專(zhuān)利名稱(chēng)：抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法,更具體地說(shuō)是 一種磁性納米顆粒與抗體偶聯(lián)和純化的方法，獲得的偶聯(lián)抗體適用于禽流感病毒等病原 微生物的富集，從而能從水中或者其它環(huán)境樣品中快速檢測(cè)出禽流感病毒，屬于檢驗(yàn)檢 疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)是由禽流感病毒引起的一種急性傳染病。截止到 2008年4月(2003年始)，世界衛(wèi)生組織共報(bào)告高致病性人禽流感確診病例378例，分 別來(lái)自14個(gè)國(guó)家，死亡率高達(dá)63%。由于禽流感的高死亡率以及人類(lèi)對(duì)禽流感病毒普 遍缺乏免疫力，研究禽流感病毒的任務(wù)十分艱巨。目前對(duì)于禽流感病毒的檢測(cè)已經(jīng)有許 多方法，例如病毒分離、RT-PCR、 ELISA、熒光RT-PCR等，但這些方法無(wú)疑都存在檢 出率的問(wèn)題，如果樣品中病毒含量沒(méi)有達(dá)到該檢測(cè)方法的檢測(cè)下限，就檢測(cè)不出來(lái)，因 此本領(lǐng)域迫切需要一種富集禽流感病毒的方法，同時(shí)具有靈敏快速和設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低 廉的特點(diǎn)，以便更好更快的診斷、治療和預(yù)防禽流感。
納米技術(shù)是目前國(guó)際上基礎(chǔ)研究和高新技術(shù)發(fā)展中最具有前瞻性、帶動(dòng)性的重點(diǎn)領(lǐng) 域之一。納米材料因具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，其巨大的比表面積，特異的反應(yīng)活性和 納米效應(yīng)，使其大大異于傳統(tǒng)材料，在發(fā)展快速、高靈敏度、高準(zhǔn)確性檢測(cè)技術(shù)和傳感 手段方面具有極大的潛力。我國(guó)在納米生物材料的設(shè)計(jì)、研發(fā)、表征和潛在應(yīng)用領(lǐng)域成
果層出不窮。研究并利用新型納米生物材料的特性，結(jié)合現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)口岸快 速、高特異、高敏感檢驗(yàn)?zāi)康模_(kāi)發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的病原富集、納米與生物活 性物質(zhì)標(biāo)記及檢測(cè)技術(shù)，對(duì)占領(lǐng)納米材料應(yīng)用性研究領(lǐng)域的制高點(diǎn)具有重要的戰(zhàn)略意 義。
磁性納米顆粒是由Senyei A E在1978年首先研制出來(lái)的一種新型的納米功能材 料。它的內(nèi)部是一個(gè)磁核，因而在外部磁場(chǎng)的作用下，微球可以定向移動(dòng)；外部是一層 高分子層，表面分布著許多活性基團(tuán)，可以和細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、酶等生化試劑發(fā)生 偶聯(lián)，進(jìn)而在磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)分離。磁性納米顆粒從誕生開(kāi)始，它就受到了科研工作者的關(guān)注，并且在生化分析領(lǐng)域得到成功的應(yīng)用。利用磁性納米顆粒分離蛋白質(zhì)、酶、 抗體、細(xì)胞，所需設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便同時(shí)分離速度快，效率高，并且能保持樣品的生 物活性，因此近年來(lái)在生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，磁性納米顆粒已被廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸 分析、細(xì)胞分離、酶的固定等多個(gè)領(lǐng)域。
將磁性納米顆粒包被上特異性抗體、受體、單鏈DNA，用于分離復(fù)雜樣品中的耙體， 取得巨大成功。與傳統(tǒng)的分離方法相比，把磁性納米顆粒用于復(fù)雜組分的生化樣品的分 離，能夠?qū)崿F(xiàn)分離和富集同時(shí)進(jìn)行，大大提高了分離速度和富集效率，同時(shí)也使分析檢 測(cè)的靈敏度大大提高。目前，已經(jīng)有相關(guān)的文章報(bào)道了將磁性納米顆粒應(yīng)用于檢測(cè)環(huán)境 樣品中的痕量微生物或者某些活性化學(xué)物質(zhì)，取得了很好的效果。但在目前，納米材料 與蛋白質(zhì)偶聯(lián)是一個(gè)世界性難題。主要難點(diǎn)包括納米材料水溶性的問(wèn)題；納米材料表面 基團(tuán)的活化；抗體分子和納米材料的共價(jià)結(jié)合；偶聯(lián)條件必須能保證納米材料和抗體活 性不能受損；之外還要求偶聯(lián)后能有效去除未偶聯(lián)的抗體分子。
技術(shù)內(nèi)容
本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中 禽流感病毒的方法,通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)特異性抗體與磁性納米顆粒的偶聯(lián)，并對(duì)產(chǎn) 物純化方法進(jìn)行研究，從而建立磁性納米顆粒與抗體偶聯(lián)與純化的方法。
本發(fā)明的要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是將純化的磁性納米顆粒偶聯(lián)抗體用于禽流感 病毒等病原微生物的富集，并采用快速檢測(cè)方法對(duì)富集效果進(jìn)行驗(yàn)證，建立一種新的特 異性的禽流感病毒快速分離、富集的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，包括如下步驟
(1) 將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，得 到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液；
(2) 純化偶聯(lián)產(chǎn)物，去除未反應(yīng)的抗體；
(3) 偶聯(lián)產(chǎn)物和待測(cè)溶液反應(yīng)后，用磁鐵富集；
(4) 富集產(chǎn)物的檢測(cè)。
所述步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，得到含有 偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液，是指將磁性納米顆粒、偶聯(lián)劑和
禽流感病毒多克隆抗體按l-2pmol: l-6mg: 0.625-5mg的比例混合。所述"磁性納米顆粒"是指超順磁性的磁性納米顆粒。
本發(fā)明所指的"偶聯(lián)劑"是指可以使抗體和磁性納米顆粒進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的試劑。由于 抗體的結(jié)構(gòu)特征和磁性納米顆粒被修飾羧基的原因，選擇的偶聯(lián)劑應(yīng)符合下列條件的一 種能活化羧基，使活化的羧基與抗體上的氨基反應(yīng)，形成肽鍵。本發(fā)明使用的偶聯(lián)劑
為乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)或N-羥基硫代琥珀酰亞胺 (Siilfo-NHS)或二者混合。優(yōu)選為單獨(dú)使用乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽 酸鹽(EDC)。
所述的"禽流感病毒多克隆抗體"是指通過(guò)禽流感病毒抗原于哺乳動(dòng)物皮下注射，進(jìn) 行多次免疫后，收集被免疫動(dòng)物的血清，并經(jīng)純化得到禽流感病毒多克隆抗體。
所述歩驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法一為分子篩法純化，分子篩為sephadexG100。 所述步驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法二為離心法純化，離心條件為4°C， 3000-12000r/min，離心10-20 min，離心后棄掉上清，所得沉淀即為偶聯(lián)抗體的磁性納 米顆粒。
所述歩驟(4)檢測(cè)富集產(chǎn)物的方法為用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢
本發(fā)明通過(guò)對(duì)磁性納米顆粒和抗體分子特性的研究，通過(guò)選擇合適的偶聯(lián)劑品種和 濃度，可以將水溶性的磁性納米顆粒與特異性的抗體進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，得到生物功能化的 磁性納米顆粒，這種生物功能化磁性納米顆粒與溶液中的病毒通過(guò)免疫特異性結(jié)合，再 通過(guò)磁鐵富集所需要的病毒。本發(fā)明對(duì)各種偶聯(lián)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了制備和純化具有 免疫活性的抗體偶聯(lián)磁性納米顆粒的方法，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)相關(guān)檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ)。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的富集禽流感病毒的方法，它分離速度快、效率高，并 且所需的設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
(1) 本發(fā)明提供的方法不損失病毒活性；
(2) 本發(fā)明提供的方法速度快、效率高；
(3) 本發(fā)明提供的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)。
(4) 本發(fā)明提供的方法快速、簡(jiǎn)便，而且設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉。


圖1用熒光RT-PCR法檢測(cè)富集前、后的病毒含量檢測(cè)結(jié)果。圖2用熒光RT-PCR法檢測(cè)富集前、后的病毒含量檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:磁性納米顆粒和禽流感病毒多克隆抗體的偶聯(lián)、純化，禽流感病毒的富
集和檢測(cè) 1、材料
pH8.0的硼酸緩沖液0.05 M硼砂30% (V/V)， 0.2 M硼酸70% (V/V)， pH值 為8。
磁性納米顆粒(購(gòu)自天津倍思樂(lè)公司產(chǎn)品)，EDC (乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亞胺鹽酸鹽)，Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，乙醇胺，1M甘氨酸，0.02 M NaH2P04， O.lMNaCl， 1%疊氮鈉(質(zhì)量百分比)，Sephadex G100 (購(gòu)自BIO-RAD產(chǎn) 品)，DEAE Sepharose Fast Flow (購(gòu)自Pharmacia公司)。
禽流感病毒抗原(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室)。
弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(購(gòu)自北京市生物制品檢定所)。
TRIZOL試劑(INVIOTROGEN)。
禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自深圳匹基公司產(chǎn)品)。 禽流感病毒多克隆抗體(6.25mg/ml)，自制；其制備方法為用禽流感病毒抗原分4 次免疫新西蘭大白兔，第1次免疫取2.0mL (250 pg/mL)禽流感病毒抗原與等體積 弗氏完全佐劑，充分研磨至完全乳化，兔頸背部皮下多點(diǎn)注射；間隔3周后進(jìn)行第2次 免疫取2.0mL (150 pg/mL)禽流感病毒抗原與等體積弗氏不完全佐劑，充分研磨至 完全乳化，兔頸背部皮下多點(diǎn)注射；間隔3周后進(jìn)行第3次免疫取2.0mL(150pg/mL) 布氏桿菌可溶性抗原，兔耳靜脈注射。20天后，頸動(dòng)脈放血收獲抗血清。
取20ml上述血清，加生理鹽水20ml，再逐滴加入(NH4) 2304飽和溶液10ml，使 成20% (NH4) 2S04溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置30min。 4°C, 3000r/min離 心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。在上清液中再加(NH4) 2S04飽和溶液30ml， 使成50% (NH4) 2S04溶液，充分混合，靜置30min。 4°C， 3000r/min離心20min，棄 上清。于沉淀中加20ml生理鹽水，使之溶解，再加(NH4) 2S04飽和溶液10ml，使成 33% (NH4) 2S04溶液，充分混合后，靜置30min。 4°C， 3000r/min離心20min，棄上 清，以除去白蛋白。用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。4。C冰箱中透析除鹽，在 常水中透析過(guò)夜，再在生理鹽水中于4。C透析24h，中間換液5次。4°C， 3000r/min離心10min去沉淀，上清液即為粗提禽流感病毒多克隆抗體。 粗提禽流感病毒多克隆抗體的離子交換樹(shù)脂純化
1) 取體積分?jǐn)?shù)為20%酒精浸泡的DEAE Sepharose Fast Flow填料20mL裝填柱子(112 cmx20 cmMillipore,購(gòu)自BIO-RAD公司)，先用200 mL純水以1.5 mL/min洗柱，再 用100 mL的Buffer A( 10 mmol/LTris-HClpH 8.0)以1.5 mL/min平衡柱子。
2) 將初純后所得的禽流感病毒多克隆抗體樣品利用透析袋更換成Buffer A緩沖液， 以1.0 mL/min流速上樣，同時(shí)開(kāi)啟紫外檢測(cè)儀，開(kāi)始記錄。
3) 上樣完畢后,首先用Buffer A洗脫,洗脫速度為1.0 mL/min ，并收集洗脫峰后；隨 后用含有0.1 mol/LNaCl Buffer A溶液進(jìn)行等梯度洗脫，收集洗脫峰1，標(biāo)記為P1， PI 樣品即為純化的禽流感病毒多克隆抗體，于4"冰箱保存。
2.方法
(1) 磁性納米顆粒和抗體的偶聯(lián)濃度為0.01 M的磁性納米顆?；鞈乙喝?00 ^ 加硼酸緩沖液補(bǔ)至800 pl，加入EDC 2mg和Sulfo-NHS 4mg，室溫反應(yīng)15分鐘。然后 加入10 ^乙醇胺淬滅EDC 。加100 ^禽流感病毒多克隆抗體(6.25 mg/ml)，室溫反 應(yīng)2小時(shí)。加100 ^ 1 M甘氨酸，封閉磁性納米顆粒上的未反應(yīng)的羧基。最后加入10 (^11%疊氮鈉，放到2'C冰箱中保存。
(2) 分離未偶聯(lián)的磁性納米顆粒和抗體(用Sephadex G100分子篩分離)取10 g SephadexG100干粉，加入適量0.1 MNaCl， 100。C加熱3小時(shí)，冷卻至室溫后，裝入層 析柱中。調(diào)整好流速后，用200mlNaH2PO4洗脫。使用紫外檢測(cè)器檢測(cè)洗脫液的280 nm 吸收值。收集各個(gè)組分，最前面的組分應(yīng)為所需磁性納米顆粒和抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物。
(3) 偶聯(lián)產(chǎn)物富集禽流感病毒
① 抗原抗體反應(yīng)取n個(gè)(11=稀釋的禽流感病毒抗原個(gè)數(shù))1.5ml離心管分別加入 按比例稀釋的禽流感病毒抗原各1000pl，再在每管中各加入10(Vl偶聯(lián)有抗體的磁性納 米顆粒混懸液，蓋上蓋子，室溫下渦旋充分混合或振蕩混合，37'C培養(yǎng)箱中濕盒孵育60 分鐘；
② 磁鐵富集將離心管從37'C培養(yǎng)箱中取出置于磁分離架上，室溫靜置45分鐘。 小心地吸出上清液。從磁分離架上取出離心管，加入20(^1PBS (0.02M， pH7.2)，渦旋 混合，即得到富集后的樣品。
(4) 富集產(chǎn)物的檢測(cè)將上述富集后的樣品以及上清液用TRIZOL試劑提取RNA, 用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體方法詳見(jiàn)《H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法》GB/T 19438.2-2004。 3.結(jié)果
如圖1所示，Ct值越低病毒含量越高，Ct值越高病毒含量越低。用偶聯(lián)抗體的磁性 納米顆粒富集后的病毒含量(上面的曲線(xiàn)A)明顯比用未偶聯(lián)抗體的磁性納米顆粒富集 后的病毒含量(中間的曲線(xiàn)B)以及富集前(下面的曲線(xiàn)C)的病毒含量高。
實(shí)施例2:磁性納米顆粒和禽流感病毒多克隆抗體的偶聯(lián)、純化，禽流感病毒的富 集和檢測(cè)
1. 材料
pH8.0的硼酸緩沖液0.05 M硼砂30% (V/V)， 0.2 M硼酸70% (V/V)，溶解后 pH為8。
磁性納米顆粒(購(gòu)自天津倍思樂(lè)公司產(chǎn)品)，EDC (乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亞胺鹽酸鹽)，乙醇胺，1M甘氨酸，0.02MNaH2PO4， O.lMNaCl， 1%疊氮鈉(質(zhì) 量百分比)，DEAE Sepharose Fast Flow (購(gòu)自Pharmacia公司)。
禽流感病毒多克隆抗體(6.25mg/ml)，同實(shí)施例1的制備方法。 禽流感病毒抗原(購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室)。 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑(購(gòu)自北京市生物制品檢定所)。 TRIZOL試劑(INVIOTROGEN)。
禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自深圳匹基公司產(chǎn)品)。
2. 方法
(1 )磁性納米顆粒和抗體的偶聯(lián)取濃度為0.01 M磁性納米顆?；鞈乙?00 Ml和 800 禽流感病毒多克隆抗體(6.25 mg/ml)，加入EDC 2mg室溫反應(yīng)2小時(shí)。力n 100 pllM甘氨酸，封閉磁性納米顆粒上的未反應(yīng)的羧基。最后加入10pl 1%疊氮鈉，放 到2T:冰箱中保存。
(2) 分離未偶聯(lián)的磁性納米顆粒和抗體將偶聯(lián)反應(yīng)所得產(chǎn)物離心，離心條件為 4。C， 3000-12000r/min，離心10-20 min，離心后輕輕棄掉上清，所得沉淀即為偶聯(lián)抗體 的磁性納米顆粒，然后將沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS， 0.02M， pH7.2)懸浮備用。
(3) 偶聯(lián)產(chǎn)物富集禽流感病毒
①抗原抗體反應(yīng)取n個(gè)(n-稀釋的禽流感病毒抗原個(gè)數(shù))1.5ml離心管分別加入 按比例稀釋的禽流感病毒抗原各1000|^1，再在每管中各加入ioow偶聯(lián)有抗體的磁性納米顆?；鞈乙海w上蓋子，室溫下渦旋充分混合或振蕩混合，37'C培養(yǎng)箱中濕盒孵育60 分鐘；
②磁鐵富集將離心管從37i:培養(yǎng)箱中取出置于磁分離架上，室溫靜置45分鐘。 小心地吸出上清液。從磁分離架上取出離心管，加入200^1 PBS (0.02M， pH7.2)，渦旋 混合，即得到富集后的樣品。
4)富集產(chǎn)物的檢測(cè)將上述富集后的樣品以及上清液用TRIZOL試劑提取RNA， 用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具體方法詳見(jiàn)《H5亞型禽流感病毒 熒光RT-PCR檢測(cè)方法》GB/T 19438.2-2004。
3.結(jié)果
如圖2所示，Ct值越低病毒含量越高，Ct值越高病毒含量越低。用偶聯(lián)抗體的磁性 納米顆粒富集后的病毒含量(上面的曲線(xiàn)A)明顯比用未偶聯(lián)抗體的磁性納米顆粒富集 后的病毒含量(中間的曲線(xiàn)B)以及富集前(下面的曲線(xiàn)C)的病毒含量高。
權(quán)利要求
1. 抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，包括如下步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，得到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液；(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物，去除未反應(yīng)的抗體和磁性納米顆粒；(3)偶聯(lián)產(chǎn)物和待測(cè)溶液反應(yīng)后，用磁鐵富集；(4)富集產(chǎn)物的檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合， 得到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液，是指將磁性納米顆粒、 偶聯(lián)劑和禽流感病毒多克隆抗體按l-2pmol: l-6mg: 0.625-5mg的比例混合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述磁性納米顆粒為超順磁性的磁性納米顆粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑為乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺或者上述二者任意混合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，其特征在于所述偶聯(lián)劑為乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法為分子篩法純化，分子篩為sephadex G亂
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的方法為離心法純化，離心條件為4°C， 3000-12000r/min,離心10-20 min,離心后棄掉上清，所得沉淀即為偶聯(lián)抗體的磁性納 米顆粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述禽流感病毒多克隆抗體為禽流感病毒抗原于哺乳動(dòng)物皮下注射，進(jìn)行 免疫后，收集被免疫動(dòng)物的血清并經(jīng)純化得到的禽流感病毒多克隆抗體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法， 其特征在于所述步驟(4)檢測(cè)富集產(chǎn)物的方法為用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè).
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了抗體偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域?？贵w偶聯(lián)的磁性納米顆粒富集樣品中禽流感病毒的方法，包括如下步驟(1)將磁性納米顆粒、禽流感病毒多克隆抗體和偶聯(lián)劑混合，室溫反應(yīng)2小時(shí)，得到含有偶聯(lián)有禽流感病毒多克隆抗體的磁性納米顆粒的溶液；(2)純化偶聯(lián)產(chǎn)物，去除未反應(yīng)的抗體；(3)偶聯(lián)產(chǎn)物和待測(cè)溶液反應(yīng)后，用磁鐵富集；(4)富集產(chǎn)物的檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明提供的方法不損失病毒活性；本發(fā)明提供的方法速度快、效率高；本發(fā)明提供的方法靈敏度高、特異性強(qiáng)。本發(fā)明提供的方法快速、簡(jiǎn)便，而且設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低廉。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101435824SQ20081023967
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者于維正, 潔 任, 丹 吳, 張向東, 柏亞鐸, 琳 汪, 王孔江, 賴(lài)平安, 亮 辛, 高志強(qiáng) 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局