一種胃功能檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種胃功能檢測用試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括塑料板、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜，樣本墊和吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、胃蛋白酶原II抗體和幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物；硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，檢測線1上包被有胃蛋白酶原I二抗，檢測線2上包被有胃蛋白酶原II二抗，檢測線3上包被有幽門螺旋桿菌尿素酶抗原，控制線上包被有羊抗鼠lgG。該試劑盒，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點的熒光特性實現(xiàn)了采用熒光免疫層析的方法對胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體進(jìn)行快速、靈敏的聯(lián)合檢測。
【專利說明】
一種胃功能檢測用免疫層析試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫層析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種胃功能檢測用免疫層析試劑盒 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃蛋白酶原始胃液中胃蛋白酶的無活性前體，由胃體的主細(xì)胞和黏液細(xì)胞分泌， 大部分分泌到胃腔，少量可在血液中被檢測到。根據(jù)其生化性質(zhì)和免疫原性將其分成2個亞 群，1-5組分的免疫原性相同，稱為胃蛋白酶原I，主要由胃底腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分 泌;組分6和7被稱為胃蛋白酶原II，除由胃底腺的主細(xì)胞和黏液頸細(xì)胞分泌外，賁門腺和胃 竇的幽門腺的黏液頸細(xì)胞以及十二指腸上段也能產(chǎn)生胃蛋白酶原II。血清和血漿中胃蛋白 酶原I和胃蛋白酶原II比值的降低與胃體萎縮的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，中、重度萎縮性胃炎 時，其比值為<0.3,其胃癌的發(fā)病率顯著增加，因此，聯(lián)合測定胃蛋白酶原I核胃蛋白酶原 II比值可起到早期胃癌風(fēng)險提示的作用。另外，胃幽門螺旋桿菌是生存在人類胃粘膜的病 原菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌的重量致病因子之一，是人胃內(nèi)唯一能夠產(chǎn)生大量尿 毒酶的細(xì)菌，因此檢測胃幽門螺旋桿菌抗體對胃功能和胃癌發(fā)病率的判斷具有指示性的作 用。
[0003] 目前對于胃蛋白酶原和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體的主要檢測的方法由酶聯(lián)免疫 吸附法、化學(xué)發(fā)光免疫測定和熒光免疫層析法。酶聯(lián)免疫吸附法檢測精確，能準(zhǔn)確定量，具 有很高的敏感性，但是檢測樣品需要加樣、溫浴、洗滌、顯色、終止等步驟，操作程序繁瑣，耗 時長，樣品從處理到得到結(jié)論需要至少40分鐘，不適合大規(guī)模的體檢篩查;樣品檢測需要洗 板機和酶標(biāo)儀，攜帶不便，因而不能在病人家庭或急救車上進(jìn)行檢測；另外，其敏感性、特異 性不夠高，對低濃度樣品檢測的準(zhǔn)確度不高。而化學(xué)發(fā)光免疫測定，雖然精確度高，檢測速 度快，但檢測需要昂貴的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，要求特定的分析室，且其試劑成本也較高， 無法廣泛用于較基層的意愿和醫(yī)療機構(gòu)中。熒光免疫層析法相比酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā) 光免疫測定，檢測靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡便、成本低，因而使其在胃蛋白酶原和幽門螺 旋桿菌尿素酶抗體的檢測方面具有更大的產(chǎn)業(yè)價值，然而目前無論是采用何種檢測方法， 大多是對胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體進(jìn)行單獨檢測，還沒有實 現(xiàn)對胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體三種物質(zhì)的一步聯(lián)合檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡 便、成本低的胃功能檢測用試劑盒，實現(xiàn)對胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽門螺旋桿菌尿 素酶抗體三種成分的同時聯(lián)合檢測。
[0005] 本發(fā)明的目的還在于提供一種胃功能檢測用試劑盒的制備方法。
[0006] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種胃功能檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在 玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè) 有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋 白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物;所述硝酸纖維素膜上設(shè) 置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有胃蛋白酶原I二抗，所述檢 測線2上包被有胃蛋白酶原II二抗，所述檢測線3上包被有幽門螺旋桿菌尿素酶抗原，所述 控制線上包被有羊抗鼠lgG。
[0008] 所述玻璃纖維上包被的量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶 原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物中量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I 抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的質(zhì)量比 為1:1:1〇
[0009] 所述量子點為硒化錦或硫化錦量子點。
[0010] 所述硝酸纖維素膜上設(shè)置的檢測線1與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢 測線1與控制線之間的間隔均不小于5mm。
[0011] 上述胃功能檢測用試劑盒的制備方法，包括以下操作步驟：
[0012] 1)原材料的制備：
[0013] A:制備玻璃纖維素膜:將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶 原II抗體、量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備 用；
[0014] B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和 控制線，然后將胃蛋白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿菌尿素酶抗原、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝 酸纖維素膜放入封閉液中封閉，干燥，備用；
[0015] 2)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃 纖維素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng) 的另一端放置吸水墊，干燥，即完成。
[0016] 步驟A中還包括首先制備量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶 原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物，具體方法包括以下操作步 驟：
[0017] a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳 復(fù)合物懸濁液；
[0018] b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純 化，得量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液；
[0019] c:在步驟b制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15 分鐘，純化，之后加入胃蛋白酶原I抗體，混勻2~4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆 粒用封閉液重懸，室溫混勻1小時，之后再進(jìn)行純化，即得量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體；
[0020] d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點 標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原，然后將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃 蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合，備用；
[0021 ]所述改性環(huán)糊精為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。
[0022] 所述活化劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽。
[0023] 步驟c中所述量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液與活化劑的質(zhì)量比為1:10。
[0024] 步驟B中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0025] 步驟c中所用的封閉液為牛血清白蛋白溶液。
[0026] 步驟a中所述改性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點與環(huán)糊 精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比為10:1;步驟c中所述胃蛋白酶原I抗體與量子點-改性環(huán)糊精-膠 乳復(fù)合物的質(zhì)量比為1:20。
[0027]步驟a中膠乳顆粒使用前進(jìn)行純化處理，所述純化處理的具體方法為:取膠乳顆粒 加入第一緩沖液中，離心分離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，然后再離心分 離，棄去上清，再用第一緩沖液重懸沉淀物顆粒，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 上述純化后的膠乳顆粒在使用時取膠乳顆粒，采用第二緩沖液將膠乳顆粒稀釋成 濃度為l〇mg/ml。
[0029] 上述步驟b中還包括首先將步驟a中制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，采用 第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入量子點。
[0030] 上述步驟c中還包括首先將步驟b中制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁 液，采用第二緩沖液稀釋成濃度為l〇mg/ml的懸濁液，然后再加入活化劑活化。
[0031 ] 步驟C中所述封閉后進(jìn)行純化的具體方法為：8000rpm條件下離心15min，棄去上 清，沉淀復(fù)溶于分散液中。
[0032]步驟A中將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體、量 子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為:將將量子 點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿 菌尿素酶抗原混合物均勻噴涂于玻璃纖維素膜上。
[0033] 步驟a和步驟b中所述純化的具體方法為:8000rpm條件下離心，棄去上清，沉淀用 第一緩沖液進(jìn)行重懸，之后在SOOOrpm條件下離心，棄去上清，沉淀復(fù)溶于第一緩沖液中。 [0034]步驟c中活化后純化的具體方法為：8000rpm條件下離心棄去上清，沉淀用第一緩 沖液進(jìn)行重懸。
[0035]步驟B中將胃蛋白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿菌尿素酶抗原、羊抗 鼠lgG分別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分 別取濃度均為lmg/ml的胃蛋白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿菌尿素酶抗原和 羊抗鼠IgG，以lul/ Cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和 控制線上。
[0036] 步驟1)和步驟2)中所述的干燥為37°C干燥3~5小時。
[0037] 上述第一緩沖液為0.021，？!17.4的1^緩沖液。上述第二緩沖液為0.021，？冊.1的 MES緩沖液。
[0038]上述胃功能檢測用試劑盒在使用時，將待測樣品加入試劑盒的樣品墊上，玻璃纖 維素膜上的量子化標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體、量子點標(biāo)記 的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合物首先特異性的捕捉到待測樣品中的胃蛋白酶原I、胃蛋 白酶原II和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體，然后在達(dá)到檢測線3時，量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌 尿素酶抗原-幽門螺旋柑橘尿素酶抗體結(jié)合物與檢測線3上的幽門螺旋柑橘尿素酶抗原特 異性結(jié)合，；依次的在檢測線2時，量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體-胃蛋白酶原II結(jié)合物與 檢測線2上的胃蛋白酶原II二抗特異性結(jié)合;在檢測線1時，量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗 體-胃蛋白酶原I結(jié)合物與檢測線1上的胃蛋白酶原I二抗特異性結(jié)合;之后通過檢測檢測線 1、檢測線2和檢測線3上結(jié)合的量子點的熒光效應(yīng)，定量和定性判斷待測樣品中胃蛋白酶原 I、胃蛋白酶原Π和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體。
[0039] 本發(fā)明胃功能檢測用試劑盒，以量子化標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃 蛋白酶原II抗體、量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合物包被在玻璃纖維素膜上， 作為檢測探針，利用雙抗體/抗原夾心原理結(jié)合量子點的熒光特性實現(xiàn)了采用熒光免疫層 析的方法對胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體進(jìn)行快速、特異、簡便、 靈敏的聯(lián)合檢測。本發(fā)明胃功能檢測用試劑盒檢測線低，檢測靈敏度高。
[0040] 本發(fā)明胃功能檢測用試劑盒的制備方法，操作簡便，易于控制，適于工業(yè)化推廣應(yīng) 用。
[0041] 進(jìn)一步優(yōu)選的，本發(fā)明制備方法中，創(chuàng)新量子點標(biāo)記技術(shù)，采用羧甲基化或氨基化 改性的環(huán)糊精修飾量子點，然后將胃蛋白酶原I抗體、胃蛋白酶原II抗體、幽門螺旋桿菌尿 素酶抗原分別結(jié)合在改性環(huán)糊精的羧甲基基團或氨基基團上，實現(xiàn)制備獲得量子點標(biāo)記的 胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體、量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗 原。
【附圖說明】
[0042] 圖1是采用實施例1制備的試劑盒檢測胃蛋白酶原I標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)光值與實際濃度之 間對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0043] 圖2是采用實施例1制備的試劑盒檢測胃蛋白酶原Π標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)光值與實際濃度 之間對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0044]圖3是采用實施例1制備的試劑盒檢測幽門螺旋桿菌尿素酶抗原標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)光值 與實際濃度之間對應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0045] 下面通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0046] 實施例1
[0047]本實施例胃功能檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè) 置在玻璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一 端設(shè)有吸水墊，所述玻璃纖維素膜上包被有質(zhì)量比為1:1:1的量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗 體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物； 所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有胃 蛋白酶原I二抗，所述檢測線2上包被有胃蛋白酶原II二抗，所述檢測線3上包被有幽門螺旋 桿菌尿素酶抗原，所述控制線上包被有羊抗鼠lgG;所述量子點為硒化鎘量子點。
[0048] 本實施例胃功能檢測用試劑盒的制備方法，具體操作步驟為：
[0049] 1)制備玻璃纖維素膜：
[0050] a:取lml未標(biāo)記膠乳顆粒加入10ml，0.02M，pH7.41?緩沖液中；離心機lOOOOrpm離 心20min;去掉上清液，再用10ml，Ο . 02M，pH7.4PB緩沖液重懸沉淀顆粒物；之后再離心機 lOOOOrpm離心20min，去掉上清并用511110.021，？!17.4，1^緩沖液重懸沉淀顆粒物，4°(：保存待 用；
[0051 ] b:取步驟a制備的膠乳顆粒用0.02M，pH6.1的MES緩沖液將膠乳顆粒稀釋至10mg/ ml，取0.05ml稀釋后的膠乳顆粒懸濁液加入10mg羧甲基化改性環(huán)糊精，混勻24小時后，離心 機8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的1?緩沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機 8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M，pH7.4的PB緩沖液中，得羧甲基化改性環(huán) 糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0052] c:取步驟b制備的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M，pH6.1的MES 緩沖液將其稀釋至l〇mg/ml，取20ml稀釋后的羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合懸濁液，加入 20mg硒化鎘量子點，混勻24小時，離心機8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的PB緩 沖液重懸沉淀顆粒物，之后再次離心機8000rpm離心，棄去上清，沉淀顆粒物復(fù)溶于0.02M， pH7.4的PB緩沖液中，得量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液；
[0053] d:取步驟c制備的量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液，用0.02M， pH6.1的MES緩沖液將其稀釋至10mg/ml，然后按照量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物與活化 劑的質(zhì)量比為1:10,加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，活化15分鐘后， 8000rpm離心，棄去上清，并用0.02M，pH7.4的1?緩沖液重懸沉淀物顆粒，之后按照胃蛋白酶 原I抗體:量子點-羧甲基化改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物= 1:20的比例加入胃蛋白酶原I抗體， 混勻3小時后，8 0 0 0 r p m離心15分鐘，將沉淀物顆粒用封閉液重懸，室溫混勻1小時，之后 8000rpm離心15min，沉淀顆粒物復(fù)溶于分散液，即得量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體；
[0054] e:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點 標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原，然后將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃 蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合，噴涂于玻璃纖維素模上， 37°C干燥4小時，即得量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和 量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合物標(biāo)記的玻璃纖維素膜；
[0055] 2)制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔6mm依次劃分檢測線3、檢測線2、檢測 線1和控制線，之后取濃度均為lmg/ml的胃蛋白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿 菌尿素酶抗原、羊抗鼠igG，以lul/cm，10cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維膜的檢測線1、檢 測線2、檢測線3和控制線上，之后將硝酸纖維素膜放入牛血清白蛋白溶液中封閉，37°C干燥 3小時，即得所述的硝酸纖維素膜；
[0056] 3)組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟2)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另 一端放置吸水墊，37 °C干燥5小時，即完成。
[0057] 實施例2
[0058]本實施例胃功能檢測用試劑盒，與實施例不同的地方在于，采用的量子點為硫化 鎘量子點，采用的改性環(huán)糊精為氨基化干性環(huán)糊精，制備胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的 胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的過程中，在活化的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時間為2小時，其他同實施例1。
[0059] 實施例3
[0060] 本實施例胃功能檢測用試劑盒，與實施例不同的地方在于，制備胃蛋白酶原I抗 體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的過程中， 在活化的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳懸濁液中加入抗體或抗原的混勻時間為4小時，其他同 實施例1。
[0061] 試驗例：
[0062]將胃蛋白酶原 I稀釋為7 · 8125ug/L、15 · 625ug/L、31 · 25ug/L、62 · 5ug/L、125ug/L、 250ug/L、500ug/L;胃蛋白酶II稀釋為3 · 90625ug/L、7 ·8125ug/L、15 · 625ug/L、31 · 25ug/L、 62 · 5ug/L、125ug/L、250ug/L;幽門螺旋桿菌尿素酶抗體稀釋為1 · 5625ug/L、3 · 125ug/L、 6 · 25ug/L、12 · 5ug/L、25ug/L、50ug/L、100ug/L作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并同時配制空白溶液。 [0063]分別取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品lOOul分別加入到實施例1制備的試劑盒的樣品墊上，5min 后將顯色完成的試劑盒放入熒光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）重，讀 取相應(yīng)檢測線的發(fā)光值，并記錄各濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測的發(fā)光值與實際濃度之間的對應(yīng)關(guān) 系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1~圖3所示，胃蛋白酶原I的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y = -0.00003x2+ 0 · 03545x+0 · 11366，R2 = 0 · 99967 ;胃蛋白酶原II的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y = -0 · 0001 3x2+ 0.07164x-0.03524，R2 = 0.99983 ;幽門螺旋桿菌尿毒酶抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y ?ο. 00039x2+0 .08853x+0.01878 ，R2=0.99965 ， 由 上述標(biāo)準(zhǔn)曲線可知本發(fā)明制備的試劑盒針 對胃蛋白酶原I的最低檢測限為2yg/L、胃蛋白酶原II的最低檢測限為lyg/L、幽門螺旋桿菌 尿毒酶抗體的最低檢測限為〇. 5yg/L。
[0064] 另外，取空白溶液加入到實施例1制備的試劑盒中，未檢測到熒光效應(yīng)。
[0065] 取100例隨機的臨床樣本，采用本發(fā)明實施例1制備的試劑盒對胃蛋白酶原I、胃蛋 白酶原II和幽門螺旋桿菌尿素酶抗體的濃度進(jìn)行聯(lián)合檢測。檢測方法為：lOOul待測樣品 (50ul樣品+50ul樣品稀釋液)滴入試劑盒樣本墊上，5min后將顯色完成的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣 品的試紙條放入熒光免疫層析讀數(shù)儀(南京美寧康誠生物科技有限公司）中，讀取T/C線的 發(fā)光值，并記錄，將待測樣品T/C值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到胃蛋白酶原I、胃蛋白酶原II和幽 門螺旋桿菌尿素酶抗體濃度結(jié)果，如下表1所示：
[0066] 表 1




[0072]
[0073] 由此可見，本方法可以直接定量檢測胃蛋白酶原，不需專業(yè)培訓(xùn)，操作方便，快速， 20min即可獲得結(jié)果，適合在基層醫(yī)院和體檢中心推廣和運用。
[0074]最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制;盡管 參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可 以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換； 而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種胃功能檢測用試劑盒，包括塑料板、設(shè)置在塑料板上的玻璃纖維素膜、設(shè)置在玻 璃纖維素膜上的硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上一端設(shè)有樣本墊，對應(yīng)的另一端設(shè)有 吸水墊，其特征在于，所述玻璃纖維素膜上包被有量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點 標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物;所述硝酸纖 維素膜上設(shè)置有檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線，所述檢測線1上包被有胃蛋白酶原I 二抗，所述檢測線2上包被有胃蛋白酶原II二抗，所述檢測線3上包被有幽門螺旋桿菌尿素 酶抗原，所述控制線上包被有羊抗鼠 lgG。2. 如權(quán)利要求1所述的胃功能檢測用試劑盒，其特征在于，所述玻璃纖維上包被的量子 點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿 菌尿素酶抗原的混合物中量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗 體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的質(zhì)量比為1:1:1。3. 如權(quán)利要求1所述的胃功能檢測用試劑盒，其特征在于，所述量子點為硒化鎘或硫化 錦量子點。4. 如權(quán)利要求1~3任一項所述的胃功能檢測用試劑盒，其特征在于，所述硝酸纖維素 膜上設(shè)置的檢測線1與檢測線2之間、檢測線2與檢測線3之間、檢測線1與控制線之間的間隔 均不小于5mm 〇5. -種如權(quán)利要求1所述的胃功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下 操作步驟： 1) 原材料的制備： A:制備玻璃纖維素膜:將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II 抗體、量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合包被在玻璃纖維素膜上，干燥，備用； B:制備硝酸纖維素膜:取硝酸纖維素膜，間隔劃分出檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制 線，然后將胃蛋白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿菌尿素酶抗原、羊抗鼠 lgG分 別包被在硝酸纖維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上，之后將包被后的硝酸纖 維素膜放入封閉液中封閉，干燥，備用； 2) 組裝:在塑料板上放置步驟1)制備的玻璃纖維素模，然后在步驟1)制備的玻璃纖維 素膜上放置步驟1)制備的硝酸纖維素膜，然后在硝酸纖維素的一端放置樣品墊，對應(yīng)的另 一端放置吸水墊，干燥，即完成。6. 如權(quán)利要求5所述的胃功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中還包括 首先制備量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記 的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原的混合物，具體方法包括以下操作步驟： a:在膠乳顆粒懸濁液中加入改性環(huán)糊精，混勻24小時，純化，得改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合 物懸濁液； b:在步驟a制備的改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入量子點，混勻24小時，純化，得 量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸池液； c:在步驟b制備的量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物懸濁液中加入活化劑，活化15分鐘， 純化，之后加入胃蛋白酶原I抗體，混勻2~4小時后，離心得沉淀物顆粒，將沉淀物顆粒用封 閉液重懸，室溫混勻1小時，之后再進(jìn)行純化，即得量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體； d:按照上述步驟a~c同樣的方法制備量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記 的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原，然后將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白 酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合，備用。7. 如權(quán)利要求6所述的胃功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，所述改性環(huán)糊精 為羧甲基化改性環(huán)糊精或氨基化改性環(huán)糊精。8. 如權(quán)利要求6所述的胃功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a中所述改 性環(huán)糊精與膠乳顆粒的質(zhì)量比為20:1;步驟b中所述量子點與環(huán)糊精-乳膠復(fù)合物的質(zhì)量比 為10:1;步驟c中所述胃蛋白酶原I抗體與量子點-改性環(huán)糊精-膠乳復(fù)合物的質(zhì)量比為1: 20 〇9. 如權(quán)利要求6所述的胃功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟A中將量子 點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體、量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌 尿素酶抗原混合包被在玻璃纖維素膜上的具體方法為：將量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原I抗 體、量子點標(biāo)記的胃蛋白酶原II抗體和量子點標(biāo)記的幽門螺旋桿菌尿素酶抗原混合物均勻 噴涂于玻璃纖維素膜上。10. 如權(quán)利要求6所述的胃功能檢測用試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟B中將胃蛋 白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿菌尿素酶抗原、羊抗鼠 lgG分別包被在硝酸纖 維素膜的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上的具體方法為:分別取濃度均為lmg/ml的 胃蛋白酶原I二抗、胃蛋白酶原II二抗、幽門螺旋桿菌尿素酶抗原和羊抗鼠 IgG，以lul/cm， l〇cm/秒的速度分別噴涂到硝酸纖維的檢測線1、檢測線2、檢測線3和控制線上。
【文檔編號】G01N33/558GK106018792SQ201610327064
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】金鑫, 曾濱, 趙正道
【申請人】北京美康基因科學(xué)股份有限公司