專利名稱：：鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條及其制備方法和用途，屬于免疫學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：鎘(Cdmium，Cd)的原子序數(shù)是48，是嚴(yán)重危害人類健康的重金屬之一，主要來源于鎘礦、鎘冶煉廠。因鎘與鋅同族，常與鋅共生，所以冶煉鋅的排放物中必有ZnO，Cd0，它們揮發(fā)性強(qiáng)，以污染源為中心可波及數(shù)千米遠(yuǎn)。隨著我國工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境中重金屬的污染越來越嚴(yán)重。重金屬污染引起的毒害持久存在，會(huì)隨土壤、水體再次循環(huán)而進(jìn)入食物鏈，對(duì)食品安全構(gòu)成威脅，危害人類生命和健康。鎘中毒能使腎功能受到破壞，鎘進(jìn)入呼吸道可引起肺炎、肺氣腫作用于消化系統(tǒng)則引起腸胃炎。鎘中毒者常常伴有貧血，骨骼中有過量鎘積累會(huì)使骨骼軟化、變形、骨折、萎縮，還會(huì)引起癌癥。我國各類食品中重金屬的國家限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量無公害水產(chǎn)品安全要求(2001)中對(duì)鎘含量都有限定《0.lmg/kg。歐盟，美國，日本，韓國等我國水產(chǎn)品的主要出口國對(duì)水產(chǎn)品的重金屬含量的限定也越來越嚴(yán)格，法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)也越來越苛刻。目前重金屬鎘的檢測方法主要有1.物理和化學(xué)的方法原子吸收分光光度法(AAS)，電感耦合等離子體一原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)，電感耦合等離子體質(zhì)譜分析(ICP-MS)，原子熒光光譜分析(AFS)等。這些方法的特點(diǎn)是靈敏、準(zhǔn)確，但是需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，專門的分析技術(shù)人員，且標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，前處理麻煩，不能同時(shí)檢測大量樣品，不適合現(xiàn)場及大規(guī)模的推廣應(yīng)用。2.免疫學(xué)檢測技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA):其檢測的原理是利用樣品中的鎘離子與標(biāo)準(zhǔn)品中鎘離子競爭結(jié)合抗體并以此對(duì)樣品中的鎘進(jìn)行定性或定量分析。該方法比較簡便、快速，可同時(shí)分析大批量樣品。目前國外已研制出重金屬鎘的酶聯(lián)檢測試劑盒。國內(nèi)也有重金屬鎘的ELISA檢測的報(bào)道。膠體金免疫層析法(GICA):其檢測的原理是將各種反應(yīng)試劑(抗原和抗體)以條帶狀固定在同一試紙條上，待檢樣品加在試紙條的一端，通過毛細(xì)作用在試紙條上滲濾、移行并與紙上另一種試劑發(fā)生抗原抗體特異性免疫反應(yīng)，層析過程中免疫復(fù)合物被截留、聚集在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過可目測的膠體金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果，而游離的標(biāo)記物則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離的目的。膠體金免疫層析試紙條因具有體積小、攜帶方便、不需要儀器設(shè)備、操作簡單、可現(xiàn)場檢測、35min出結(jié)果以及結(jié)果可由肉眼根據(jù)T線顏色深淺判斷等諸多優(yōu)點(diǎn)，非常適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場初篩，近幾年在食品安全快速檢測中頗受關(guān)注。目前國內(nèi)外尚未見鎘離子膠體金免疫層析快速檢測方法的報(bào)道，國內(nèi)市場尚無該試紙條產(chǎn)品，因此，自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重金屬鎘離子膠體金免疫層析快速檢測方法及試紙條具有重要價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)和不足，為了實(shí)現(xiàn)大規(guī)模地對(duì)環(huán)境(水體和土壤等)與水產(chǎn)類食品中殘留的重金屬鎘進(jìn)行快速、方便的檢測，保障我國海產(chǎn)品食用安全及維護(hù)我國在相關(guān)國際貿(mào)易領(lǐng)域中的利益，提供一種鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條。本發(fā)明的另一目的在于提供上述鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備方法.本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用上述鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條，該試紙條是以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結(jié)合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙以依次相連的方式粘貼在聚氯乙烯底板上制成的;所述包被后的硝酸纖維素膜上設(shè)置檢測線T線和質(zhì)控線C線，其中檢測線T線靠近樣品墊一端。所述試紙條是以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結(jié)合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙粘貼在聚氯乙烯底板上，其中樣品墊和吸水紙位于兩端，包被后的硝酸纖維素膜的兩端分別位于結(jié)合墊和吸水紙的下面，結(jié)合墊的一端設(shè)置于樣品墊的下面，另一端設(shè)置于包被后的硝酸纖維素膜的上面。所述結(jié)合墊和樣品墊是將玻璃纖維在摩爾濃度為0.015raol/L的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量體積比為10g/L的牛血清白蛋白、質(zhì)量體積比為5g/L的聚乙烯吡咯烷酮和質(zhì)量體積比為0.2g/L的疊氮化鈉組成的混合液中浸泡524h，取出后于3745'C抽風(fēng)烘千得到；所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7.4。上述鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備方法，包括以下操作步驟(1)膠體金溶液的制備；(2)抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備；(3)噴金把步驟(2)所得抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液按210u1/cm的噴量噴在結(jié)合墊上，37。C45。C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為524h，得到噴金后的結(jié)合墊；(4)硝酸纖維素(NC)膜上包被C，T線在硝酸纖維素膜上包被C線和T線，其中C線為質(zhì)控線，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，濃度為0.21.5mg/ral;T線為檢測線，包被鎘的完全抗原Cd-iEDTA-BSA(鎘-雙功能乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白)，濃度為O.10.9mg/ml;37。C45"C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為224h;得到包被后的硝酸纖維素膜；(5)鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝將聚氯乙烯底板、樣品墊、步驟(3)所得噴金后的結(jié)合墊、步驟(4)所得包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙按照權(quán)利要求l所述方式組裝，切割成條，得到鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條。步驟(l)所述膠體金溶液的制備包括以下操作步驟取質(zhì)量濃度為O.01%的氯金酸水溶液100mL，攪拌加熱至沸騰，一次性快速加入質(zhì)量濃度為l%的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，繼續(xù)攪拌加熱0.524小時(shí)，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，得到含有粒徑為2040nm的膠體金顆粒的膠體金溶液。步驟(2)所述抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備包括以下操作步驟取步驟(1)所得膠體金溶液100mL，用摩爾濃度為O.1mol/L的碳酸鉀溶液將其pH值調(diào)至8.5;將抗鎘離子單抗1.6mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置0.524小時(shí)；逐滴加入質(zhì)量濃度為10%的無菌牛血清白蛋白(BSA)11mL，攪拌O.524小時(shí)，4。C30。C靜置過夜；將上述標(biāo)記后的膠體金溶液于20005000r/min離心10-20min，棄去沉淀，然后于1000020000r/min離心1030min，棄去上清液；加入摩爾濃度為50mmol/L的三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽(Tris-HC1)清洗23次，最后用上述三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽10mL重懸，得到抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液。所述抗鎘離子單抗的制備步驟如下用雙功能改構(gòu)乙二胺四乙酸(iEDTA)螯合劑將鎘離子偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗鎘離子單克隆抗體(MAb-Cd)的陽性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，純化獲得抗鎘離子單抗。所述三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽的pH值是8.5，其含有質(zhì)量體積比為10g/L的牛血清白蛋白和質(zhì)量體積比為0.2g/L的疊氮化鈉。步驟(4)所述鎘的完全抗原Cd-iEDTA-BSA是用雙功能改構(gòu)乙二胺四乙酸螯合劑將鎘離子偶聯(lián)到牛血清白蛋白上獲得檢測抗原Cd-iEDTA-BSA。一種利用上述方法制備的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的方法，包括以下操作步驟a、在鎘離子標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品消解液中按照9:l的體積比加入摩爾濃度為100mmol/L的乙二胺四乙酸螯合劑，混合均勻，使鎘離子與EDTA充分螯合，得到待檢樣品溶液。b、用滴管吸取歩驟a所得待檢樣品溶液80150uL，滴加于試紙條的樣品墊上，滴加樣品后開始計(jì)時(shí)；c、在滴加樣品后35min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直置于觀察者正面；d、結(jié)果判斷C線顯示為紅色線條，當(dāng)T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性，待測樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml;當(dāng)T線顯色比C線淺，結(jié)果為陽性，待測樣品中的鎘離子濃度大于100ng/ml。步驟a所述待測樣品消解液是將待測樣品加酸后進(jìn)行微波或加熱消解，然后調(diào)PH值至中性獲得。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，可以將鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條裝入塑料板中，該塑料板的上面有兩個(gè)孔加樣孔和檢測顯示窗口。其中，加樣孔正對(duì)試紙條的樣品墊，檢測結(jié)果顯示窗口正對(duì)NC膜。檢測時(shí)，將待檢樣品溶液滴于加樣孔中，根據(jù)檢測結(jié)果窗口顯示的T、C線顏色進(jìn)行判斷。為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，水產(chǎn)類樣品按下述方法預(yù)處理準(zhǔn)確稱取1.0g魚肉樣品，在聚四氟乙烯坩堝中加入硝酸2ml，室溫下放置46小時(shí)。然后將肉樣轉(zhuǎn)移進(jìn)消化管內(nèi)，用共計(jì)4ml的硝酸多次潤洗坩堝，全部轉(zhuǎn)移進(jìn)消化8管，再加入1.5ml的30X的過氧化氫。擰緊消化管蓋，按規(guī)定位置置于微波消解儀內(nèi)，調(diào)節(jié)時(shí)間為15min，進(jìn)行微波加熱。加熱15min，取出，靜置半個(gè)小時(shí)讓其冷卻。幵蓋取樣品消解液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，用50ml容量瓶定容待測。環(huán)境水體類樣品按下述方法預(yù)處理取搖勻水體樣品20mL，移入50mL聚四氟乙烯燒杯中，在通風(fēng)櫥內(nèi)，將燒杯置于放有石棉網(wǎng)的電熱爐上加熱，加入lml硝酸。待濃縮至2ml左右時(shí)取下冷卻，沿杯壁加入2ml硝酸和0.8ml高氯酸。繼續(xù)加熱消解，待溶液清澈后，加入少許三蒸水，加熱煮沸，驅(qū)盡氯氣和氮氧化合物。用三蒸水溶解，濾入燒杯中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，用50ml容量瓶定容待測。環(huán)境土壤類樣品按下述方法預(yù)處理準(zhǔn)確稱取l.2g土壤樣品于50mL微波管中，用少許水濕潤后加入2mLHN03和6mLHC1，在室溫下放置過夜，再置于微波消解爐中，編定微波程序，使其從室溫逐漸升溫至18(TC并保持15min，然后逐漸降溫至室溫，取下，用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，用50ml容量瓶定容待測。本發(fā)明的原理是將螯合劑一鎘離子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成為完全抗原免疫動(dòng)物，獲得針對(duì)鎘離子特異性抗體，再將該抗鎘離子的單克隆抗體與膠體金偶聯(lián)，Cd-iEDTA-BSA包被于NC膜的T線上。當(dāng)?shù)渭渔k離子標(biāo)準(zhǔn)品競爭物(Cd-EDTA)或待測樣品(X-EDTA)于加樣孔中時(shí)，由于毛細(xì)作用液體向前移動(dòng)。到達(dá)T線時(shí)，樣品中的Cd-EDTA與固定在T線上的Cd-iEDTA-BSA復(fù)合物競爭結(jié)合抗鎘離子單抗-膠體金復(fù)合物，若樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml，則膠體金結(jié)合墊中的抗鎘離子單抗-膠體金復(fù)合物與T線上Cd-iEDTA-BSA及C線上羊抗鼠IgG大量結(jié)合，T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性；若樣品中鎘離子的濃度大于IOOng/ml，則抗鎘離子單抗-膠體金復(fù)合物大部分與檢測樣品中的Cd-EDTA結(jié)合，很少與T線上的Cd-iEDTA-BSA結(jié)合，因此T線將比C線淺或完全看不到線，而且樣品中鎘離子濃度越高，T線顯色越淺，結(jié)果為陽性。本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明利用得到的分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細(xì)胞可大量制得抗鎘離子的單克隆抗體，所建立的方法成本低廉，可快速、簡便、靈敏地測定樣品中Cd2+的含量；(2)本發(fā)明制備的鎘離子膠體金免疫層析試紙條體積小、攜帶方便、不需要大型儀器設(shè)備、操作簡單，非常適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場初篩，可以大規(guī)模地對(duì)海洋貝類食品中殘留的重金屬鎘進(jìn)行快速、方便的檢測，保障我國海產(chǎn)品食用安全及維護(hù)我國在相關(guān)國際貿(mào)易領(lǐng)域中的利益。圖1是鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，l是聚氯乙烯底板；2是包被后的硝酸纖維素膜；3是噴金后的結(jié)合墊；4是樣品墊；5是吸水紙；6是質(zhì)控線(C線)；7是檢測線(T線)。圖2是鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條裝入塑料板的外形圖，其中，l是加樣孔；2是檢測結(jié)果顯示窗口；3是C線位置；4是T線位置。圖3是利用鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的操作示意圖。圖4是利用鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的操作示意圖。圖5是利用鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的結(jié)果判斷示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1(A)用iEDTA將鎘離子偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗鎘離子單克隆抗體(MAb-Cd)的陽性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。(B)用用iEDTA將鎘離子偶聯(lián)到載體蛋白BSA上獲得檢測抗原Cd-iEDTA-BSA。(C)鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備(1)膠體金溶液的制備取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O.01%的氯金酸水溶液100mL，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，一次性快速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，繼續(xù)攪拌加熱20min，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，4°C保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^透射電鏡及紫外分光光度計(jì)檢測膠體金溶液中膠體金顆粒的10粒徑為20nm。(2)抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備取步驟(1)所得膠體金溶液100mL，用摩爾濃度為O.1mol/L的1(^03溶液將pH調(diào)至8.5，將l.6mg抗鎘離子單抗加入到膠體金溶液中，攪拌后靜置30min，再逐滴加入llmL經(jīng)微孔濾膜過濾的10XBSA，攪拌15min，4'C過夜；標(biāo)記后的抗體溶液于4000r/min離心15min，棄沉淀，然后15000r/min離心30min，棄上清，加入10mL50mMTris-HCl(pH8.5，含1柳SA、0.02%疊氮化鈉)清洗23次，最后用10mL上述Tris-HCl重懸，得到抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液，分裝后4"C保存。(3)噴金把標(biāo)記好鎘離子單抗的膠體金溶液按2ul/cm的噴量噴在己處理好的結(jié)合墊上，37'C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為5小時(shí)。(4)硝酸纖維素(NC)膜上包被C，T線在NC膜上噴C，T線。C線為質(zhì)控線，包被羊抗鼠IgG，濃度為0.2mg/ml;T線為檢測線，包被重金屬鎘的完全抗原Cd-iEDTA-BSA，濃度為O.lmg/ml。37'C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為2小時(shí)。(5)重金屬鎘的檢測試紙條組裝以聚氯乙烯底板為底部支撐，將歩驟(4)所得包被后的硝酸纖維素膜、步驟(3)所得噴金后的結(jié)合墊、樣品墊和吸水紙以從左至右、依次相連的方式粘貼在聚氯乙烯底板上，其中硝酸纖維素膜的檢測線T線位于左側(cè)，質(zhì)控線C線位于左側(cè)(見圖l所示)；切割成條，寬度為0.384厘米，得到鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲(chǔ)存。實(shí)施例2(A)用iEDTA將鎘離子偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗鎘離子單克隆抗體(MAb-Cd)的陽性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，純化獲得抗鎘離子的單克隆抗體。(B)用用iEDTA將鎘離子偶聯(lián)到載體蛋白BSA上獲得檢測抗原Cd-iEDTA-BSA。(C)鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備(1)膠體金溶液的制備取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為O.01%的氯金酸水溶液100mL，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，一次性快速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，繼續(xù)攪拌加熱20min，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，4°Cii保存?zhèn)溆?。通過透射電鏡及紫外分光光度計(jì)檢測膠體金溶液中膠體金顆粒的粒徑為20nm。(2)抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備取步驟(1)所得膠體金溶液100mL，用摩爾濃度為O.1mol/L的K2C0:,溶液將pH調(diào)至8.5，將l.6mg抗鎘離子單抗加入到膠體金溶液中，攪拌后靜置30min，再逐滴加入llmL經(jīng)微孔濾膜過濾的10。^BSA，攪拌15min，4'C過夜；標(biāo)記后的抗體溶液于4000r/min離心15min，棄沉淀，然后15000r/min離心30min，棄上清，加入10mL50mMTris-HC1(pH8.5，含1XBSA、0.02%疊氮化鈉)清洗23次，最后用10mL上述Tris-HCl重懸，得到抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液，分裝后4'C保存。(3)噴金把標(biāo)記好鎘離子單抗的膠體金溶液按10iU/cm的噴量噴在已處理好的結(jié)合墊上，45"抽風(fēng)烘干，時(shí)間為24小時(shí)。(4)硝酸纖維素(NC)膜上包被C，T線在NC膜上噴C，T線。C線為質(zhì)控線，包被羊抗鼠IgG，濃度為1.5mg/ml;T線為檢測線，包被重金屬鎘的完全抗原Cd-iEDTA-BSA，濃度為0.9mg/ml，45。C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為24小時(shí)。(5)重金屬鎘的檢測試紙條組裝以聚氯乙烯底板為底部支撐，將步驟(4)所得包被后的硝酸纖維素膜、步驟(3)所得噴金后的結(jié)合墊、樣品墊和吸水紙以從左至右、依次相連的方式粘貼在聚氯乙烯底板上，其中硝酸纖維素膜的檢測線T線位于左側(cè)，質(zhì)控線C線位于左側(cè)(見圖l所示)；切割成條，寬度為0.384厘米，得到鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條。(6)將步驟(5)所得試紙條裝入塑料板中，該塑料板的上面有兩個(gè)孔加樣孔和檢測顯示結(jié)果窗口；其中，加樣孔正對(duì)試紙條的樣品墊，檢測結(jié)果顯示窗口正對(duì)NC膜。檢測時(shí)，將待檢樣品溶液滴于加樣孔中，根據(jù)檢測結(jié)果窗口顯示的T、C線顏色進(jìn)行判斷。(見圖2所示)實(shí)施例3驗(yàn)證本發(fā)明的可靠性試驗(yàn)(步驟b和c見圖3所示，步驟d見圖4所示)a、先配制好CcT系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、100、200、400、800、1600ng/mL)各90uL，再分別加入10uL100mmol/LEDTA溶液作為螯合劑，混合均勻，使鎘離子與EDTA充分螯合成Cd-EDTA，作為待測樣品溶液。b、用滴管吸取步驟a所得待檢樣品溶液80150uL，滴加于試紙條的樣品墊上，滴加樣品后開始計(jì)時(shí)；c、在滴加樣品后35min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直置于觀察者正面；d、結(jié)果判斷C線顯示為紅色線條，當(dāng)T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性，待測樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml;當(dāng)T線顯色比C線淺，結(jié)果為陽性，待測樣品中的鎘離子濃度大于100ng/ml。從密封鋁箔袋取出鎘離子膠體金快速檢測試紙條，用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴于加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)；結(jié)果應(yīng)在35分鐘讀取，其他時(shí)間判讀無效；讀取結(jié)果時(shí)，檢測試劑應(yīng)如下圖右側(cè)所示擺放方式置于觀察者正面。每個(gè)試樣做3個(gè)重復(fù)，5min后觀察結(jié)果，檢測線(T線)顏色呈梯度遞減，結(jié)果顯示如圖5所示。從圖5可以看到，從左到右，樣品中Cd2+的濃度分別為0，100，200，400，800，1600ng/mL，隨著樣品濃度的升高，鎘離子膠體金檢測試紙條的T線顏色逐漸變淺。本檢測試紙條檢測重金屬鎘的最低檢測水平(LDL)的判斷標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)檢測線(T線)比質(zhì)控線(C線)的顏色淡時(shí)，樣品中鎘離子的含量大于或者等于100ng/ml。當(dāng)樣品中的鎘離子濃度大于1600ng/ml時(shí)，檢測線完全消失；當(dāng)鎘離子濃度小于IOOng/ml時(shí)，檢測線與控制線在肉眼下沒有明顯區(qū)別。由上圖可知，本檢測試紙條的LDL可達(dá)到IOOng/ml。實(shí)施例4驗(yàn)證本發(fā)明的檢測特異性試驗(yàn)針對(duì)以下重金屬運(yùn)用實(shí)施例制得的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行特異性交叉反應(yīng)測試，結(jié)果如下表l重金屬鎘其他幾種的交叉反應(yīng)金屬禺子標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度(ng/ml)C，T線顯色結(jié)果判斷交叉反應(yīng)Cd2+>=100T<C陽性有Hg2+>=100T<C陽性有Cu2+>=100T>=C陰性無Mn2+>=100T>=C陰性無Zn2+>=100T〉=C陰性無Fe3+>=100T>=C陰性無Ca2+>=100T>=C陰性無<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結(jié)果顯示，抗體除對(duì)CcT以外，對(duì)Hg2+有明顯的交叉，對(duì)其他幾種金屬交叉反應(yīng)幾乎沒有，因此此膠體金試紙條可以用來同時(shí)檢測CcT和Hg"兩種重金屬，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。實(shí)施例5驗(yàn)證本發(fā)明的穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔5天，從密閉儲(chǔ)存的鋁箔袋中取出實(shí)施例l制得的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條，用同一批次不同檢測試紙條檢測同一樣品，及用不同批次檢測試紙條測定同一樣品，其質(zhì)控線、測試線的顯色時(shí)間及顏色深淺和最終結(jié)果判讀相同。實(shí)施例6先將待測樣品預(yù)處理成消解液準(zhǔn)確稱取1.0g魚肉樣品，在聚四氟乙烯坩堝中加入硝酸2ml，室溫下放置46小時(shí)。然后將肉樣轉(zhuǎn)移進(jìn)消化管內(nèi)，用共計(jì)4ml的硝酸多次潤洗坩堝，全部轉(zhuǎn)移進(jìn)消化管，再加入1.5ml的30%的過氧化氫。擰緊消化管蓋，按規(guī)定位置置于微波消解儀內(nèi)，調(diào)節(jié)時(shí)間為15min，進(jìn)行微波加熱。加熱15min，取出，靜置半個(gè)小時(shí)讓其冷卻。開蓋取魚肉樣品消解液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，用50ml容量瓶定容待測。利用實(shí)施例l制備的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條對(duì)上述魚肉樣品消解液進(jìn)行鎘離子檢測，包括以下操作步驟(步驟b和c見圖3所示，步驟d見圖4所示)a、在魚肉樣品消解液中按照9:l的體積比加入摩爾濃度為100mmol/L的EDTA螯合劑，混合均勻，使鎘離子與EDTA充分螯合，得到魚肉樣品溶液。b、用滴管吸取步驟a所得魚肉樣品溶液150uL，滴加于試紙條的加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)；c、在加樣后35min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以加樣孔向下的方向垂直置于觀察者正面；d、結(jié)果判斷C線顯示為紅色線條，當(dāng)T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性，待測樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml;當(dāng)T線顯色比C線淺，結(jié)果為陽性，待測樣品中的鎘離子濃度大于100ng/ml。實(shí)施例7先將待測樣品預(yù)處理成消解液取搖勻水體樣品20mL，移入50mL聚四氟乙烯燒杯中，在通風(fēng)櫥內(nèi)，將燒杯置于放有石棉網(wǎng)的電熱爐上加熱，加入lml硝酸。待濃縮至2ml左右時(shí)取下冷卻，沿杯壁加入2ml硝酸和0.8ml高氯酸。繼續(xù)加熱消解，待溶液清澈后，加入少許三蒸水，加熱煮沸，驅(qū)盡氯氣和氮氧化合物。用三蒸水溶解，濾入燒杯中，用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，用50ml容量瓶定容待測。利用實(shí)施例l制備的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條對(duì)上述水體樣品消解液進(jìn)行鎘離子檢測，包括以下操作步驟(步驟b和c見圖3所示，步驟d見圖4所示)a、在水體樣品消解液中按照9:l的體積比加入摩爾濃度為100mmol/L的EDTA螯合劑，混合均勻，使鎘離子與EDTA充分螯合，得到魚肉樣品溶液。b、用滴管吸取步驟a所得水體樣品溶液80wL，滴加于試紙條的加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)；c、在加樣后35min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以加樣孔向下的方向垂直置于觀察者正面；d、結(jié)果判斷C線顯示為紅色線條，當(dāng)T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性，待測樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml;當(dāng)T線顯色比C線淺，結(jié)果為陽性，待測樣品中的鎘離子濃度大于100ng/ml。實(shí)施例8先將待測樣品預(yù)處理成消解液準(zhǔn)確稱取l.2g土壤樣品于50mL微波管中，用少許水濕潤后加入2mLHN03和6mLHC1，在室溫下放置過夜，再置于微波消解爐中，編定微波程序，使其從室溫逐漸升溫至18(TC并保持15min，然后逐漸降溫至室溫，取下，用NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，用50ml容量瓶定容待測。利用實(shí)施例l制備的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條對(duì)上述土壤樣品消解液進(jìn)行鎘離子檢測，包括以下操作步驟(步驟b和c見圖3所示，步驟d見圖4所示)15a、在土壤樣品消解液中按照9:1的體積比加入摩爾濃度為100mmol/L的EDTA螯合劑，混合均勻，使鎘離子與EDTA充分螯合，得到魚肉樣品溶液。b、用滴管吸取步驟a所得土壤樣品溶液100uL，滴加于試紙條的加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)；c、在加樣后35min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以加樣孔向下的方向垂直置于觀察者正面；d、結(jié)果判斷C線顯示為紅色線條，當(dāng)T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性，待測樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml;當(dāng)T線顯色比C線淺，結(jié)果為陽性，待測樣品中的鎘離子濃度大于100ng/ml。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。1權(quán)利要求1、一種鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于該試紙條是以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結(jié)合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙以依次相連的方式粘貼在聚氯乙烯底板上制成的；所述包被后的硝酸纖維素膜上設(shè)置檢測線T線和質(zhì)控線C線，其中檢測線T線靠近樣品墊一端。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于所述試紙條是以聚氯乙烯底板為底部支撐，將樣品墊、噴金后的結(jié)合墊、包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙粘貼在聚氯乙烯底板上，其中樣品墊和吸水紙位于兩端，包被后的硝酸纖維素膜的兩端分別位于結(jié)合墊和吸水紙的下面，結(jié)合墊的一端設(shè)置于樣品墊的下面，另一端設(shè)置于包被后的硝酸纖維素膜的上面。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條，其特征在于所述結(jié)合墊和樣品墊是將玻璃纖維在摩爾濃度為0.015mol/L的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量體積比為10g/L的牛血清白蛋白、質(zhì)量體積比為5g/L的聚乙烯吡咯垸酮和質(zhì)量體積比為0.2g/L的疊氮化鈉組成的混合液中浸泡524h，取出后于3745'C抽風(fēng)烘干得到;所述磷酸鹽緩沖液的pH值為7.4。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟.-(1)膠體金溶液的制備；(2)抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備；(3)噴金把步驟(2)所得抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液按210y1/cm的噴量噴在結(jié)合墊上，37-C45。C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為524h，得到噴金后的結(jié)合墊；(4)硝酸纖維素膜上包被C，T線在硝酸纖維素膜上包被C線和T線，其中C線為質(zhì)控線，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，濃度為0.21.5mg/ml;T線為檢測線，包被鎘的完全抗原Cd-iEDTA-BSA，濃度為O.10.9mg/ml;37。C45。C抽風(fēng)烘干，時(shí)間為224h;得到包被后的硝酸纖維素膜；(5)鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝將聚氯乙烯底板、樣品墊、步驟(3)所得噴金后的結(jié)合墊、步驟(4)所得包被后的硝酸纖維素膜和吸水紙按照權(quán)利要求l所述方式組裝，切割成條，得到鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟(1)所述膠體金溶液的制備包括以下操作步驟取質(zhì)量濃度為O.01%的氯金酸水溶液100mL，攪拌加熱至沸騰，一次性加入質(zhì)量濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液2.5mL，繼續(xù)攪拌加熱830min，直至溶液呈酒紅色，室溫冷卻，得到含有粒徑為20-40nm的膠體金顆粒的膠體金溶液；步驟(2)所述抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備包括以下操作步驟取步驟(1)所得膠體金溶液100mL，用摩爾濃度為O.1mol/L的碳酸鉀溶液將其pH值調(diào)至8.5;將抗鎘離子單抗1.6mg加入到膠體金溶液中，攪拌均勻，靜置0.524小時(shí)；逐滴加入質(zhì)量濃度為10%的無菌牛血清白蛋白11mL，攪拌0.524小時(shí)，4'C30。C靜置過夜；將上述標(biāo)記后的膠體金溶液于20005000r/min離心1020min，棄去沉淀，然后于1000020000r/min離心1030min，棄去上清液；加入摩爾濃度為50mmol/L的三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽清洗23次，最后用上述三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽10mL重懸，得到抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液。6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征在于所述抗鎘離子單抗的制備步驟如下用雙功能改構(gòu)乙二胺四乙酸螯合劑將鎘離子偶聯(lián)到血藍(lán)蛋白上，混合弗式不完全佐劑免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選出穩(wěn)定分泌抗鎘離子單克隆抗體的陽性細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)，注射細(xì)胞進(jìn)小鼠體內(nèi)誘生腹水，純化獲得抗鎘離子單抗。7、根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽的pH值是8.5，其含有質(zhì)量體積比為10g/L的牛血清白蛋白和質(zhì)量體積比為0.2g/L的疊氮化鈉。8、根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟(4)所述鎘的完全抗原Cd-iEDTA-BSA是用雙功能改構(gòu)乙二胺四乙酸螯合劑將鎘離子偶聯(lián)到牛血清白蛋白上獲得檢測抗原Cd-iEDTA-BSA。9、一種利用權(quán)利要求1所述鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的方法，其特征在于包括以下操作步驟a、在鎘離子標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品消解液中按照9:l的體積比加入摩爾濃度為100mmol/L的乙二胺四乙酸螯合劑，混合均勻，使鎘離子與乙二胺四乙酸充分螯合，得到待檢樣品溶液。b、用滴管吸取步驟a所得待檢樣品溶液80150uL，滴加于試紙條的樣品墊上，滴加樣品后開始計(jì)時(shí)；c、在滴加樣品后35min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直置于觀察者正面；d、結(jié)果判斷C線顯示為紅色線條，當(dāng)T線顯色與C線相近，結(jié)果為陰性，待測樣品中的鎘離子濃度小于100ng/ml;當(dāng)T線顯色比C線淺，結(jié)果為陽性，待測樣品中的鎘離子濃度大于100ng/ml。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟a所述待測樣品消解液是將待測樣品加酸后進(jìn)行微波或加熱消解，然后調(diào)PH值至中性獲得。全文摘要本發(fā)明公開了一種鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條及其制備方法和用途。試紙條的制備方法(1)膠體金溶液的制備；(2)抗鎘離子單抗標(biāo)記的膠體金溶液的制備；(3)噴金；(4)硝酸纖維素膜上包被C，T線；(5)鎘離子膠體金免疫層析快速檢測試紙條的組裝。利用此試紙條進(jìn)行鎘離子檢測的方法，包括以下步驟a.在待測樣品消解液中加入EDTA螯合劑，使鎘離子與EDTA充分螯合；b.用滴管吸取待檢樣品溶液，滴加3滴于試紙條的樣品墊上，加樣后開始計(jì)時(shí)；c.在加樣后3～5min讀取結(jié)果，讀取時(shí)，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直置于觀察者正面；d.結(jié)果判斷。本發(fā)明可以大規(guī)模地對(duì)環(huán)境與水產(chǎn)類食品中殘留的重金屬鎘進(jìn)行快速、方便的檢測。文檔編號(hào)G01N33/558GK101451998SQ200810220609公開日2009年6月10日申請(qǐng)日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者向軍儉,勇唐,宏王,王建華,寧鄧,陳耀強(qiáng)申請(qǐng)人:暨南大學(xué)