專利名稱：血清總IgE測定診斷試劑盒及制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體是涉及一種血清總免疫球蛋白E (總IgE)測定診斷試劑盒及制備和使用方法。
背景技術(shù)：
過敏性疾病是指機體對某些抗原初次應(yīng)答后，再次接受相同抗原刺激時發(fā)生的一種以機體生理功能紊亂或組·織損傷為主的病理性免疫應(yīng)答。臨床過敏性疾病主要指I型過敏反應(yīng)，發(fā)生機制為過敏原(allergen)進入機體后可刺激B淋巴細胞產(chǎn)生特異性IgE(SlgE)抗體，IgE與肥大細胞或嗜堿性粒細胞結(jié)合使機體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)相同過敏原再次進入已致敏狀態(tài)機體時，就可與特異性IgE抗體結(jié)合而觸發(fā)細胞活化，產(chǎn)生過敏反應(yīng)。近年來，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，生活環(huán)境的改善和生活方式的變化，過敏性疾病正在迅速增力口，同時引起公眾和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛重視。體內(nèi)存在多種B淋巴細胞克隆，每種克隆之間攜帶不同抗原受體，用來識別不同抗原分子(抗原表位)。機體針對過敏原的免疫應(yīng)答同樣遵循上述規(guī)律，不同過敏原可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性各異IgE分子，一般稱之為特異性IgE(SlgE)。盡管不同SlgE可變區(qū)的一級結(jié)構(gòu)(氨基酸種類和順序)不同，但人類IgE的恒定區(qū)具有相同的一級結(jié)構(gòu)，具有相同的抗原特異性，能夠被鼠(或兔)抗人IgE抗體識別。人體內(nèi)各種特異性IgE總和，我們稱之為總IgE (簡寫IgE)。研究發(fā)現(xiàn)，正常人血清總IgE水平很低，但在發(fā)生過敏反應(yīng)時會顯著升高。臨床上，總IgE測定常作為過敏反應(yīng)性疾病的初篩試驗。測定總IgE雖不能說明對何種物質(zhì)過敏，但在鑒別過敏與非過敏的問題上有一定價值。資料顯示，在變態(tài)反應(yīng)性疾病中，78%的患者總IgE高于110kU/L，而非變態(tài)反應(yīng)性疾病中84%低于25kU/L。另約有20% 30%的變態(tài)反應(yīng)性疾病患者特異性IgE高而總IgE正常。目前檢測總IgE水平的實驗方法比較成熟并有商品化試劑盒出售，一般采用雙抗體夾心法。具體方法有放射免疫分析、酶免疫分析和發(fā)光免疫分析，其中以酶免疫標(biāo)記較為普及。酶免疫分析采用雙抗體夾心測定模式，測定原理如下兩種不同的抗體，分別包被微孔板和標(biāo)記辣根過氧化物酶(或堿性磷酸酶)。先加入待測血清，血清中IgE與固相表面抗-IgE結(jié)合。洗滌去除未參加反應(yīng)的物質(zhì)，再加入酶標(biāo)記抗人-IgE抗體，形成固相抗體-待測IgE-酶標(biāo)抗體復(fù)合物并吸附于固相材料表面。未結(jié)合的物質(zhì)通過洗滌去除。加入顯色底物顯色，通過測量顏色的變化來判斷標(biāo)本中IgE的濃度。放射免疫分析采用放射性核素(125I)作為標(biāo)記物，采用雙抗體夾心分析模式。放射免疫分析的主要缺點是放射性核素帶來的環(huán)境污染；同時，放射性標(biāo)記物半衰期短，試劑盒貨架期短，不便于儲存。國內(nèi)酶免疫分析采用辣根過氧化物酶(HRP)作為標(biāo)記物，采用雙抗體夾心兩步法檢測模式。酶聯(lián)免疫分析主要缺點是酶活性受多種因素影響，重復(fù)性差，每次操作均需制作標(biāo)準曲線，會增加單份標(biāo)本的檢測成本；同時，酶免疫分析采用微孔反應(yīng)板作為固相材料，微孔板表面積有限不能包被足夠抗體，容易產(chǎn)生“鉤狀效應(yīng)”，導(dǎo)致錯誤檢測結(jié)果。此外，近年來免疫濁度分析也用于血清總IgE的測定。乳球增強比濁以納米乳膠微球作為固相載體，包被兔抗人IgE抗體形成致敏微球；血清中待測IgE與受體微球表面抗人IgE結(jié)合，導(dǎo)致微球相互聚集，從而使體系的濁度發(fā)生變化。免疫濁度分析具有操作簡單的優(yōu)點，但血脂、溶血標(biāo)本均會影響檢測結(jié)果；同時，免疫比濁分析受抗原、抗體比例影響較大，檢測范圍較窄，而臨床標(biāo)本IgE范圍較寬,超出檢測范圍的標(biāo)本需要稀釋才能獲得準確結(jié)果。此外，不論發(fā)射免疫分析，還是酶免疫分析，由于標(biāo)記抗體為過量，檢測前均需要去除未參加反應(yīng)的標(biāo)記抗體。此時，通過檢測與待測抗原結(jié)合的標(biāo)記抗體，才能與待測抗原呈正比例關(guān)系。在標(biāo)記免疫分析技術(shù)中，固相吸附分離是分離游離標(biāo)記抗體的重要方法，即需要固相材料吸附捕獲抗體-待檢抗原-標(biāo)記抗體。固相吸附分離方法有兩個重要環(huán)節(jié)包被和洗滌。固相吸附分離方法設(shè)計巧妙，操 作簡單，故應(yīng)用非常廣泛。但是，此種非均相反應(yīng)模式因包被和洗滌環(huán)節(jié)的存在，給標(biāo)記免疫分析造成很大缺陷，主要表現(xiàn)在以下兩個方面I.在包被過程，無論物理吸附還是化學(xué)連接，包被于固相材料表面的抗體分子其構(gòu)象不同于處于液相中的抗體分子，與抗原分子結(jié)合能力因空間位阻效應(yīng)將受到一定限制；無論采用微球還是微孔板作為固相材料，由于包被面積有限，捕獲抗體分子不能最大限度滿足大量待測抗原的需要，由此將影響檢測范圍。2. “洗板”或“洗球”是非均相免疫分析中的重要環(huán)節(jié)且多次出現(xiàn)。洗滌過程增加檢測程序的復(fù)雜性，增加檢測時間并給實現(xiàn)自動化帶來障礙。此外，由于洗滌過程特別是酶免疫分析，難于實現(xiàn)標(biāo)準化，每個測試孔之間洗滌效果不同，在一定程度上影響檢測的精密度，出現(xiàn)批間、批內(nèi)差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種血清總IgE均相發(fā)光免疫測定診斷試劑盒及制備和使用方法，以解決現(xiàn)有非均相免疫試劑盒繁瑣洗滌步驟；同時，克服放射免疫分析環(huán)境污染，貨架期短的缺陷，克服酶免疫分析重復(fù)性差，易發(fā)生“鉤狀效應(yīng)”缺陷。本發(fā)明采用發(fā)光免疫分析，具有較高的敏感度和精密度，檢測精度遠高于免疫比濁分析。本發(fā)明的檢測原理如圖3所示利用均相發(fā)光免疫測定方法，在受體微球(發(fā)光微球)表面包被兔抗人IgE多克隆抗體，得到抗體包被的受體微球；將鼠抗人IgE單克隆抗體標(biāo)記生物素，制備生物素標(biāo)記抗體；同時，在供體微球(感光微球)表面已預(yù)先包被鏈霉親和素。當(dāng)檢測到體系中存在待測IgE，IgE同時與生物素標(biāo)記抗體和受體微球表面的兔抗人IgE多克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,并于受體微球表面形成雙抗體夾心復(fù)合物；此時,如加入供體微球，生物素與鏈霉親和素結(jié)合而使得兩個微球相互靠近，在激發(fā)光源的激發(fā)下，供體微球釋放單線態(tài)氧，在溶液中碰到受體微球后產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，從而更進一步激發(fā)同一個微球上的熒光基團產(chǎn)生級聯(lián)放大反應(yīng)產(chǎn)生熒光。此時，待測IgE越多，熒光強度越強，根據(jù)發(fā)光的強弱定量檢測血清中總IgE的含量。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種血清總IgE均相發(fā)光免疫測定診斷試劑盒，所述試劑盒包括(I) IgE 標(biāo)準品(校準品):6 個濃度，分別是 1000IU/ml, 500IU/ml, 200IU/ml,100IU/ml,50IU/ml,0IU/ml ；(2)生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液濃度為0. 335-0. 67微克/毫升，優(yōu)選0. 447微克/毫升；(3)包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液濃度為5 20微克/毫升，優(yōu)選10微克/暈升；(4)鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液，濃度為20 80微克/毫升，優(yōu)選50微克/暈升。所述的鼠抗人IgE單克隆抗體、兔抗人IgE多克隆抗體為商品化試劑，可市售得到。舉例如，鼠抗人IgE單克隆抗體可選自abeam公司的Anti-IgE antibody (Mousemonoclonal [4C3] to IgE),貨號abl06494 ;兔抗人IgE多克隆抗體可選自abeam公司的Anti-IgE antibody (Rabbit polyclonal to IgE,),貨號ab75673。 鼠抗人IgE單克隆抗體、兔抗人IgE多克隆抗體應(yīng)滿足如下主要指標(biāo)特異性免疫原采用人IgE的重鏈，與人IgE有良好特異性，但與人IgG、IgA、IgM交叉反應(yīng)率低于0.01 %。親和力在檢測范圍內(nèi)(0 1000IU/ml)表現(xiàn)良好結(jié)合，能夠獲得良好劑量-反應(yīng)曲線。效價酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)大于1/15000。純度蛋白A親和層析純，純度大于99%。所述受體微球、供體微球均為商品化試劑。受體微球用于包被兔抗人IgE多克隆抗體。受體微球為醛基修飾的發(fā)光微粒，通過醛基與抗體分子連接，形成抗體包被的受體微球。發(fā)光微粒內(nèi)含有發(fā)光化合物及鑭系元素化合物的螯合物，發(fā)光化合物為二甲基噻吩的衍生物，鑭系元素化合物可以是Eu (TTA) 3/T0P0或Eu(TTA)3/Phne。受體微球可購自鉬金埃爾默有限公司，貨號6762001。供體微球內(nèi)含有感光化合物酞箐染料(魯米諾類化學(xué)發(fā)光物質(zhì))，同時供體微球內(nèi)含有活潑醛基，并預(yù)先包被有鏈霉親和。供體微球可購自鉬金埃爾默有限公司，貨號6760002S。進一步的，所述試劑盒中還包括不透明微孔板，例如均相發(fā)光96孔反應(yīng)板。本發(fā)明還提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括如下步驟(I)配制緩沖液分別配制0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液；0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖溶液；0. 1M，pH 8. 0磷酸鹽緩沖溶液；0. 1M，pH 8. OTris-HCl緩沖液；(2)總IgE標(biāo)準品配制取IgE純品，用含20%滅活小牛血清的0. IM pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液配制成0、50、100、200、500、1000IU/ml的系列標(biāo)準品溶液各I毫升；(3)制備包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球；(4)配制受體微球工作液用pH 8. 0,0. IM Tris-HCl緩沖液將包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球稀釋到相應(yīng)濃度，如10微克/毫升；(5)制備生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液；
(6)將IgE標(biāo)準品、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液組裝成試劑盒成品。優(yōu)選的，包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球由如下步驟制備得到(I)預(yù)處理抗體和含量測定將欲標(biāo)記的兔抗人IgE多克隆抗體裝入透析袋中，置于0. IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖液透析，透析后用紫外分光光度計測定抗體含量，調(diào)整濃度至1-2毫克/毫升。(2)洗滌微球 取50微升，濃度為20毫克/毫升的受體微球置于I. 5毫升塑料離心管中，加入0. IMpH 8.0磷酸鹽緩沖鹽水溶液，離心洗滌1-2次，每次16000rpm 15分鐘，棄上清液，待用(目的是將微球沉淀，與溶液分離達到洗滌目的)；(3)標(biāo)記上述離心管內(nèi)加入0. I毫克兔抗人IgE多克隆抗體，并用0. IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液定容至200微升，再依次加入I. 25微升10%吐溫20溶液、10微升新鮮配制的400mM氰基硼氫化鈉溶液，充分混勻置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)48小時以上(含48小時)；(4)封閉用SOOmM氫氧化鈉溶液配制溶度為65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，取10微升羧甲氨基胺溶液于標(biāo)記后的離心管內(nèi)，置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)I小時；(5)洗球?qū)⒔?jīng)步驟(4)處理后的離心管置于離心機內(nèi)，16000rpm離心15分鐘，棄上清液，再加入200微升0. 1M，pH 8. 0的Tris-HCl溶液，重新懸浮微球；重復(fù)離心，再次懸浮至50微升，得所述包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球。優(yōu)選的，所述生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液由如下步驟制備得到將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與鼠抗人IgE單克隆抗體的摩爾比為20 I的比例將二者混合反應(yīng)，將反應(yīng)后的液體用0. lM，pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液進行透析，得所述生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液。用紫外吸收測定蛋白濃度，經(jīng)優(yōu)化確定最佳生物素標(biāo)記抗體稀釋倍數(shù)，組裝試劑盒時，優(yōu)選稀釋至濃度為0. 447微克/毫升裝瓶即可。本發(fā)明還提供了一種用上述試劑盒檢測血清總IgE的方法，包括如下步驟(I)取不透明微孔板，向微孔內(nèi)依次加入IgE標(biāo)準品或待檢血清、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液和包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液，混勻后置37°C溫育30分鐘，以使抗原抗體充分結(jié)合；(2)再避光加入鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球，混勻后置37°C溫育15分鐘，使親和素與生物素結(jié)合，從而使兩微球相互靠近；(3)測定微孔內(nèi)的反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光強度；(4)以加入的已知不同濃度的IgE標(biāo)準品的熒光強度檢測值，用四參數(shù)擬合方式繪制IgE濃度-熒光強度標(biāo)準曲線；(5)測量待檢血清的熒光強度，通過標(biāo)準曲線計算得到待檢血清中總IgE的濃度。優(yōu)選的，激發(fā)波長為670 690nm，更優(yōu)選激發(fā)波長680nm ;所述發(fā)光強度的檢測波長為520 620nm，優(yōu)選檢測波長為615nm。
本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是I、本發(fā) 明采用均相的方法，混合后即可測定，無需洗板等繁瑣步驟，因此可縮短檢測時間，同時因沒有洗滌過程可減少因洗滌而造成的偏差，使批間及批內(nèi)差異小，重復(fù)性好，克服放射免疫分析環(huán)境污染，貨架期短的缺陷及酶免疫分析重復(fù)性差，易發(fā)生“鉤狀效應(yīng)”的缺陷；2、與酶免疫分析相比，本發(fā)明檢測熒光強度時所采用的發(fā)光檢測儀具有很強的抗干擾能力，使背景信號很低，檢測的靈敏度遠高于免疫比濁分析；3、本發(fā)明的試劑盒檢測試劑成本低，能夠快速測定過敏患者血清中總IgE濃度，從而輔助臨床更好地進行脫敏治療，臨床推廣好。


圖I是本發(fā)明包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球制備流程圖。圖2是本發(fā)明試劑盒操作流程示意圖。圖3是本發(fā)明的檢測原理圖。圖4是本發(fā)明的IgE濃度-熒光強度標(biāo)準曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不限定本發(fā)明的保護范圍。實施例I一種血清總IgE均相發(fā)光免疫測定診斷試劑盒，包括(I) IgE 標(biāo)準品(校準品):6 個濃度，分別是 1000IU/ml, 500IU/ml, 200IU/ml,100IU/ml,50IU/ml 和 OlU/ml ；(2)生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液濃度為0. 447微克/毫升；鼠抗人IgE 單克隆抗體購自 abeam 公司的 Anti-IgE antibody (Mouse monoclonal [4C3] to IgE),貨號abl06494 ；(3)包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液濃度為10微克/毫升；受體微球購自鉬金埃爾默有限公司，貨號6762001 ;兔抗人IgE多克隆抗體購自abeam公司的Anti-IgE antibody (Rabbit polyclonal to IgE,),貨號ab75673。(4)鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液，濃度為50微克/毫升，購自鉬金埃爾默有限公司，貨號6760002S。[5]均相發(fā)光96孔反應(yīng)板通過如下步驟制備上述的試劑盒(I)配制緩沖液按下述方法分別配制0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液；0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖溶液；0. 1M，pH 8. 0磷酸鹽緩沖溶液；1M，pH 8. OTris-HCl緩沖液；(I)磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)O. IM pH 7. 4ddH20 (雙蒸水) 800 毫升NaH2PO4 2H20 2. 96 克Na2HPO4 12H20 29 克
NaCl8. 5克充分溶解后，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4，加 ddH20 定容至 I 升(2)磷酸鹽緩沖溶液(PB) 0. IM pH 7. 4ddH20 (雙蒸水)3. 6 升NaH2PO4 2H20 (磷酸二氫鈉) 11. 84 克Na2HPO4 12H20 (磷酸氫二鈉)116 克充分溶解后，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4，加ddH20定容至4升(3)磷酸鹽緩沖溶液(PB) 0. IM pH 8. 0ddH20 (雙蒸水)3. 6 升NaH2PO4 2H20 (磷酸二氫鈉) 11. 84 克
Na2HPO4 12H20 (磷酸氫二鈉)116 克充分溶解后，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 0，加ddH20定容至4升
(4) Tris-HCl 0. IM pH 8.0Tris (三羥甲基氨基甲烷)12. 12克ddH20 (雙蒸水)70毫升充分溶解后，用HCl調(diào)節(jié)pH至8. 0，加ddH20定容至100毫升(2)總IgE標(biāo)準品配制取IgE純品，用含20%滅活小牛血清的0.1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液配制成0、50、100、200、500、1000IU/ml的系列標(biāo)準品溶液各I毫升，并用質(zhì)控血清(國際Iyphochek質(zhì)控血清，貨號371-373)校準。(3)制備包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球，流程圖如圖I所示。[I]預(yù)處理抗體和含量測定將欲標(biāo)記的兔抗人IgE多克隆抗體裝入透析袋中，置于0. IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖液透析，透析后用紫外分光光度計測定抗體含量，調(diào)整濃度至1-2毫克/毫升。[2]洗滌微球取50微升，濃度為20毫克/毫升的受體微球置于I. 5毫升塑料離心管中，加入0. IMpH 8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液，離心洗滌1-2次，每次16000rpm分鐘，棄上清液，待用；[3]標(biāo)記上述離心管內(nèi)加入0. I毫克兔抗人IgE多克隆抗體(即抗IgE抗體)，并用0. IMpH8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液定容至200微升，再依次加入I. 25微升10%吐溫20溶液、10微升新鮮配制的400mM氰基硼氫化鈉溶液，充分混勻置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)48小時以上；[4]封閉用SOOmM氫氧化鈉溶液配制溶度為65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液，加10微升羧甲氨基胺溶液于標(biāo)記后的離心管內(nèi)，置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)I小時；[5]洗球?qū)⒔?jīng)步驟(4)處理后的離心管置于離心機內(nèi)，16000XG離心15分鐘，棄上清液，再加入200微升100mM，pH 8. 0的Tris-HCl溶液，重新懸浮微球；重復(fù)離心，再次懸浮至50微升備用；(4)配制受體微球溶液
用pH 8. 0,0. IM TriS-HCl緩沖液將包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球稀釋
至10微克/暈升；(5)制備生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液；將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與鼠抗人IgE單克隆抗體的摩爾比為20 I的比例將二者混合反應(yīng)，將反應(yīng)后的液體用0. IM PBS進行透析，得所述生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液；此溶液為儲備液，濃度為2. 68毫克/毫升,組裝試劑盒時，用0. IM pH 8. 0的Tris-HCl溶液稀釋I : 6000倍至濃度為0. 447微克/毫升裝瓶即可。(6)試劑盒組裝將IgE標(biāo)準品、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液和均相發(fā)光96孔反應(yīng)板組裝成試劑盒成品。實施例2如圖2所示，一種實施例I制備的試劑盒的使用方法，包括如下步驟(I)將IgE標(biāo)準品、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液取出，至室溫平衡20分鐘；在均相發(fā)光96孔反應(yīng)板上做好標(biāo)記；(2)取反應(yīng)板，向微孔內(nèi)依次加入10微升待檢血清或IgE標(biāo)準品、50微升生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液及50微升被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液，混勻后于37°C下溫育15分鐘，以使抗原抗體充分結(jié)合；(3)再避光向微孔中加入100微升鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球，混勻后置37°C溫育15分鐘，使親和素與生物素結(jié)合，從而使兩微球相互靠近；(4)應(yīng)用發(fā)光檢測儀(美國PerkinELmer公司(珀金埃爾默有限公司)，型號Enspire)測定微孔內(nèi)的反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光強度；(5)以實施例I中配制的一系列已知濃度的IgE標(biāo)準品的熒光強度檢測值，數(shù)值如表2所示，用四參數(shù)擬合方式繪制的IgE濃度-熒光強度標(biāo)準曲線如圖4所示。表權(quán)利要求
1.一種血清總IgE均相發(fā)光免疫測定診斷試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括(1)6 個濃度的 IgE標(biāo)準品分別是 1000IU/ml，500IU/ml，200IU/ml，100IU/ml, 50IU/ml和 0IU/ml ； (2)生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液濃度為0.335-0. 67微克/毫升； (3)包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液濃度為5 20微克/毫升； (4)鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液濃度為20 80微克/毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于 所述生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液濃度為0. 447微克/毫升； 所述包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液濃度為10微克/毫升； 所述鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液濃度為50微克/毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括不透明微孔板。
4.一種制備權(quán)利要求1-3任一項所述試劑盒的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)配制緩沖液 分別配制0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液；0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖溶液；0. 1M，pH8. 0磷酸鹽緩沖溶液；0. 1M，pH 8. OTris-HCl緩沖液； (2)總IgE標(biāo)準品配制 取IgE純品，用含20%滅活小牛血清的0. IM pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液配制成0、50、100、200、500、1000IU/ml的系列標(biāo)準品溶液各I毫升； (3)制備包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球； (4)配制受體微球工作液 用pH 8. 0,0. IM Tris-HCl緩沖液將包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球稀釋到相應(yīng)濃度； (5)制備生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液； (6)將IgE標(biāo)準品、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液組裝成試劑盒成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球由如下步驟制備得到 (1)預(yù)處理抗體和含量測定 將欲標(biāo)記的兔抗人IgE多克隆抗體裝入透析袋中，置于0. IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖液透析，透析后用紫外分光光度計測定抗體含量，調(diào)整濃度至1-2毫克/毫升； (2)洗漆微球 取50微升，濃度為20毫克/毫升的受體微球置于I. 5毫升離心管中，加入0. IM pH8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液，離心洗滌1-2次，每次16000rpm 15分鐘，棄上清液，待用； (3)標(biāo)記 上述離心管內(nèi)加入0. I毫克兔抗人IgE多克隆抗體，并用0. IM pH 8. 0磷酸鹽緩沖鹽水溶液定容至200微升，再依次加入I. 25微升10%吐溫20溶液、10微升新鮮配制的400mM氰基硼氫化鈉溶液，充分混勻置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)48小時以上； (4)封閉用SOOmM氫氧化鈉溶液配制溶度為65毫克/毫升的羧甲氨基胺溶液；取10微升羧甲氨基胺溶液于標(biāo)記后的離心管內(nèi)，置37°C溫箱內(nèi)反應(yīng)I小時； (5)洗球 將經(jīng)步驟(4)處理后的離心管置于離心機內(nèi)，16000rpm離心15分鐘，棄上清液，再加入200微升0. lM，pH 8. 0的Tris-HCl溶液，重新懸浮微球；重復(fù)離心，再次懸浮至50微升，得所述包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液由如下步驟制備得到 將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素與鼠抗人IgE單克隆抗體的摩爾比為20 I的比例將二者混合反應(yīng)，將反應(yīng)后的液體用0. 1M，pH 7. 4磷酸鹽緩沖鹽水溶液進行透析，得所述生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液。
7.—種權(quán)利要求1-2任一項所述試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟 (1)取不透明微孔板，向微孔內(nèi)依次加入IgE標(biāo)準品或待檢血清、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液和包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液，混勻后置37°C溫育30分鐘，以使抗原抗體充分結(jié)合； (2)再避光加入鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球，混勻后置37°C溫育15分鐘，使親和素與生物素結(jié)合，從而使兩微球相互靠近； (3)測定微孔內(nèi)的反應(yīng)產(chǎn)物在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生的熒光強度； (4)以加入的已知不同濃度的IgE標(biāo)準品的熒光強度檢測值，用四參數(shù)擬合方式繪制IgE濃度-熒光強度標(biāo)準曲線； (5)測量待檢血清的熒光強度，通過標(biāo)準曲線計算得到待檢血清中總IgE的濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用方法，其特征在于激發(fā)光的激發(fā)波長為670 690nm，熒光強度的檢測波長為520 620nm。
全文摘要
本發(fā)明提供一種血清總IgE測定診斷試劑盒及制備和使用方法。所述試劑盒包括IgE標(biāo)準品、生物素標(biāo)記的鼠抗人IgE單克隆抗體溶液、包被兔抗人IgE多克隆抗體的受體微球溶液和鏈霉親和素標(biāo)記的供體微球溶液。本發(fā)明的試劑盒解決了現(xiàn)有非均相免疫試劑盒繁瑣洗滌步驟；同時克服了放射免疫分析環(huán)境污染，貨架期短的缺陷，克服酶免疫分析重復(fù)性差，易發(fā)生“鉤狀效應(yīng)”缺陷，檢測精度遠高于免疫比濁分析。
文檔編號G01N33/68GK102798725SQ20121028669
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者李會強, 苑鳳君, 周宇捷, 張燕玲 申請人:沃克(天津)生物科技有限公司