半抗原與載體蛋白結(jié)合比在40-50的偶聯(lián)物作免疫原。2、 弗氏佐劑的制備石蠟油與羊毛脂3: 1混勻濕熱高壓滅菌得弗氏不完全佐劑。在弗氏不完全佐劑中按規(guī)2mg/ml加卡介苗凍干粉混勻得弗氏完全佐劑。
3、 佐劑免疫原的制備將免疫原溶液慢慢解凍，用生理鹽水稀釋至3mg/ml(以載體蛋白計)按免疫劑量吸入適當(dāng)容積于注射器中，且免疫原與佐劑以1: 1(V/V)混合，后以用無菌橡膠管相連的兩支5ml滅菌玻璃注射器(總體積不超過4ml)交替推動，使佐劑與免疫原溶液充分混合乳化，形成油包水乳液，直至滴入冰水中暫不擴(kuò)散為止。
二、 免疫方案
選用健康純白新西蘭雄兔(體重約1.5kg左右)作為免疫動物。注射前耳靜脈采血制備少時對照血清(l-2ml)，低溫貯藏備用。然后將上述已制備好的佐劑免疫原用背部皮內(nèi)多點注射法注射，以20-25點左右小劑量注射入兔體內(nèi)，總共注射7次，時間間隔第一次與第二次為4個周，其后每次的時間間隔為2周。四免后7-10天，耳緣靜脈釆血制備少量抗血清，以陰性血清作對照，用瓊脂雙擴(kuò)散法和間接ELISA法檢測血清效價。待瓊擴(kuò)散效價達(dá)1: 16以上，以間接ELISA法測定抗血清終點效價達(dá)大于10萬，中點效價大于2萬。頸動脈全采血(無菌)制備抗血清于-20'C凍存。
三、 共同抗體的純化
1、 硫酸銨鹽法(1)50ml燒杯中，X毫升血清+Xml生理鹽水，置于電磁攪拌器上。(2)緩慢滴入2X毫升飽和硫酸銨(PH7.0)，使達(dá)到50%的飽和度。控制攪拌速度不出氣泡。滴加完畢，繼續(xù)攪拌5分鐘。(3)室溫放置30分鐘。(4)離心3000轉(zhuǎn)/分x 20分鐘。(5)棄去上清液，沉淀物溶于2X毫升生理鹽水，逐滴加飽和硫酸銨Xml使達(dá)33y。飽和度。(6)室溫放置30分鐘。(7)棄去上清液，將沉淀物溶于2亳升生理鹽水，裝透析袋，置4。C冰箱0.01MPH7.0PB緩沖液透析，換液數(shù)次，每次換液時用納氏試劑檢查NIT;至不出現(xiàn)黃色沉淀為止。
2、 DEAE纖維素柱層析法(l)DEAE預(yù)處理(2)裝柱、加樣和洗脫(3)合并、濃縮、測蛋白。
3、 免疫球蛋白(IgG)濃度的測定將純化后的共同抗體溶液用生理鹽水稀釋
適當(dāng)倍數(shù)后測OD28。，按下式計算兔IgG含量
OD280
IgG% = - x稀釋倍數(shù)
13.5
4、 共同抗體的純度鑒定快速染色聚丙烯酰胺凝膠電泳法，分離膠濃度為6.5%。酶標(biāo)共同抗體的制備(采用改良過碘酸鈉法)
具體搡作如下稱5-10mgHRP溶解于lml蒸餾水中，于上液中加入0.2-0.4mL 新配的0.1mol/LNalO4溶液，室溫下避光攪拌15-30分鐘。將上述溶液裝入透析 袋中，用lmmol/LpH4.4的醋酸鹽緩沖液透析，4'C過夜。加20-40uL0.2mol/LpH9.5 碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入l-2ml含 有10-20mg純化共同抗體的0.01mol/L碳酸鹽緩沖液，室溫避光輕輕攪拌2-3 小時。力口 0.14).2mL新配的4mg/mLNaBH4液，混勻，再置4°C2-3小時。將反 應(yīng)液裝入透析袋中，用0.15mol/LpH7.4PBS透析，4'C過夜。在攪拌下逐滴加入 等體積飽和硫酸銨溶液，置4。Cl-2小時。3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀 物用半飽和硫酸銨溶液洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4X:的PBS 中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.15mol/LpH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除 銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000-12,000rpm離心30分鐘，上清液即為酶結(jié)合 物，用等量甘油分裝后，分別于-4。C、 -20^保存。經(jīng)直接ELISA法(E-Ab法)測 定，效價為64000。
多種有機(jī)磷通用人工抗原(和通用包被原)合成與鑒定
分別稱取芳基硫代磷酸酯人工半抗原、直連硫代磷酸酯人工半抗各50mg溶 于6ml無水DMF,開啟攪拌，加入160uL三正丁胺，冰浴下緩慢滴加同2ml無 水DMF溶解的氯甲酸異酯80uL，加畢，4'C攪拌反應(yīng)1小時，然后于室溫反應(yīng) 1.5小時。
稱取BSA、 OVA各100mg,分別溶于8ml0.05mol/L、 pH8.7的硼酸鹽緩沖 液，將上述反應(yīng)液分為二等分，分別用滴管緩慢滴加到不同蛋白質(zhì)溶液中，每 種蛋白質(zhì)溶液中加一份，保持反溫度15。C左右。加畢，室溫攪拌反應(yīng)12小時。
將反應(yīng)液置透析袋中，于4。C下對0.01mol/L、 pH7.4PB透析，每6小時換一 次緩沖液，直至透析液中測不出多種有機(jī)磷人工半抗原的紫外吸收為止。精確 計量透析袋內(nèi)偶聯(lián)物溶液的體積。
將所得偶聯(lián)物溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其OD293約為0.4-0.8。配制多種有機(jī)磷 人工半抗原溶液使其濃度為20ug/ml左右。另配制相應(yīng)載體蛋白溶液使其濃度為 0.5mg/ml。分別對多種有機(jī)磷人工半抗原溶液、載體蛋白溶液和偶聯(lián)物溶液進(jìn)行 紫外線吸收光譜掃描，掃描波長范圍240-320nm,根據(jù)掃描圖譜定性確定半抗原
是否與載體蛋白發(fā)生了偶聯(lián)。然后根據(jù)OD292,分別計算各自的摩爾吸光數(shù)S 292。
按下式計算多種有機(jī)磷人工半抗原與載體蛋白的結(jié)合比。
s292 (偶聯(lián)物)-s292 (載體蛋白)
結(jié)合比二 -
s292 (CBRH)芳基硫代磷酸酯人工半抗原的合成
甲基對硫磷7.6mmol溶于20ml乙醚中，用冷的1 %Na2CO32*10ml洗滌，乙 醚層加入醋酸/鹽酸(9/1),三口瓶中攪拌加熱，加入4克鋅粉，回流反應(yīng)1小 時。濾去殘渣。CCl43*10ml洗滌濾渣，合并。蒸餾水洗滌4*25ml,有機(jī)層用 1MNaON調(diào)至中性，水層乙醚^25ml提取。合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減 壓蒸餾除去溶劑得橙紅色油狀物，得氨基化甲基對硫磷粗品。
氨基化甲基對硫磷粗品中加入蒸餾水，2%鹽酸調(diào)節(jié)PH=1~2,分去不容 物，用正己烷2*20ml洗滌水相。水相用10。/。NaON調(diào)至PH-10 11,出現(xiàn)橘 紅色油狀物，用三氯甲烷2f20ml提取水相，無水硫酸鈉干燥，加壓蒸餾除去有 機(jī)溶劑，得橘紅色油狀物 1.2克。該橘紅色油狀物即為芳基硫代磷酸酯人工半 抗原。
H，-NMR 5 (ppm)( TMS、 CDC13): 3.57 ( s，2H，-NH2 )， 3.88 ( s,3H,-CH3 )， 3.85 (s，3H，-CH3 )， 6.65 ~ 7.00 (m，4H，Ar-H )。 直連硫代磷酸酯人工半抗原的合成
6-氨基己酸1.3克(O.Olmol)溶于2.5M的NaOH，于0~ IO'C滴加二甲氧 基硫代磷酰氯2克(0.0075mol )，冰浴冷卻，攪拌下滴加2.5M的NaOH4ml。逐 漸升溫至5-15X:,攪拌反應(yīng)4.5小時。加入適量蒸餾水，用2.5M的NaOH調(diào) 整PH-2，有白色絮狀物生成，用乙醚提取3*301111，合并乙醚，無水硫酸鈉千 燥，脫溶得油狀物 2.5克。NMR鑒定結(jié)構(gòu)。
H，-畫R5(ppm)(TMS、 CDC13): 1.38 (m，2H，-CHr) ,1.55(m,2H,-CH2-)， 1.69(m，2H，-CH2-)，2.38(t，2H，-CH2COO-)，2.95(m，2H,-CH2N-),3.18( s,lH，-NH- )， 3.71 (d,6H，-OCH3 )。 包被酶標(biāo)板的制備
通用包被抗原用pH9.6,0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(含l-2g碳酸鈉和2-4g 碳酸氬鈉，雙蒸水IL)稀釋成0.5-4ug/ml,在酶標(biāo)板的每孔加lOOuL， 4'C下包被 過夜或37'C包被2h,傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干，然后在每孔中加 入150uL5。/。明膠，放入37。C溫箱中0.4-1小時后用PBST洗滌3次，拍干后干 燥保存。
檢測樣品的前處理
水樣過濾后即可取樣進(jìn)行ELISA分析。
土樣取10g土壤用20-40mL丙酮提取三次，合并提取液，濃縮，然后用 PBST稀釋定容至10mL,進(jìn)行ELISA分析。
蔬菜樣品取蔬菜樣品用粉碎機(jī)絞碎后稱取10g， 20-40mL丙酮提取三次，合并提取液，濃縮，用PBST定容至10mL,取樣進(jìn)行ELISA分析。 血液取人體血液，加抗凝素后直接用ELISA法進(jìn)行分析。 洗胃液(2%碳酸氫鈉溶液》取10mL洗胃液，用稀HC1調(diào)pH值到中性后
即可用ELISA法進(jìn)行分析。
嘔吐物取樣品研碎，離心取上清用ELISA法進(jìn)行分析。
試劑盒操作過程
1) 直接竟?fàn)嶦LISA法取出一塊包被有多種有機(jī)磷通用包被抗原酶標(biāo)板， 恢復(fù)到室溫后備用；加入50uL標(biāo)樣或處理好的樣品到各自孔中，標(biāo)樣和樣品做 2-4個重復(fù)；加入50uL稀釋的酶標(biāo)共同抗體，37'C孵育l-2小時；倒出孔中的 液體，將微板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200uL稀 釋好的PBST洗2-6次，拍干；然后每孔加入100uL底物液，輕微振勻，并在 37'C暗處孵育15-25分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)；加入50uL反應(yīng)終止液，混合好后，測
定OD45tom值或者OD49。nm值。
2) 間接競爭ELISA法取出一塊包被有多種有機(jī)磷通用包被抗原酶標(biāo)板，
恢復(fù)到室溫后備用；加入50uL標(biāo)樣或處理好的樣品到各自孔中，標(biāo)樣和樣品做
2-4個重復(fù)；加入50uL稀釋的共同抗體，37'C孵育l-2小時倒出孔中的液體，
將微孔板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200uL稀釋好
的PBST洗2-6次；加入100uL稀釋好酶標(biāo)二抗，37'C孵育l-2小時；倒出孔中
的液體，將微孔板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200uL
稀釋好的PBST洗2-6次；然后每孔加入100uL底物液與顯色物質(zhì)的混和液，輕
微振勻，并在37'C暗處孵育15-25分鐘進(jìn)行顯色反應(yīng)；加入.50uL反應(yīng)終止液，
混合好后，測定OD45。nm值或者OD49。nm值。
以所獲得的標(biāo)樣和樣品吸光值的平均值計算各孔的吸光值的抑制率
(ODmax陽ODmin)-(ODx-ODmin;)
抑制率(％) = - x 100%
(ODmax-ODmin)
OD皿為不加藥時的吸光值，ODx為農(nóng)藥X時的吸光值，ODmin為空白對照
孔的吸光值。
計算的標(biāo)樣值繪成一個對應(yīng)多種有機(jī)磷濃度(mS幾)的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線 圖，直接竟?fàn)嶦LISA法的校正曲線在0.01~10mg/L范圍內(nèi)為線性；間接竟?fàn)?ELISA法的校正曲線在0.005-1 Omg/L，范圍內(nèi)為線性，對應(yīng)樣品濃度可從校正曲 線讀出，也可根據(jù)標(biāo)樣的濃度與抑制率求出線性方程，然后求出對應(yīng)樣品的濃 度。有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點是能同時用于水樣、土壤、中毒樣品、蔬菜等食品中多種有 機(jī)磷(如甲基對硫磷、殺螟硫磷、倍硫磷、乙酰甲胺磷、樂果、馬拉硫磷等) 殘留的檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本 遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的檢測方法。試劑盒釆用強(qiáng)特異性、高效價的共同抗體，提高檢測
的靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度。試劑盒的保存期超過12個月。本發(fā)明簡單快速， 適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析方法，具有重要的現(xiàn)實意義。 具體實施例方式
在下面實施例中更詳細(xì)地描述本發(fā)明，并非對本發(fā)明的限制，其中比例和 百分比在沒有特別說明的情況下均為重量/重量比。 實施例1
本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。 試劑盒中采用特殊有機(jī)磷人工半抗原與卵清蛋白的復(fù)合物作為通用包被抗 原，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含lg碳酸鈉和4g碳酸氫鈉， 雙蒸水1L)稀釋成4ug/mL，點于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100ug/孔，并用5%明膠 封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗多種有機(jī)磷共同抗體(間 接ELISA)、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(適用于 間接竟?fàn)嶦LISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(適用于直 接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下
洗滌液(稀釋液)40mL,組成比例為磷酸二氫鉀O.lg、磷酸氫二鈉4g、氯化 鉀O.lg、吐溫-20 3mL、雙蒸水1000ml，為正常使用的15-30倍濃縮液；
底物稀釋液50mL,配制如下檸檬酸3g，磷酸氫二鈉lg,雙蒸水，為正 常使用的5~10倍濃縮液；
酶底物為30%過氧化氫，15mL和鄰苯二胺固體粉末40mg;
特殊有機(jī)磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔 后產(chǎn)生的能與多種有機(jī)磷分子、多種有機(jī)磷通用包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋 白(IgG)，抗多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)400ml，工作濃度為1: IOOO(間接ELISA
法)；
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(直接ELISA法)或者辣根過 氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(間接ELISA法)200uL，為正常使用時800-1500 倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體為多種有機(jī)磷共同抗 體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸30mL;
多種有機(jī)磷不同濃度系列(0.1、0.5、2、 10、 50、 100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用時用PBST稀釋10倍。 實施例2
本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。
試刑盆甲米用特殊有機(jī)磷人工半抗與卵清蛋白的復(fù)合物作為通用包被抗原 (CBRH-OVA)，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含2g碳酸鈉和 2g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0.5ug/mL，點于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100ug/ 孔，并用5%明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗多種有機(jī)磷共同抗體(間 接ELISA)、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(適用于 間接竟?fàn)嶦LISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(適用于直 接競爭ELISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下
洗滌液(稀釋液)80mL，組成比例為磷酸二氫鉀0.3g、磷酸氫二鈉2g、氯化 鉀0.3g、吐溫-200.5mL、雙蒸水500ml,為正常使用的15-30倍濃縮液；
底物稀釋液30mL，配制如下獰檬酸6g,磷酸氬二鈉lg，雙蒸水，為正 常使用的5-10倍濃縮液；
酶底物為30%過氧化氫，lOmL和鄰苯二胺固體粉末120mg;
特殊有機(jī)磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔 后產(chǎn)生的能與多種有機(jī)磷分子、多種有機(jī)磷通用包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋 白(IgG),抗多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)400ml，工作濃度為1: 500(間接ELISA 法)；
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(直接ELISA法)或者辣根過 氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(間接ELISA法)400uL，為正常使用時800-1500 倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體為多種有機(jī)磷共同抗 體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；
反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸50mL;
多種有機(jī)磷不同濃度系列(0.1、0.5、2、 10、 50、 100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用時用PBST稀釋10倍。 實施例3
本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。 試劑盒中采用特殊有機(jī)磷人工半抗與卵清蛋白的復(fù)合物作為通用包被抗原 (CBRH-OVA)，將其用pH為9.6的0.05mol/L碳酸鹽緩沖溶液(含2g碳酸鈉和2g碳酸氫鈉，雙蒸水1L)稀釋成0.5ug/ml，點于96孔/40孔酶標(biāo)板上，100ug/ 孔，并用5%明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗多種有機(jī)磷共同抗體(間 接ELISA)、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(適用于 間接競爭ELISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(適用于直 接竟?fàn)嶦LISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下
洗滌液(稀釋液)60mL，組成比例為磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化 鉀0.2g、吐溫-20 1.5mL、雙蒸水750ml，為正常使用的15-30倍濃縮液；
底物稀釋液45mL，配制如下檸檬酸4g,磷酸氫二鈉2g,雙蒸水，為正 常使用的5~10倍濃縮液；
酶底物為30%過氧化氫，12mL和鄰苯二胺固體粉末90mg;
特殊有機(jī)磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔 后產(chǎn)生的能與多種有機(jī)磷分子、多種有機(jī)磷包被原特異性結(jié)合的免凌球蛋白 (IgG),抗多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)400ml，工作濃度為1: 750(間接ELISA法)；
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(直接ELISA法)或者辣根過 氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(間接ELISA法)300uL,為正常使用時800-1500 倍濃縮液；上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體為多種有機(jī)磷共同抗 體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；
反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸40mL;
多種有機(jī)磷不同濃度系列(0.1、0.5、2、 10、 50、 100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶,l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用時用PBST稀釋10倍。 實施例4
本發(fā)明試劑盒產(chǎn)品包括盒體、盒體內(nèi)的96孔/40孔酶標(biāo)板和檢測試劑。 試劑盒中釆用特殊有機(jī)磷人工半抗與卵清蛋白的復(fù)合物作為通用包被抗 原，將其用pH為9.6的0.05rpol/L碳酸鹽緩沖溶液(含2g碳酸鈉和2g碳酸氫鈉， 雙蒸水1L)稀釋成0.5ug/mL，點于96孔/4(h -L酶標(biāo)板上,100ug/孔,并用5% 明膠封閉。
盒內(nèi)試劑包含洗滌液(稀釋液)、底物稀釋液、抗多種有機(jī)磷共同抗體(間 接ELISA)、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(適用于 間接竟?fàn)嶦LISA法)、辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(適用于直 接竟?fàn)嶦LISA法)、底物溶液和反應(yīng)終止液。配制方法如下
洗滌液(稀釋液)70mL,組成比例為磷酸二氫鉀O.lg、磷酸氫二鈉4g、氯化 鉀0.15g、吐溫-205.5mL、雙蒸水1000ml，為正常使用的15-30倍濃縮液;底物稀釋液45mL，配制如下檸檬酸3g,磷酸氫二鈉2.5g,雙蒸水，為正 常使用的5-10倍濃縮液；
酶底物為30%過氧化氫，14mL和鄰苯二胺固體粉末120mg;
特殊有機(jī)磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔 后產(chǎn)生的能與多種有機(jī)磷分子、多種有機(jī)磷通用包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋 白(IgG)，抗多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)400ml，工作濃度為1: 700(間接ELISA 法)；
辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同抗體(直接ELISA法)或者辣根過 氧化物酶標(biāo)記羊抗兔共同抗體(間接ELISA法)200uL,為正常使用時800-1500 倍濃縮液;上述辣根過氧化物酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體為多種有機(jī)磷共同抗 體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物；
反應(yīng)終止液為2mol/L的硫酸350mL;
多種有機(jī)磷不同濃度系列(O.l、 0.5、 2、 10、 50、 100mg/L)標(biāo)準(zhǔn)液6瓶，l-4mL/ 瓶，甲醇定容，使用時用PBST稀釋io倍。
權(quán)利要求
1. 一種同時使用于多種有機(jī)磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，它包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板和/或試管和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑，其特征在于，在酶標(biāo)板的每孔內(nèi)含有抗多種有機(jī)磷通用包被抗原，盒內(nèi)試劑包含抗多種有機(jī)磷抗體、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷共同抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中，所述抗多種有機(jī)磷共同抗體為通過 特殊有機(jī)磷人工半抗原和牛血清白蛋白合成的偶聯(lián)物作為免疫源注射家兔后產(chǎn) 生的能與多種有機(jī)磷分子、多種有機(jī)磷通用包被原特異性結(jié)合的免疫球蛋白 (IgG)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的試劑盒，其中，所述酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體為 多種有機(jī)磷共同抗體(IgG)與辣根過氧化物酶(HRP)結(jié)合形成的復(fù)合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述的酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷共同抗體 是辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗多種有機(jī)磷兔共同 抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適同時用于多種有機(jī)磷殘留分析的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，它包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板/試管及設(shè)在盒體內(nèi)的試劑。在酶標(biāo)板的每孔內(nèi)，由包被液包被能與抗多種有機(jī)磷共同抗體特異性合反應(yīng)的通用包被抗原，并用明膠進(jìn)行封閉，盒內(nèi)試劑包含洗滌液、底物稀釋液、多種有機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、抗多種有機(jī)磷抗體、酶標(biāo)抗多種有機(jī)磷抗體、底物、顯色物質(zhì)和反應(yīng)終止液。本發(fā)明能用于水、土壤、蔬菜等食品中及中毒樣品中多種有機(jī)磷殘留的同時快速檢測，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本低于傳統(tǒng)的檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK101477118SQ20081018348
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者孫家隆 申請人:孫家隆