專利名稱：：血清hsp27在制備原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒中的應(yīng)用的制作方法血清HSP27在制備原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒中的應(yīng)用本發(fā)明涉及一種癌癥診斷技術(shù)，特別是血清HSP27在原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒制備中的應(yīng)用。[
背景技術(shù)：
]肝細胞肝癌(H印atocellularcarcinoma,HCC)是一個在東亞和南亞地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)位居第五，而且在腫瘤致死率中位于第三，每年大概有25萬到100萬人會得肝癌，每年因為肝癌而死亡的人口在20萬左右。目前，肝細胞癌的高發(fā)病率、高死亡率及其逐年增高的趨勢，已成為一個極其嚴重的國際衛(wèi)生問題。造成肝癌發(fā)病的原因很復(fù)雜，從環(huán)境影響和生活習慣角度說，攝入了黃曲霉污染的食物、酗酒、以及乙型、丙型肝炎病毒的感染等等都會提高肝癌發(fā)生的可能性。從1990年開始，HCC在中國的腫瘤致死原因中高居第二，乙肝病毒被認為是最主要的風險因子。肝細胞癌也是中國華南地區(qū)常見惡性腫瘤之一，尋找HCC的早期血清學(xué)診斷標志物，對于肝癌的預(yù)防和早期治療均具有重要意義。AFP是胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白，肝細胞癌患者血清AFP含量升高，但有部分患者AFP在正常范圍內(nèi)。原發(fā)性肝細胞癌迄今為止尚缺乏早期準確預(yù)測，主要問題是(1)AFP陰性肝癌的早期診斷；(2)伴有肝病活動的AFP陽性肝癌與伴有AFP升高的慢性肝病相鑒別；及(3)微小肝癌的早期診斷。長期以來，AFP作為原發(fā)性肝癌的診斷指標，為臨床作出了重大的貢獻，對肝癌診斷的重要意義已得到臨床肯定。特別是AFP異癌發(fā)生的關(guān)系，對于肝癌的早期診斷有較高的應(yīng)用價值。但是，AFP的敏感性是有限的；特別是近年來，AFP陰性的HCC患者有上升趨勢。本研究中，肝癌組患者AFP單項的敏感性為60.53%、特異性82.09%，陽性預(yù)測值是79.31%，僅憑AFP診斷肝癌易造成漏診和誤診，單項AFP診斷肝癌不夠理想。因此，尋找AFP之外的腫瘤早期標志物是當務(wù)之急。[
發(fā)明內(nèi)容]熱休克蛋白27(HSP27)作為熱休克蛋白家族中的低分子蛋白，廣泛表達于各種組織細胞中。研究發(fā)現(xiàn)，HSP27除作為分子伴侶保護細胞外，還通過調(diào)節(jié)細胞生長分化、抑制細胞凋亡。高度表達HSP27的細胞，其發(fā)生多種腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌及消化系腫瘤等的危險性大大增高，且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程、惡性程度及T順分期及預(yù)后有關(guān)，HSP27可作為腫瘤預(yù)后好壞的可信指標之一。通過檢測正常人、乙肝病毒攜帶者和HCC患者血清中HSP27的含量，通過統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)HSP27含量與HCC的相關(guān)性，并且結(jié)合血清AFP的平行檢測，希望為原發(fā)性肝細胞癌的臨床血清學(xué)早期診斷找到新的生物標記物。本發(fā)明公開了一種原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒及其制備方法與應(yīng)用，該試劑盒可以快速、準確地進行HSP27的檢測，從而可以對各期(特別是早期)原發(fā)性肝細胞癌作出快速的輔助診斷，具有重要的臨床應(yīng)用價值。本發(fā)明包括建立了基于雙抗體夾心原理的酶聯(lián)免疫診斷系統(tǒng)。由于血清不用稀釋，因此靈敏度大大提高。本發(fā)明有益的積極效果是檢測試劑盒操作簡單、試劑穩(wěn)定、重復(fù)性好、特異性強、敏感性高、操作簡單，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景。[]圖l是正常人組、HBV感染組、肝癌組患者血清HSP27值誤差條形圖。l.正常人組，2.HBV感染組，3.肝細胞癌組，P(2:D〉0.05;P(3:l)復(fù)Ol;P(3:1+2)<0.01。圖2是正常人、慢性HBV感染、急性HBV感染、小肝癌、中等大肝癌和大肝癌患者血清HSP27值誤差條形圖。l.正常人HBV組，2.慢性HBV組，3.急性HBV組，4.小肝癌，5.中等大肝癌，6.大肝癌；P(2:1)>0.05;P(3:D〉0.05;P(4:1)<0.05;P(5:1)<0.01;P(6:1)<0.01;P(3:2)>0.05;P(4:2)<0.05;P(5:2)<0.01;P(6:2)<0.01;P(4:3)<0.05;P(5:3)<0.01;P(6:3)〈0.01。圖3是正常人組、HBV慢性感染組、HBV急性感染組、AFP陰性肝細胞癌組和AFP陽性肝細胞癌組患者血清HSP27值誤差條形圖，l.正常人組，2.HBV慢性感染組，3.HBV急性感染組，4.AFP《25ug/L肝細胞癌組，5.AFP〉25ug/L肝細胞癌組.P(4:1)<0.01;P(5:1)<0.01;P(5:2)〈0.01;P(4:3)<0.01;P(5:3)<0.01。圖4是AFP陽性的HBV感染組、小肝癌組、中等大肝癌組、大肝癌組、AFP陰性肝細胞癌組和AFP陽性肝細胞癌組患者血清HSP27值誤差條形圖。l.AFP陽性(AFP〉25"g/L)的HBV感染組，2.小肝癌組，3.中等大小肝癌組，4.大肝癌組，5.AFP《25yg/L肝癌組，小肝癌《5厘米，5厘米〈中等大小肝癌〈10厘米，大肝癌》10厘米。P(2:1)<0.05;P(3:1)<0.01;P(4:1)<0.01;P(5:1)<0.01;P(6:1)<0.01;[具體實施方式]HBV攜帶者血清中熱休克蛋白27(HSP27)的水平雖然比正常對照組有輕微的升高，但是沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p〉0.05)(表1，圖1);而HCC患者平均的HSP27水平明顯高于正常對照組(/X0.01)和冊V攜帶者(;KO.Ol)(表1，圖1)，其中小肝癌與正常對照組(p<0.05)、慢性HBV感染者組(/X0.05)及急性HBV感染組(/K0.05)也有統(tǒng)計學(xué)意義，提示HCC患者細胞大量分泌HSP27入血清(表2，圖2)。此外，我們發(fā)現(xiàn)AFP《25^g/L肝癌組及AFP>25Pg/L肝癌組與正常對照組(p<0.01)、慢性HBV感染者組及急性HBV感染組(p〈0.01)比較，均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，提示我們，在AFP陰性HCC患者中，HSP27也許是一個較好的檢測指標(圖3)。此外，原發(fā)性肝癌組(P〈0.01)、小肝癌組(P〈0.05)、中等大小肝癌組(P<0.01)、大肝癌組(P〈0.01)、AFP《25Pg/L肝癌組(P<0.01)及AFP>25^g/L肝癌組(P〈0.01)與AFP陽性(AFP>25Pg/L)的HBV感染組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義或顯著意義(圖4)。由于肝細胞癌具有較高的異質(zhì)性，同時檢測2種或以上的腫瘤生物標記物被認為是腫瘤早期診斷的較好選擇。我們的結(jié)果清楚表明，在患病率(26.57%)和驗前比(0.36)不變的情況下，HSP27可以作為HCC的早期血清學(xué)診斷生物標志物，特別是當HSP27與經(jīng)典標志物AFP相結(jié)合檢測原發(fā)性肝細胞癌時，診斷的敏感性(78.95%)、陰性預(yù)測值(76.47%)和陽性似然比(3.53)都大大提高；陽性預(yù)測值(80.00%)、陽性驗后比(1.27)也有所改善(表3)。這些都大大提高了HCC的早期診斷率并減少了誤診率，彌補了單純檢測AFP的不足。如此，由于HSP27和AFP都與原發(fā)性肝細胞癌有高度相關(guān)性，這就使得兩者平行檢測，對原發(fā)性肝細胞癌具有早期診斷意義。表1.兩種血淸標志物測定結(jié)果均值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2.正常人組、HBV慢性感染組、HBV急性感染組、小肝癌組、中等大小肝癌組、人肝癌組、AFP《25貼/L肝細胞癌組和AFP>25ng/L肝細胞癌組患者血清HSP27值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>病例選擇及試驗方法隨機血清樣品包括25份經(jīng)臨床實驗室檢測沒有感染HBV、HCV、HIV，沒有糖尿病和腎病，也沒有腫瘤的正常體檢人群血清樣品；42份HBV攜帶者血清，其中慢性HBV病毒攜帶者22名，急性HBV感染者20名(其中12名AFP>25^g/L);76份原發(fā)性肝細胞癌患者血清樣品，其中包括26份小肝癌(直徑《5cm)，32份中等大小肝癌(5〈直徑〈10cm)，18份大肝癌(直徑》10cm)。并且，在全部檢測的HCC樣品中，AFP《25Pg/L占30份，AFP>25Pg/L占46份。所有肝癌病例均經(jīng)CT和病理診斷確診。血清AFP臨床檢測采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，其參考值為25Pg/L;所用儀器為美國Beckman公司Access全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，試劑盒由Beckman公司提供；均嚴格按照提供說明書操作程序進行，在有效期內(nèi)使用并設(shè)有室內(nèi)質(zhì)控，過程全自動化測定。HSP27ELISA試劑盒組成1、包被在固相96孔酶標板上的人HSP27重組單克隆抗體；2、酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶(l冊))標記的人HSP27重組單克隆抗體反應(yīng)液；3、陽性對照為人HSP27標準蛋白，陰性對照為標準陰性血清；4、顯色液ABTS底物ABTSlmg+O.1M,pH5.0檸檬酸緩沖液2ml+3%H2024iUOIS用時配)；5、洗滌液(0.05%Tween20-PBS);6、結(jié)合物稀釋液0.1XBSA-PBS(用于稀釋標本、標準品和結(jié)合物)7、終止液(2MH2S04)。測定方法1.包被包被緩沖液(0.05M，pH9.6Na2C03-NaHC03緩沖液)稀釋HSP27單克隆抗體粗提蛋白至2yg/ml,加入96孔板，100u1/孔，放4°C，24小時。2.封閉洗滌液沖洗96孔板6次，加結(jié)合物稀釋液200ii1/孔，放37°C，2.5小時。3.加待檢樣品洗滌液沖洗96孔板6次，加待檢樣品及結(jié)合物稀釋液稀釋的標準品100li1/孔，放37"C，2小時。4.加酶標抗體洗滌液沖洗96孔板6次，結(jié)合物稀釋液稀釋酶標抗體至1:1000，加入96孔板，100ul/孔，放37。C,2小時。5.顯色洗滌液沖洗96孔板6次，顯色液ABTS底物，加入96孔板，100pl/孔，加終止液室溫下或37i:顯色1530分鐘。6.標準曲線根據(jù)標準品OD值繪制標準曲線，在標準曲線上查出待檢標木的含量。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS16.0軟件包((StatisticatPackagefortheSocialSciences,Chicago,IL，USA)。采用兩獨立樣品的非參數(shù)秩和檢驗(數(shù)據(jù)方差不齊)，血清標志物測定結(jié)果采用均值士2SD表示；所有尸值(兩側(cè)檢驗)均取至少3位小數(shù)，尸<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義，尸<0.01被認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義。由于沒有統(tǒng)一的參考值，為了最大限度保證我們的研究的科學(xué)性和可比性，我們?nèi)≌φ战M95%可信區(qū)間(均值+2SD)為HSP27的正常參考值。權(quán)利要求1、一種原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒，它包括A.包被在固相96孔酶標板上的人HSP27重組單克隆抗體；B.酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標記的人HSP27重組單克隆抗體反應(yīng)液；C.陽性對照為人HSP27標準蛋白，陰性對照為標準陰性血清；D.顯色液ABTS底物ABTS1mg+0.1M，pH5.0檸檬酸緩沖液2ml+3％H2O24μl；E.洗滌液0.05％Tween20-PBS；F.結(jié)合物稀釋液0.1％BSA-PBS；G.終止液2MH2SO4。2、血清HSP27在制備原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種癌癥診斷技術(shù)，特別是血清HSP27在原發(fā)性肝細胞癌診斷試劑盒制備中的應(yīng)用。該試劑盒可以快速、準確地進行HSP27的檢測，從而可以對各期(特別是早期)原發(fā)性肝細胞癌作出快速的輔助診斷，具有重要的臨床應(yīng)用價值。本發(fā)明包括建立了基于雙抗體夾心原理的酶聯(lián)免疫診斷系統(tǒng)。由于血清不用稀釋，因此靈敏度大大提高。本發(fā)明有益的積極效果是檢測試劑盒操作簡單、試劑穩(wěn)定、重復(fù)性好、特異性強、敏感性高、操作簡單，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景。文檔編號G01N33/574GK101514989SQ200810220190公開日2009年8月26日申請日期2008年12月19日優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日發(fā)明者孔祥復(fù),廖奕佶,蕭朱,李東培,武鴻美,毅王,丹謝,鄧海霞,陳敏山申請人:中山大學(xué)