專利名稱：一種肽用于調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵的體外應(yīng)用及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵的體外技術(shù)。
(二)
背景技術(shù)：
近年來，人們研究發(fā)現(xiàn)由蛋白酶解所產(chǎn)生的小肽片段除了具有營養(yǎng)作用以外，還具有一 些特殊的生理作用。在動物生產(chǎn)中不僅能保持動物肌體的健康，更能夠提高畜產(chǎn)品質(zhì)量。但 是對于肽在奶牛瘤胃內(nèi)的作用機理尚不明確。
(三)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種使用的方法快速，可重復(fù)，易操作，數(shù)值準確，模擬逼真性 強等特點的肽用于調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵的體外應(yīng)用及檢測方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的它包括以下步驟
(1) 人工瘤胃模擬裝置用內(nèi)徑為32mm，長200mm，刻度體積為100ml的醫(yī)用注射 器作為發(fā)酵器，用可以精確控溫±0.5'C的水浴搖床作為控溫裝置；
(2) 人工瘤胃緩沖液的配制取得瘤胃液以后加入混合培養(yǎng)液400ml蒸餾水+0.1ml 微量元素溶液+200ml緩沖溶液+200ml常量元素溶液+lml刃天青溶液+40ml還原劑溶液，并 混勻，加熱至39'C，同時使用C02飽和；其中微量元素溶液CaCl2*2H20 13.2g、 MnCl2'4H20 10.0g、CoCl2*6H2O 1.0g、FeCl3*6H2O 8.0g、蒸餾水至100ml;緩沖溶液NH4HC03 4.0g、NaHCO3 35g、蒸餾水至1000ml;常量元素Na2HP04—5.7g、 KH2P04~6.2g、 MgS04*7H20 0.6g、蒸 餾水至1000ml;刃天青溶液0.1% (w/v);還原劑溶液NaOH4.0ml、 Na2S'9H20 625.0mg、 蒸餾水95ml;每個注射器吸入瘤胃液與緩沖液1:2混合液共30ml;
(3) 在瘤胃微生物培養(yǎng)液發(fā)酵管中添加肽，各處理組均按氨基氮淀粉為1: 4.5的比 例添加玉米淀粉作為微生物生長能源，每個處理組設(shè)發(fā)酵2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h、 48h 共七個時間點用于采樣，每個時間點設(shè)三個重復(fù)，每個重復(fù)一支發(fā)酵管；在各時間點測定發(fā) 酵管內(nèi)發(fā)酵液的產(chǎn)氣量、pH值、氨氮濃度、VFA濃度和MCP的產(chǎn)量；
(4) 人工瘤胃液的采集在試驗?zāi)膛３匡?h后，分別從每頭牛瘤胃中抽取300ml瘤胃 液，混合，用4層精細紗布過濾，灌入到預(yù)熱達39'C并始終通有C02的保溫瓶中；
(5) 體外產(chǎn)氣量的測定每個注射器吸入瘤胃液與培養(yǎng)液的混合液后用自制的堵頭密封 保持厭氧，記錄活塞的位置；注射器在39'C水浴，在48小時內(nèi)讀取活塞位置，計數(shù)點為2h、 4h、 6h、 8h、 24h、 48h。用計數(shù)點活塞位置減去活塞的初始位置，即為在相應(yīng)時間內(nèi)飼料發(fā) 酵的產(chǎn)氣量；(6) 瘤胃發(fā)酵液pH值的測定發(fā)酵物樣品被采集后，采用SartoriusPB-20型酸度計對 發(fā)酵物樣品進行pH值測定；
(7) 瘤胃發(fā)酵液氨氮濃度的測定采用試劑均為分析純，所ffl水為蒸餾水或去離子水； 試劑包括A液苯酚顯色劑(1L)
1) 稱取0.05g亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)sNO2H20)溶解于0.5L蒸餾水中；
2) 稱取10g千燥苯酚(C6H5OH)，移入上述1L的容量瓶中，用蒸餾水定容至1L;
3) 將上述2L的溶液小心移入棕色瓶內(nèi)，在2 1(TC下避光保存，保質(zhì)期6個月； B液次氯酸鹽試劑(1L)
l"g氫氧化鈉(NaOH)溶于燒杯中，加入600ml蒸餾水；
2) 37.85g磷酸氫二鈉(Na2HP04，7H20)適當加熱溶解搖勻；
3) 冷卻后，加100ml次氯酸鈉(含氯5.25%)混勻；
4) 蒸餾水定容至1L;
5) 1#濾紙過濾后，在2 10'C下，避光保存于聚乙烯瓶中，保質(zhì)期6個月；
氨標準溶液
1) 貯備液為32mg/dl;
2) 1.0045gNH4Cl溶于800ml去氨蒸餾水中；
3) 用稀釋的鹽酸滴定至pH值為2;
4) 蒸餾水定容至1L;
5) 用貯備液配制以下溶液32， 16， 8， 4， 2， 1， Omg/dl標準溶液；
(8) 瘤胃液樣品采集
1) 用兩層精細紗布過濾瘤胃液。
2) 加入2ml新配制的25。/。偏磷酸于8ml兩層紗布過濾的瘤胃液中，封蓋，搖勻。
3) 若不立即測定在-2(TC保存。
4) 分析前在ll~12,000rpm下離心20min，上清液用于分析。
測定步驟
1) 漩渦振蕩上清液；
2) 用"Digiflex"自動進樣器，吸取40nl瘤胃液或標準液加40nl蒸餾水至貼好標簽的試管中， 同時設(shè)重復(fù)；
3) 吸取A液2.5ml加入每個試管，漩渦振蕩；
4) 吸取B液2.0ml加入每個試管，漩渦振蕩；
5) 在37'C水浴中加熱30min;6) 550nm下讀數(shù)(波長為500~660nm);若顯色太重，用較小的波長測定，或?qū)悠酚谜麴s 水1:1稀釋；
7) 用線性回歸估測標準曲線；
8) 吸收值代入方程，對于瘤胃液NH3-N，計算結(jié)果*1.25校正偏磷酸誤差；
(9) 瘤胃發(fā)酵液VFA濃度的測定試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去 離子水；
島津GC-2010型氣相色譜儀，氣相色譜條件柱箱溫度120'C、色譜柱為長30m，內(nèi)徑 0.22mm，薄膜厚度0.25nm的中極性毛細管柱、SPL23(TC、壓力97.7kPa、氫氣流量40ml/min、 空氣流量400 ml/min、 FID240'C;采用外標法，配制一系列巳知濃度的色譜標準酸。樣品注 入量為lnl，即將乙酸400nl，丙酸400^1和丁酸200^1用超純水定容至100ml，然后用氣相色 譜儀繪制色譜圖，計算各酸的保留時間和峰面積，按單點法將樣品測定結(jié)果-峰面積值換算成 各揮發(fā)性脂肪酸的摩爾濃度(mmol/L);
樣品處理取四層紗布過濾的瘤胃液5mL， 10000g離心10min;移取上清液lmL至小離 心管中，并加入冰后的25。/。的偏磷酸0.25mL，靜置30min;然后10000g離心15min，取上清 液直接進行測定；
(10) 瘤胃發(fā)酵液中微生物蛋白MCP的測定量取50mL經(jīng)4層紗布過濾的瘤胃液，于 39。C下150g離心5min;準確量取30mL上清液于4。C下20000g離心20min，沉淀加入30mL 蒸餾水輕輕搖動溶解后于4'C下20000g離心20min，沉淀經(jīng)生理鹽水和蒸餾水沖洗后再重復(fù) 加入蒸餾水離心一次，以充分消除詞料氮源后，收集細菌沉淀備用，將上述高速離心收集的 細菌沉淀小心無損地轉(zhuǎn)移到消化管中，按凱氏微量定氮法常規(guī)測定。
本發(fā)明的技術(shù)特點有
1. 使用的方法快速，可重復(fù)，易操作。
2. 可準確測定肽對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響產(chǎn)氣量、pH值、氨態(tài)氮值、揮發(fā)性脂肪酸和 MCP指標是瘤胃發(fā)酵的重要指標，對他們的測定可以直接了解活體瘤胃內(nèi)發(fā)酵的具體情況。
3. 可準確測定肽對瘤胃內(nèi)微生物酶活性的影響淀粉酶、蛋白水解酶和羧申基纖維素 酶活性是瘤胃內(nèi)主要的酶活指標，對他們的測定可以直接了解活體瘤胃內(nèi)微生物的變化情況。
本發(fā)明是一種研究肽對奶牛瘤胃發(fā)酵影響的方法，屬于大農(nóng)業(yè)畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，本發(fā)明方 法具有方便易學(xué)，操作簡便，重復(fù)性高，數(shù)值準確，模擬逼真性強的特點。通過測定產(chǎn)氣、 pH、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸、瘤胃微生物蛋白及瘤胃內(nèi)典型的三種酶活性，能有效地確定奶 牛瘤胃內(nèi)肽適宜的大致濃度。能夠為今后更深入的理論研究、更準確的配制奶牛日糧、減少 蛋白飼料的浪費，提高奶制品質(zhì)量做出科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。本發(fā)明方法能夠模擬出肽在活體瘤胃內(nèi)對其發(fā)酵影響的實際情況，為本學(xué)科發(fā)明研究提 供了理論基礎(chǔ)，利用奶牛作為實驗動物，通過體外發(fā)酵，模擬出肽在活體瘤胃內(nèi)的發(fā)酵情況， 對選定的發(fā)酵參數(shù)與酶活性指標進行測定，直觀了解了肽對活畜瘤胃發(fā)酵的影響，并初步找 到了肽的適宜添加量。
(四)


圖1為第一種具休實施方式的預(yù)處理流程示意圖； 圖2為第二種具體實施方式
的預(yù)處理流程示意圖。
(五) 具休實施方式
下面結(jié)合具休實施例對本發(fā)明作進一步的說明 一、實施例l:不同濃度肽對人工瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響
1、 試驗材料
(1) 人工瘤胃模擬裝置
用內(nèi)徑為32mm，長200mm，刻度休積為100ml的醫(yī)用注射器作為發(fā)酵器，用可以精確 控溫的(±0.5°C)的水浴搖床作為控溫裝置。
(2) 人工瘤胃緩沖液(Menke液)的配制
緩沖液的配制按照Menke等(1979)的方法進行。取得瘤胃液以后加入混合培養(yǎng)液400ml 蒸餾水+0.1ml微量元素溶液A+200ml緩沖溶液B+200ml常量元素溶液C+lml刃天青溶液 +40011還原劑溶液。并混勻，加熱至39t:，同時使用C02飽和。
微量元素溶液(A) : CaCl2.2H20-13.2g 、 MnCl2'4H2O-10.0g 、 CoCl2'6H2O-1.0g 、 FeCl3*6H2O-8.0g、蒸餾水至----1、00ml
緩沖溶液(B) : NH4HCO34.Og、 NaHC03—35g、蒸餾水至----1000ml
常量元素(C): Na2HP04—5.7g、 KH2P04—6.2g、 MgS04*7H20—"0.6g、蒸餾水至----1000ml
刃天青溶液0.1% (W/V)
還原劑溶液NaOH"^.0ml、 Na2S'9H2O~625.0mg、蒸餾水一95ml 每個注射器吸入瘤胃液與緩沖液(1:2)混合液共30ml。
2、 試驗設(shè)計
在瘤胃微生物培養(yǎng)液發(fā)酵管中添加肽。各處理組均按氨基氮:淀粉為1:4.5的比例添加玉 米淀粉作為微生物生長能源。每個處理組設(shè)發(fā)酵2h、 4h、 6h、 8h、 12h、 24h、 48h共七個時 間點用于釆樣，每個時間點設(shè)三個重復(fù)，每個重復(fù)一支發(fā)酵管。
在各時間點測定發(fā)酵管內(nèi)發(fā)酵液的產(chǎn)氣量、pH值、氨氮濃度、VFA濃度和MCP的產(chǎn)量。
3、 人工瘤胃液的采集在試驗?zāi)膛３匡?h后，分別從每頭牛瘤胃中抽取300ml瘤胃液，混合，用4層精細紗布 過濾，灌入到預(yù)熱達39'C并始終通有C02的保溫瓶中，迅速返回實驗室。 4、樣品測定流程與檢測方法，結(jié)合圖1:
(1) 體外產(chǎn)氣量的測定 每個注射器吸入瘤胃液與培養(yǎng)液的混合液后川自制的堵頭密封保持厭氧，記錄活塞的位
置。注射器在39'C水浴，在48小時內(nèi)讀取活塞位置，計數(shù)點為2h、 4h、 6h、 8h、 24h、 48h。 用計數(shù)點活塞位置減去活塞的初始位置，即為在相應(yīng)時間內(nèi)飼料發(fā)酵的產(chǎn)氣量。
(2) 瘤胃發(fā)酵液pH值的測定
瘤胃液中的C02對瘤胃pH值有很大影響。發(fā)酵物樣品被采集后，應(yīng)立即進行測定。否 則，部分C02被釋放后，可造成瘤胃pH值的測定有較大誤差。采樣后立即用Sartorius PB-20 型酸度計對發(fā)酵物樣品進行pH值測定。
(3) 瘤胃發(fā)酵液氨氮濃度的測定
試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。 試劑
A液苯酚顯色劑(1L)
1) 稱取0.05g亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5N02H20)溶解于0.5L蒸餾水中。 (此過程應(yīng)戴防護手套)
2) 小心稱取10g千燥苯酚(C6H5OH),移入上述1L的容量瓶中，用蒸餾水定容至1L。
3) 將上述2L的溶液小心移入棕色瓶內(nèi)，在2-l(TC下避光保存，保質(zhì)期6個月。 B液次氯酸鹽試劑(1L)
1) 5g氫氧化鈉(NaOH)溶于燒杯中，加入600ml蒸餾水。
2) 37.85g磷酸氫二鈉(Na2HP(V7H20)適當加熱溶解搖勻。
3) 冷卻后，加100ml次氯酸鈉(含氯5.25%，確保新鮮)混勻。
4) 蒸餾水定容至1L。
5) 1#濾紙過濾后，在2 1(TC下，避光保存于聚乙烯瓶中，保質(zhì)期6個月。 氨標準溶液
1) IC備液為32mg/dl
2) 1.0045gNH4Cl溶于800ml去氨蒸餾水中。
3) 用稀釋的鹽酸滴定至pH值為2。
4) 蒸餾水定容至1L。
5) 用貯備液配制以下溶液32， 16， 8， 4， 2， 1， 0mg/dl標準溶液。(4) 瘤胃液樣品采集
1 )用兩層精細紗布過濾瘤胃液。
2) 加入2ml新配制的25%偏磷酸于8ml兩層紗布過濾的瘤胃液中，封蓋，搖勻。
3) 若不立即測定在-2(TC保存。
4) 分析前在ll~12，000rpm下離心20min，上清液用于分析。 測定步驟
1) 漩渦振蕩上清液。
2) 用"Digiflex"自動進樣器，吸取4(^1瘤胃液或標準液加40nl蒸餾水至貼好標簽的試管中， 同時設(shè)重復(fù)。
3) 吸取A液2.5ml加入每個試管，漩渦振蕩。
4) 吸取B液2.0ml加入每個試管，漩渦振蕩。
5) 在37t:水浴中加熱30min。
6) 550nm下讀數(shù)(波長為500~660nm)。若顯色太重，用較小的波長測定，或?qū)悠酚谜麴s 水1:1稀釋。
7) 用線性回歸估測標準曲線。
8) 吸收值代入方程，對于瘤胃液NH3-N，計算結(jié)果*1.25校正偏磷酸誤差。
(5) 瘤胃發(fā)酵液VFA濃度的測定 試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。
島津GC-2010型氣相色譜儀。氣相色譜條件柱箱溫度12(TC、色譜柱為長30m，內(nèi)徑 0.22mm，薄膜厚度0.25nm的中極性毛細管柱、SPL23(TC、壓力97.7kPa、氫氣流量40ml/min、 空氣流量400 ml/min、 FID24(TC。采用外標法，配制一系列已知濃度的色譜標準酸。樣品注 入量為即將乙酸400nl，丙酸400nl和丁酸20(Hil用超純水定容至100ml，然后用氣相色 譜儀繪制色譜圖，計算各酸的保留時間和峰面積，按單點法將樣品測定結(jié)果-峰面積值換算成 各揮發(fā)性脂肪酸的摩爾濃度(mmol/L)。
樣品處理取四層紗布過濾的瘤胃液5mL， 10000g離心10min;移取上清液lmL至小離 心管中，并加入冰后的25Q/。的偏磷酸0.25mL，靜置30min;然后10000g離心15min，取上清 液直接進行測定。
(6) 瘤胃發(fā)酵液中微生物蛋白MCP的測定
按圖中程序，量取50mL經(jīng)4層紗布過濾的瘤胃液，于39'C下150g離心5min;準確量 取30mL上清液于4'C下20000g離心20min,沉淀加入30mL蒸餾水輕輕搖動溶解后于4'C下 20000g離心20min，沉淀經(jīng)生理鹽水和蒸餾水沖洗后再重復(fù)加入蒸餾水離心一次，以充分消除飼料氮源后，收集細菌沉淀備用。將上述高速離心收集的細菌沉淀小心無損地轉(zhuǎn)移到消化 管中，按凱氏微量定氮法常規(guī)測定。 5、統(tǒng)計分析
各項指標的測定數(shù)據(jù)經(jīng)Excd2003初步整理后，均釆;H SAS統(tǒng)計軟件包中的GLM過程進 行方差分析和顯著性檢驗，多重比較采用Duncan法測驗，利用Means過程計算平均數(shù)及標 準差。
二、實施例2:不同濃度肽對人工瘤胃酶活的影響
1、 試驗材料
同上
2、 試驗設(shè)計
同上
在各時間點測定發(fā)酵管內(nèi)發(fā)酵液中微生物淀粉酶活性、蛋白酶活力和羧甲基纖維素酶的 活力。
3、 樣品測定流程與檢測方法，結(jié)合圖2.
根據(jù)瘤胃微生物發(fā)酵的條件和特點，選擇淀粉酶、蛋白酶和羧甲基纖維素酶(以羧甲基纖 維素鈉為底物，主要是內(nèi)切葡萄糖苷酶，B卩endo-l，4-(3-D-glucanase，簡稱EG)三個指標按圖2 進行瘤胃微生物酶活性的測定。
(1) 淀粉酶活性的測定
采集瘤胃液，離心，取上清液，用淀粉酶試劑盒測定(南京建成)。
(2) 蛋白酶酶活性的測定
試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。 試劑
1%酪蛋白底物l.Og酪蛋白溶于100ml0.01mol/LNaOH。 0.01mol/LNaOH: 0.4gNaOH用蒸餾水定容至1000ml容量瓶中。 10%三氯乙酸10g三氯乙酸溶于100ml蒸餾水中。 0.4mol/LNa2CO3: 42 預(yù)處理流程 二 1000ml容量瓶中。
0.5mol/LHCl:量取4 Pretreatment Process d蒸餾水中。 酪氨酸儲備液O.lg干燥L(fēng)-酪氨酸用0.5mol/L HC1定容至100ml。 測定方法
以lmll。/。的酪蛋白為底物，加入4ml瘤胃液，在38'C條件下厭氧培養(yǎng)4小時，然后加入 5mL10。/。三氯乙酸除去未分解的酪蛋白，以4000rpm離心15分鐘，取上清lml，分別加入5ml0.4mol/L Na2C03溶液和1ml Folin-phenol(酚)試劑，混合后顯色15分鐘，在680nm處測定吸 光度。依標準曲線計算酪氨酸生成量。每分鐘催化酪蛋白水解生成lug酪氨酸的酶量定義為 一個酶活單位。
取酪氨酸儲備液O、 2、 4、 6、 8、 10ml，用水稀釋至10ml。按同樣操作方法，測定標準 曲線。
(3) 羧甲基纖維素酶酶活性的測定
試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。 試劑
0.2M磷酸緩沖液(pH6.0):
分別稱取71.64g十二水磷酸氫二鈉(Na2HPCV12H20)和31.21g 二水磷酸二氫鈉 (NaH2P04*2H20)，各自溶解于1000ml蒸餾水配成0.2M的貯存液，121'C滅菌15min保存； 量取磷酸氫二鈉溶液12.3ml和磷酸二氫鈉溶液87.7ml，混合均勻，配制成100ml ， pH6.0的
磷酸緩沖液。
0.5y。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)底物溶液
稱取0.5g羧甲基纖維素鈉用50mM， pH6. 0磷酸緩沖液定容至lOOml。 DNS溶液
甲液(6.9g結(jié)晶酚溶于15.2mll0。/。氫氧化鈉溶液，蒸餾水稀釋至69ml，加6.9g亞硫酸鈉) 與乙液(255g酒石酸鉀鈉溶于300mll0。/。氫氧化鈉溶液中，再加入880mll% 3， 5 —二硝基水楊 酸溶液)混合呈黃棕色，棕色試劑瓶中放置7 10天后使用。 葡萄糖標準溶液
稱取lg分析純的葡萄糖溶于小燒杯中，完全轉(zhuǎn)移到1L容量瓶中，定容，此時葡萄糖濃 度為1.0mg/ml，為母液；用移液管移取O、 10、 20、 30、 40、 50、 60 ml母液到100ml容量瓶 中，定容，制成每升溶液中分別含葡萄糖O、 100、 200、 300、 400、 500、 600mg的標準溶液。
(4) 標準曲線的繪制
取1ml系列濃度的葡萄糖溶液加到15ml刻度試管中，加入2mlDNS溶液，沸水浴lOmin 后迅速流水沖洗冷卻，用蒸餾水定容至15ml，以O(shè).Omg/kg為空白，550nm下測定吸光度；以 吸光度為橫坐標、葡萄糖濃度為縱坐標作標準曲線，并得出回歸方程。 纖維素酶活力測定方法
以羧甲基纖維素鈉溶液為底物，酶活單位(IU)定義為每min每ml酶液作用于底物生 成的葡萄糖的量(nmol)。取lml底物溶液加到15ml刻度試管中，5(TC水浴中振蕩30min， 加入0.2ml處理后的酶液，50'C水浴中振蕩反應(yīng)60min，迅速取出并加入2mlDNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴10min后迅速流水沖洗冷卻，用蒸餾水定容至15ml，搖勻，部分轉(zhuǎn)移至10ml的
離心管中，在3.2x103 rpm下離心15min， 550nm下測定吸光度?？瞻讟又谱飨祵?.2ml處理
后的酶液換成0.2ml50mM， pH6.0磷酸緩沖液，其余不變。
酶活(IU) =[ (Cmg/Lxl5ml) /葡萄糖分子量]/ (60minx0.2ml酶液)
4、統(tǒng)計分析
各項指標的測定數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2003整理后，采用SAS統(tǒng)計軟件包中的GLM過程進行方 差分析和顯著性檢驗，多重比較采用Duncan法測驗，利用Means過程計算平均數(shù)及標準差。 三、試驗效果
瘤胃pH值總的變化趨勢是發(fā)酵后各組pH值先降低后升高，且均處在正常范圍之內(nèi)，差 異不顯著；發(fā)酵液的氨氮濃度值隨時間變化的趨勢是，在發(fā)酵的24h內(nèi)，各組氨氮濃度值先 升高，再降低；各處理組在24h的發(fā)酵過程中，微生物蛋白>量呈現(xiàn)降-升-降-升的動態(tài)變化 趨勢，且10g/L組、20g/L組變化相近。綜合各指標，人工瘤胃內(nèi)適宜的肽濃度在15~20g/L。
通過試驗結(jié)果分析，可以看出，該試驗取得了良好的效果，達到了預(yù)期目的。不僅能在 相對簡單的條件下順利完成試驗，而且試驗成本低，環(huán)境污染程度小。
權(quán)利要求
1、一種肽用于調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵的體外應(yīng)用及檢測方法，其特征在于它包括以下步驟(1)人工瘤胃模擬裝置用內(nèi)徑為32mm，長200mm，刻度體積為100ml的醫(yī)用注射器作為發(fā)酵器，用可以精確控溫±0.5℃的水浴搖床作為控溫裝置；(2)人工瘤胃緩沖液的配制取得瘤胃液以后加入混合培養(yǎng)液400ml蒸餾水+0.1ml微量元素溶液+200ml緩沖溶液+200ml常量元素溶液+1ml刃天青溶液+40ml還原劑溶液，并混勻，加熱至39℃，同時使用CO2飽和；其中微量元素溶液CaCl2·2H2O 13.2g、MnCl2·4H2O10.0g、CoCl2·6H2O 1.0g、FeCl3·6H2O 8.0g、蒸餾水至100ml；緩沖溶液NH4HCO3 4.0g、NaHCO335g、蒸餾水至1000ml；常量元素Na2HPO4—5.7g、KH2PO4—6.2g、MgSO4·7H2O 0.6g、蒸餾水至1000ml；刃天青溶液0.1％(w/v)；還原劑溶液NaOH 4.0ml、Na2S·9H2O 625.0mg、蒸餾水95ml；每個注射器吸入瘤胃液與緩沖液1:2混合液共30ml；(3)在瘤胃微生物培養(yǎng)液發(fā)酵管中添加肽，各處理組均按氨基氮淀粉為14.5的比例添加玉米淀粉作為微生物生長能源，每個處理組設(shè)發(fā)酵2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h共七個時間點用于采樣，每個時間點設(shè)三個重復(fù)，每個重復(fù)一支發(fā)酵管；在各時間點測定發(fā)酵管內(nèi)發(fā)酵液的產(chǎn)氣量、pH值、氨氮濃度、VFA濃度和MCP的產(chǎn)量；(4)人工瘤胃液的采集在試驗?zāi)膛３匡?h后，分別從每頭牛瘤胃中抽取300ml瘤胃液，混合，用4層精細紗布過濾，灌入到預(yù)熱達39℃并始終通有CO2的保溫瓶中；(5)體外產(chǎn)氣量的測定每個注射器吸入瘤胃液與培養(yǎng)液的混合液后用自制的堵頭密封保持厭氧，記錄活塞的位置；注射器在39℃水浴，在48小時內(nèi)讀取活塞位置，計數(shù)點為2h、4h、6h、8h、24h、48h。用計數(shù)點活塞位置減去活塞的初始位置，即為在相應(yīng)時間內(nèi)飼料發(fā)酵的產(chǎn)氣量；(6)瘤胃發(fā)酵液pH值的測定發(fā)酵物樣品被采集后，采用Sartorius PB-20型酸度計對發(fā)酵物樣品進行pH值測定；(7)瘤胃發(fā)酵液氨氮濃度的測定采用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水；試劑包括A液苯酚顯色劑(1L)1)稱取0. 05g亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5NO·2H2O)溶解于0.5L蒸餾水中；2)稱取10g干燥苯酚(C6H5OH)，移入上述1L的容量瓶中，用蒸餾水定容至1L；3)將上述2L的溶液小心移入棕色瓶內(nèi)，在2～10℃下避光保存，保質(zhì)期6個月；B液次氯酸鹽試劑(1L)1)5g氫氧化鈉(NaOH)溶于燒杯中，加入600ml蒸餾水；2)37. 85g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2O)適當加熱溶解搖勻；3)冷卻后，加100ml次氯酸鈉(含氯5.25％)混勻；4)蒸餾水定容至1L；5)1#濾紙過濾后，在2～10℃下，避光保存于聚乙烯瓶中，保質(zhì)期6個月；氨標準溶液1)貯備液為32mg/dl；2)1. 0045g NH4Cl溶于800ml去氨蒸餾水中；3)用稀釋的鹽酸滴定至pH值為2；4)蒸餾水定容至1L；5)用貯備液配制以下溶液32，16，8，4，2，1，0mg/dl標準溶液；(8)瘤胃液樣品采集1)用兩層精細紗布過濾瘤胃液。2)加入2ml新配制的25％偏磷酸于8ml兩層紗布過濾的瘤胃液中，封蓋，搖勻。3)若不立即測定在-20℃保存。4)分析前在11～12,000rpm下離心20min，上清液用于分析。測定步驟1)漩渦振蕩上清液；2)用“Digiflex”自動進樣器，吸取40μl瘤胃液或標準液加40μl蒸餾水至貼好標簽的試管中，同時設(shè)重復(fù)；3)吸取A液2. 5ml加入每個試管，漩渦振蕩；4)吸取B液2. 0ml加入每個試管，漩渦振蕩；5)在37℃水浴中加熱30min；6)550nm下讀數(shù)(波長為500～660nm)；若顯色太重，用較小的波長測定，或?qū)悠酚谜麴s水1:1稀釋；7)用線性回歸估測標準曲線；8)吸收值代入方程，對于瘤胃液NH3-N，計算結(jié)果*1.25校正偏磷酸誤差；(9)瘤胃發(fā)酵液VFA濃度的測定試驗中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水；島津GC-2010型氣相色譜儀，氣相色譜條件柱箱溫度120℃、色譜柱為長30m，內(nèi)徑0.22mm，薄膜厚度0.25μm的中極性毛細管柱、SPL230℃、壓力97.7kPa、氫氣流量40ml/min、空氣流量400ml/min、FID240℃；采用外標法，配制一系列已知濃度的色譜標準酸。樣品注入量為1μl，即將乙酸400μl，丙酸400μl和丁酸200μl用超純水定容至100ml，然后用氣相色譜儀繪制色譜圖，計算各酸的保留時間和峰面積，按單點法將樣品測定結(jié)果-峰面積值換算成各揮發(fā)性脂肪酸的摩爾濃度(mmol/L)；樣品處理取四層紗布過濾的瘤胃液5mL，10000g離心10min；移取上清液1mL至小離心管中，并加入冰后的25％的偏磷酸0.25mL，靜置30min；然后10000g離心15min，取上清液直接進行測定；(10)瘤胃發(fā)酵液中微生物蛋白MCP的測定量取50mL經(jīng)4層紗布過濾的瘤胃液，于39℃下150g離心5min；準確量取30mL上清液于4℃下20000g離心20min，沉淀加入30mL蒸餾水輕輕搖動溶解后于4℃下20000g離心20min，沉淀經(jīng)生理鹽水和蒸餾水沖洗后再重復(fù)加入蒸餾水離心一次，以充分消除飼料氮源后，收集細菌沉淀備用，將上述高速離心收集的細菌沉淀小心無損地轉(zhuǎn)移到消化管中，按凱氏微量定氮法常規(guī)測定。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肽用于調(diào)控奶牛瘤胃發(fā)酵的體外應(yīng)用及檢測方法，可準確測定肽對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響產(chǎn)氣量、pH值、氨態(tài)氮值、揮發(fā)性脂肪酸和MCP指標是瘤胃發(fā)酵的重要指標，對他們的測定可以直接了解活體瘤胃內(nèi)發(fā)酵的具體情況，還可準確測定肽對瘤胃內(nèi)微生物酶活性的影響淀粉酶、蛋白水解酶和羧甲基纖維素酶活性是瘤胃內(nèi)主要的酶活指標，對他們的測定可以直接了解活體瘤胃內(nèi)微生物的變化情況。本發(fā)明方法具有方便易學(xué)，操作簡便，重復(fù)性高，數(shù)值準確，模擬逼真性強的特點，能有效地確定奶牛瘤胃內(nèi)肽適宜的大致濃度。能夠為今后更深入的理論研究、更準確的配制奶牛日糧、減少蛋白飼料的浪費，提高奶制品質(zhì)量做出科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。
文檔編號G01N7/20GK101413940SQ20081020961
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者單安山, 寧 馬, 馬清泉 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)