專利名稱：：作為細(xì)胞內(nèi)Icrac活性基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)的功能鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及細(xì)胞內(nèi)的CRACM同源物(homolog)和Icrac活性。特別地，本發(fā)明提供了用于確定細(xì)胞內(nèi)對Icrac活性有貢獻(xiàn)的CRACM同源物的身份的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：在許多細(xì)胞類型中，f丐池操縱的Ca2+內(nèi)流(store-operatedCa2+entry)是在IP3介導(dǎo)的Ca2+從細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放之后細(xì)胞內(nèi)Ca2+持續(xù)升高現(xiàn)象的主要(即便不是唯一的)機制。先前的研究已經(jīng)確定STM1是ER腔內(nèi)Ca2+濃度的傳感器，而CRACM1(或稱0rail)是質(zhì)膜內(nèi)的鈣釋放激活鈣(CalciumRelease-ActivatedCalcium,CRAC)通道。鈣池的Ca2+一旦耗竭，STM1便轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜下的小泡結(jié)構(gòu)(細(xì)孔(puncta))內(nèi)，在那里它可以結(jié)合并激活CRACM1的多聚體組裝物。當(dāng)STM1和CRACM1—起而非個別地過表達(dá)時，可重建大CRAC電流。有三種哺乳動物同源CRAC通道蛋白CRACM1、CRACM2和CRACM3。CRACM2已顯示在與STM1共表達(dá)時可提高鈣池操縱的Ca2+內(nèi)流并產(chǎn)生大的CRAC電流。盡管同一研究發(fā)現(xiàn)CRACM3不提高鈣池操縱的Ca2+內(nèi)流，并且未觀察到電流，但是當(dāng)用siRNA敲低CRACM1時CRACM3似乎使鈣池操縱的Ca2+內(nèi)流恢復(fù)到了正常水平。鈣池操縱的鈣內(nèi)流是一種普遍存在的細(xì)胞功能元件，并且CRAC通道對于多種細(xì)胞過程是必不可少的。CRAC通道同源物們顯示迥然不同的電生理和藥理學(xué)性質(zhì)，因此需要提供一種方法和測定法來確定在不同細(xì)胞中對Icrac活性有貢獻(xiàn)的CRAC通道的身份。發(fā)明概要因此，本發(fā)明提供用于確定不同的CRACM通道對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法、組合物和方法。在一個方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM1對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。該測定法包括測量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個實施方案中，Icrac失活動力學(xué)的慢速失活相的鈣依賴性抑制表明CRACM1對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。在另一個方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM2對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。該測定法包括測量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個實施方案中，Icrac失活動力學(xué)的慢速失活相的鈣依賴性抑制表明CRACM2對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。在另外一個方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM3對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。該測定包括測量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個實施方案中，Icrac失活動力學(xué)的慢速失活相的鈣依賴性抑制表明CRACM3對所述細(xì)3胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。在一個方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量所述Icrac活性的離子選擇性。在另一個方面，本發(fā)明提供用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量2-APB存在下的Icrac活性。在一個優(yōu)選的方面，通過測量如表1所述的Icrac活性的功能性質(zhì)的組合來確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)。表I:CRACM同源物的功能性質(zhì)的區(qū)別性特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>附圖簡要說明圖1:(A)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")和CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中受IP3(20yM)誘發(fā)的-80mV下平均CRAC電流密度?？招姆柎肀凰鋈N同源物的野生型構(gòu)建體和CRACM1的顯性失活(dominantnegative)E106Q突變體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(CRACMl-E106Q+CRACMln=6，+CRACM2n=6，+CRACM3n=7)。[Ca2+]i用20mMBAPTA鉗制在接近0。(B)從圖A所示典型HEK293細(xì)胞提取的、在120s獲得的CRAC電流的平均電流-電壓(I/V)關(guān)系。數(shù)據(jù)代表減去了泄漏的電流密度(pA/pF)，對應(yīng)于CRACM1、CRACM2和CRACM3，由50ms_150至+150mV的電壓斜坡引發(fā)。虛線對應(yīng)于CRACM2和CRACM3I/V，但經(jīng)過放縮以便和_140mV下的CRACM1幅值相匹配。(C)在表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")和CRACM3(表示為"3")的細(xì)胞中，在使用20mMBAPTA而不加IP3引發(fā)被動鈣池耗竭之后的平均CRAC電流密度。電流分析如圖A。(D)從獲得的圖C所示典型HEK293細(xì)胞提取的實驗300s時的平均1/V跡線。跡線對應(yīng)于CRACM1、CRACM2和CRACM3。圖2:在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)(A)CRACM1;(B)CRACM2和(C)CRACM3的HEK293細(xì)胞中受IP3(20yM)和10mMEGTA誘發(fā)的_80mV下的平均CRAC電流密度。(D)在表達(dá)的細(xì)胞中通過階躍到-20mV、-40mV、-60mV^P_80mV的步進(jìn)脈沖(2s持續(xù)時間)引發(fā)的平均CRAC電流。在每次脈沖的開始，空出2.5ms以消除殘余電容假象。(E)在表達(dá)CRAM2的細(xì)胞中用_20mV至-80mV的步進(jìn)脈沖引發(fā)的平均CRAC電流。(F)在表達(dá)CRAM3的細(xì)胞中用-20mV至-80mV的步進(jìn)脈沖引發(fā)的平均CRAC電流。圖3:在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)(A)CRACM1;(B)CRACM2禾P(C)CRACM3的HEK293細(xì)胞中受IP3(20iiM)誘發(fā)的_80mV下平均CRAC電流密度。(D)在120s(對于CRACM3是150s)從圖A-C所示細(xì)胞提取的_80mV下CRACM1(黑色)、CRACM2(藍(lán)色)和CRRCM3(紅色)的平均電流密度，并針對[C^+]i作圖。(E)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")和CRACM3(表示為"3")的半最大激活時間針對[Ca2+]i的作圖。數(shù)據(jù)得自于圖A-C所示的細(xì)胞。(F)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并且用空載體轉(zhuǎn)染(綠色，n=14)或瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"l")、CRACM2(表示為"2")和CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中，由牽丐池耗竭i秀發(fā)的[Ca2+]i平均變化。箭頭指示在無Ca2+溶液中施加毒胡蘿卜素(th即sigargin)(2yM)以誘發(fā)f丐池耗竭并重新施加(readmission)2mMCa2+以探查Ca2+內(nèi)流。插圖代表[Ca2+]i的速度，通過對方形包圍的跡線部分進(jìn)行微分獲得。圖4:(A)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")或CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中由IP3(20iiM)誘發(fā)的_80mV下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流。將各個細(xì)胞的電流相對于改變?nèi)芤褐霸?20s時的電流加以標(biāo)準(zhǔn)化(1/I120s)。用20mMBAPTA將[C]i鉗制在接近0。條形指示標(biāo)稱無Ca2+的外部溶液的施加。(B)從圖A所示代表性細(xì)胞中提取的在120s和180s(n=7)獲得的CRACM2電流的平均1/V關(guān)系。數(shù)據(jù)代表通過50ms-150至+150mV的電壓斜坡引發(fā)的減去了泄漏的電流密度。(C)從在實驗120s和180s時(n=9)圖A所示代表性細(xì)胞中提取的CRACM3電流的平均I/V關(guān)系。(D)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")或CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中由IP3(20yM)誘發(fā)的_80mV下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流(I/I脆)。條形指示在Na+存在下含10mMBa2+的外部溶液的施加。(E)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")或CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中由IP3(20yM)誘發(fā)的_80mV下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流(1/112。丄。條形指示含10mMBa2+的外部溶液的施加，其中外部Na+被替換為TEA+。(F)在穩(wěn)定表達(dá)STIM1并瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")或CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中由IP3(20iiM)誘發(fā)的-80mV下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流(I/I12。s)。條形指示不含二價離子的外部溶液的施加。(G)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM1(表示為"1")、CRACM2(表示為"2")或CRACM3(表示為"3")的HEK293細(xì)胞中由IP3(20yM)誘發(fā)的_80mV下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流(I/I12。s)。條形指示含50M2-APB的外部溶液的施加。圖5:在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM3的HEK293細(xì)胞(n=3)中由IP3(20iiM)禾P10mMEGTA誘發(fā)的_80mV下的平均CRAC電流密度。通過在50ms時間內(nèi)以0.5Hz速度輸送-100mV-+100mV電壓斜坡對CRAC電流進(jìn)行連續(xù)監(jiān)視。在完全激活CRAC電流之后(120s)，輸送一個到-80mV的維持時間為2s的矩形電壓脈沖(見圖B)。然后，將細(xì)胞暴露于無二價離子的外部溶液中，并又施加一個電壓脈沖。(B)在10mMCa"存在下(黑色)和在DVF溶液(n=3，與圖A相同的細(xì)胞)中由到_80mV的步進(jìn)脈沖(2s持續(xù)時間)引發(fā)的平均CRAC電流。注意DVF溶液中失活的喪失。圖6:CRACM3的不依賴于f丐池和STIM的激活。(A)在僅過表達(dá)CRACM3(無STIM1)5的HEK293細(xì)胞中測量的CRAC電流的標(biāo)準(zhǔn)化平均時間過程。各個細(xì)胞的電流在_80mV和+80mV下測量，并對細(xì)胞電容加以標(biāo)準(zhǔn)化，取平均值，并針對時間作圖(n=6±S.E.M.)。胞質(zhì)鈣離子用20mMBAPTA和20iiM13鉗制在接近0。(B)在實驗180s從圖A所示的代表性HEK293細(xì)胞提取的CRAC電流的平均電流_電壓(I/V)關(guān)系。數(shù)據(jù)代表由50ms-150至+150!^的電壓斜坡引發(fā)、減去了滲漏，并針對細(xì)胞電容(pF)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化的電流。圖7:2-APB通過CRACM1孔突變體誘發(fā)的電流。(A)在瞬時過表達(dá)CRACM1-E106D的HEK293wt細(xì)胞中在-80mV(黑色)，+80mV(空心符號)和+130mV(紅色)下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流。內(nèi)部溶液被緩沖在150nMCa2+。條形指示含50yM2-APB的外部溶液的施加(n=5)。(B)圖A所示數(shù)據(jù)系列在2-APB施加之前和在CRAC重新激活期間的示例I/V-曲線。(C)在穩(wěn)定表達(dá)STM1并瞬時過表達(dá)CRACM1-E190A的HEK293中在-80mV(黑色)，+80mV(空心符號)和+130mV(紅色)下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流。內(nèi)部溶液含20yMIP3。條形指示含50iiM2-APB的外部溶液的施加(n=9)。(D)圖C所示數(shù)據(jù)系列在2-APB施加之前和在CRAC電流易化(facilitation)達(dá)到高峰時的示例I/V-曲線。(E)在瞬時過表達(dá)CRACM1-E190A的HEK293wt細(xì)胞中在_80mV(黑色)、+80mV(空心符號)和+130mV(紅色)下的平均標(biāo)準(zhǔn)化CRAC電流。內(nèi)部溶液被緩沖保持在150nMCa2+。條形指示含50yM2-APB的外部溶液的施加(n=8)。(F)圖A所示數(shù)據(jù)系列在2-APB施加之前和在CRAC電流易化達(dá)到高峰時的示例I/V-曲線。發(fā)明詳細(xì)說明縮寫"2-APB"是指2_氨基乙氧基二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenylborate)。"HV，是指肌醇1，4，5-三磷酸。"STIM1"是指基質(zhì)相互作用分子1(StromalInteractionMolecule1)。類似地，"STIM2"是指基質(zhì)相互作用分子2。"CRAC通道"是指f丐釋放激活的Ca2+通道(CalciumRelease-ActivatedCa2+channel)。定義單數(shù)形式"一"、"一個"和"該"包括復(fù)數(shù)的指代對象，除非上下文明確地另有指示。因此，例如，在指稱用于投遞"一種藥物"的化合物時，包括指稱一種、兩種或多種藥物。術(shù)語"Icrac活性"是指鈣釋放激活的電流活性，并可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行定量，包括電生理和鈣成像。Icrac活性可以是細(xì)胞內(nèi)一種或多種CRAC通道同源物激活的結(jié)果。術(shù)語"影響"CRACM同源物活性在這里泛指所述同源物的門控(gating)、滲透性(permeability)、選擇性和/或表達(dá)的任何變化。引言CRACM通道蛋白是所有細(xì)胞類型的普遍特征，如果能夠鑒定出不同細(xì)胞中作為Icrac活性基礎(chǔ)的CRAC通道同源物，將可以為細(xì)胞內(nèi)的f丐調(diào)節(jié)研究提供診斷工具。因此，本發(fā)明提供了用于功能鑒定細(xì)胞內(nèi)Icrac活性之下的CRACM同源物的測定法和方法。CRACM通道可以被f丐池的快速耗竭所激活，例如通過施加IP3，或者通過被動的牽丐池耗竭而被激活，例如通過施加螯合劑，例如BAPTA，或施加sarc/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)f丐ATP酶(SERCA)抑制劑，例如毒胡蘿卜素。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如電生理和鈣成像，可以對這些通道同源物激活、失活以及調(diào)節(jié)鈣內(nèi)流的動力學(xué)進(jìn)行監(jiān)視和測量。CRACM同源物的激活和失活動力學(xué)響應(yīng)于快速鈣池耗竭(例如通過施加IP3)而激活的CRAC電流，典型地顯示內(nèi)向整流的電流-電壓關(guān)系?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明利用對這些電流的激活動力學(xué)的測量來區(qū)分不同CRACM同源物對Icrac活性的貢獻(xiàn)。當(dāng)在HEK293細(xì)胞中異源表達(dá)時，CRACM2和CRACM3在_80mV下的平均電流幅值比CRACM1的相應(yīng)幅值小大約3倍，當(dāng)仍然比HEK293細(xì)胞中的天然CRAC電流高20倍。CRACM同源物們的激活動力學(xué)顯示顯著的差異，半最大激活時間(±s.e.m)為CRACM1=35±7s(n=12)，CRACM2=21±3s(n=8)，CRACM3=63±7s(n=9)(另見圖3E)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以利用針對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的激活動力學(xué)的測量來確定一種或多種CRACM同源物的貢獻(xiàn)。CRAC電流一般顯示兩相失活動力學(xué)，一個"慢速失活"相，在數(shù)十秒內(nèi)發(fā)生；和一個"快速失活"相，在毫秒范圍內(nèi)發(fā)生。這種動力學(xué)可能依賴細(xì)胞內(nèi)鈣的水平。例如，當(dāng)向完全激活的CRAC通道施加超極化脈沖時，某些同源物，例如CRACM2和CRACM3，可見電流幅值的快速下降，這是由于快速失活導(dǎo)致的。如果施加一系列(atrainof)的超極化脈沖，CRACM1的電流幅值緩慢衰減，并經(jīng)數(shù)十秒緩慢恢復(fù)，但CRACM2和CRACM3則不然(見圖3)，這部分地是由于慢速激活過程導(dǎo)致的。在CRACM1的情形，由一系列超極化脈沖導(dǎo)致的慢速失活可以導(dǎo)致在大約100秒的時間內(nèi)CRAC電流降低50%。然而，在表達(dá)CRACM2或CRACM3的細(xì)胞中，相似的實驗流程不會引發(fā)在CRACM1中見到的慢速失活動力學(xué)，僅有表現(xiàn)出一定程度的快速失活相。因此，本發(fā)明提供基于對失活動力學(xué)和失活動力學(xué)鈣依賴性的測量來確定不同CRACM同源物對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法和方法。在一個方面，本發(fā)明提供了用于確定CRACM2對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。該測定法包括測量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和/或鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個實施方案中，Icrac動力學(xué)的中等的(moderate)f丐依賴性快速失活表明CRACM2對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。如本文所使用的，中等快速失活是指導(dǎo)致電流幅值降低大約40%-大約50%的快速失活。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，缺少慢速鈣引發(fā)失活和中等快速失活表明CRACM2對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于確定CRACM3對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。該測定法包括測量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和/或鈣內(nèi)流。在本發(fā)明的一個實施方案中，Icrac動力學(xué)的強烈的鈣依賴性快速失活相指示CRACM3對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。在本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案中，測量激活動力學(xué)包括測量所述失活動力學(xué)的鈣依賴性，并且缺少慢速鈣引發(fā)失活和強烈快速失活表明CRACM3對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。如本文所使用的，強烈快速失活是指導(dǎo)致電流幅值降低大約70%-大約80%的快速失活。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于確定在不存在STIM1時CRACM3對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。CRACM同源物的離子選擇性突變分析顯示，CRACM1中存在決定CRAC電流的選擇性的數(shù)個關(guān)鍵氨基酸，包括跨膜片段1中的谷氨酸殘基106和跨膜片段3中的谷氨酸殘基190。這些殘基被認(rèn)為形成一7個內(nèi)襯在通道開孔上的帶負(fù)電氨基酸環(huán)，谷氨酸106和109在全部三種CRACM同源物中均保守?？缒て?和跨膜片段2之間的環(huán)內(nèi)的另一個區(qū)域也會影響CRACM1的離子選擇性。該區(qū)域具有三個關(guān)鍵的天冬氨酸殘基(D110/D112/D114)，它們形成第二個帶負(fù)電的環(huán)，來與孔內(nèi)的另一個&2+離子配位。這些殘基在三種同源物中有不同，CRACM2具有E110/Q112/Q114，而CRACM3具有E110/D112/E114。這些差異可能是這些同源物的選擇性譜(selectivityprofiles)的差異的內(nèi)在原因。盡管這三種同源物顯示出相似的對Ca2+優(yōu)于Na+的鈣選擇性，但當(dāng)除去所有二價陽離子時，三種同源物對作為電荷載體的Na+的滲透性顯示差異。當(dāng)除去全部陽離子同時施加10mMEDTA用以螯合任何殘余陽離子時，CRAC通道變成Na+滲透性，通常在過表達(dá)CRACM1的HEK293細(xì)胞中內(nèi)向電流有2倍增加。相同的實驗流程產(chǎn)生略微更大的CRACM2電流，而CRACM3則產(chǎn)生顯著更大的單價電流。在一個方面，本發(fā)明提供了用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量所述Icrac活性的離子選擇性。在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)Na+是電荷載體時的Icrac的活性水平指示CRACM1、CRACM2、CRACM3或它們的某些組合對所述Icrac活性的一定水平的貢獻(xiàn)。CRACM同源物的異源多聚體CRACM1已顯示可形成多聚通道復(fù)合體。CRACM1的非傳導(dǎo)孔突變(E106Q)可賦予對天然CRAC通道以顯性失活表型，可利用它來確定其它CRACM同源物是否能夠與CRACM1形成多聚體。CRACM1-E106Q與等量的野生型CRACM2和CRACM3聯(lián)合過表達(dá)可基本上消除由這兩種CRACM同源物攜帶的CRAC電流，提示這些通道同源物可形成異源多聚體(見圖1)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明利用這些異源多聚體的動力學(xué)和鈣內(nèi)流活性來鑒定不同CRACM同源物與CRACM異源多聚體對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)。在一個實施方案中，本發(fā)明的測定法包括比較在細(xì)胞系內(nèi)異源表達(dá)的CRACM異源多聚體的活性與天然細(xì)胞中的Icrac活性，以確定不同CRACM同源物對天然細(xì)胞中Icrac活性的貢獻(xiàn)。在一個進(jìn)一步的實施方案中，該測定法包括比較異源表達(dá)的CRACM同源物和異源多聚體與天然細(xì)胞中Icrac活性的離子選擇性、門控、藥理學(xué)和滲透性。CRACM同源物的藥理學(xué)鑒定和分析不同CRACM同源物對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的手段之一是使用藥理學(xué)。在本發(fā)明的一個方面，可以使用以不同方式影響不同的同源物的藥理學(xué)試劑來確定一種或多種同源物對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的影響。在一個方面，使用2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)作為工具，鑒定和分析不同CRACM同源物對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)。2-APB是一種在低劑量下(《5yM)對CRACM電流有促進(jìn)效應(yīng)，但在高劑量下(>10iiM)抑制CRACM電流的化合物，且在50iiM2-APB下可見完全抑制CRACM1。然而，CRACM2對2-APB介導(dǎo)的抑制的敏感性明顯較低，至于CRACM3，令人驚訝的是，其在相同范圍的2-APB濃度下被2-APB大大增強。在一個方面，本發(fā)明提供了用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量2-APB存在下的Icrac活性。2-APB存在下Icrac電流的增強表明CRACM3對所述Icrac活性有貢獻(xiàn)。在本發(fā)明的一個實施方案中，在小于或等于5yM2-APB的濃度下Icrac電流的增強而在大于或等于lOyM2-APB的條件下Icrac電流的抑8制，表明CRACM1對所述Icrac活性有貢獻(xiàn)。在不存在STM1過表達(dá)時，CRAC電流典型地小于lpA/pF，甚至當(dāng)f丐池耗竭時亦然。然而，50iiM2-APB可以通過直接激活CRACM3通道而激發(fā)大的CRAC電流。在不存在IP3并且將細(xì)胞內(nèi)Ca"緩沖在150nM以避免鈣池耗竭時，也可引發(fā)類似的響應(yīng)(n=6，數(shù)據(jù)未顯示)。因此，2-APB誘發(fā)的電流是不依賴于鈣池和STIM的。這種機制可以利用來在不進(jìn)行STIM過表達(dá)的情況下激活CRACM3，還可用于藥物篩選目的的電流或Ca2+信號測量。在另一個方面中，可以利用2-APB改變CRAC通道的選擇性來評估Icrac及其組分CRACM同源物的活性。在一個實施方案中，2-APB的施加改變CRACM3的選擇性(見圖6)。在本發(fā)明的一個方面，使用2-APB改變CRACM同源物的選擇性允許使用Na+指示劑或用電壓敏感的染料進(jìn)一步鑒定不同CRACM同源物對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)。例如，2-APB引發(fā)的CRACM3電流在正負(fù)膜電壓下顯示強烈的整流，反轉(zhuǎn)電位為+30mV(見圖6D)。正常情況下，CRAC電流是高度Ca2+選擇性的，對K+或Cs+的滲透性差，導(dǎo)致正的反轉(zhuǎn)電位。然而，當(dāng)細(xì)胞暴露于2-APB時，CRACM3所見的外向電流顯示出對單價Cs+的滲透顯著增加，反轉(zhuǎn)電位產(chǎn)生較大的遷移。在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供CRACM同源物活性對2_APB類似物的響應(yīng)的測定法。這些類似物在本領(lǐng)域是已知的，例如具有對噁唑硼烷(oxazaborolidine)環(huán)的各種取代(甲基、二甲基、叔丁基、苯基、甲苯基和吡啶基)的類似物，和噁唑硼烷環(huán)的大小增加到7和9元環(huán)的類似物。其它可根據(jù)本發(fā)明加以使用的2-APB類似物包括結(jié)構(gòu)類似物，例如酚酞和酚酞衍生物。CRAC通道與疾病有大量疾病與CRAC通道的突變有關(guān)，包括但不限于免疫缺陷疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病。例如，已有人描述了一種遺傳缺陷，其中CRAC通道的一個關(guān)鍵組分的突變導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能障礙和嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)(Partisetietal.，JBiol.Chem.(1994)269:32327-35;Feskeetal.，Nature(2006)441:179-85)。研究、診斷和治療這些疾病和其它CRAC相關(guān)疾病的強有力工具之一是鑒定(1)作為這些疾病狀態(tài)下Icrac活性的基礎(chǔ)的CRAC通道同源物和(2)可調(diào)節(jié)這些CRAC通道的作用劑的能力。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種能夠鑒定CRACM1、CRACM2和/或CRACM3對與疾病有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法。在優(yōu)選實施方案中，該測定法包括測量Icrac活性，特別是激活動力學(xué)、失活動力學(xué)、鈣內(nèi)流、離子選擇性和滲透。在進(jìn)一步的實施方案中，該測定法包括測量2-APB對于同源物的差異藥理學(xué)作用。參考如下的非限制性實施例可更好地理解本發(fā)明。這些實施例只是作為本發(fā)明的示例提供的。給出下列實施例是為了更全面地例證本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為它們在任何方面對本發(fā)明的寬廣范圍構(gòu)成限制。實施例實施例1:CRACM同源物的異源表達(dá)為了估計CRACM蛋白的功能性質(zhì)，將全部三種CRACM在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)。測量響應(yīng)于由20iiM肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)導(dǎo)致的快速鈣池耗竭的CRAC電流，以及用20mMBAPTA灌注(perfuse)細(xì)胞導(dǎo)致的被動f丐池耗竭之后的CRAC電流；其中BAPTA灌注導(dǎo)致的*丐池耗竭較慢，依賴于Ca2+從*丐池的泄漏。如前人所述亞克隆全長人CRACM1(登錄號NM_032790)和CRACM1-E106Q。將全長人CRACM2(登錄號NM_032831))和CRACM3(登錄號NMj52288)用高保真PfuUltraHighFidelitypolymerase(Stratagene)從cDNA(購自O(shè)rigene)擴增后，亞克隆到pCAGGS-IRES-GFP載體內(nèi)。在CRACM2和CRACM3cDNA起始密碼子的緊鄰5'端合框地引入核糖體結(jié)合位點ACCGCCACC和HA-標(biāo)簽，隨后亞克隆到pCAGGS-IRES-GFP中，用于與綠色熒光蛋白(GFP)—起瞬時雙順反式表達(dá)CRACM2和CRACM3。利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000(Invitrogen)將CRACM蛋白在穩(wěn)定表達(dá)STM1的HEK293細(xì)胞中過表達(dá)，并通過熒光選擇表達(dá)GFP的細(xì)胞。在21-25t:下以高密封全細(xì)胞模式進(jìn)行膜片鉗實驗。用EPC-9(HEKA)獲得了高分辨率的電流紀(jì)錄。在100-300sec的期間內(nèi)以0.5Hz的速度從OmV的保持電位輸送跨度范圍為-100-+10011^、持續(xù)時間為50ms的電壓斜坡。對全部電壓針對10mV的液體接界電位進(jìn)行修正。電流以2.9kHz濾波，并以100iis間隔數(shù)字化。在每次電壓斜坡之前對電容電流進(jìn)行確定和修正。從每個斜坡電流紀(jì)錄提取_80mV下的電流幅值，評估電流的低分辨率的時間演化(temporaldevelopment)。在適用情況下，平均數(shù)據(jù)的統(tǒng)計誤差以n次確定的平均值士S.E.M.給出。標(biāo)準(zhǔn)外部溶液如下(單位是mM):120NaCl、2MgCl2、10CaCl2、10TEA-Cl、10HEPES、10葡萄糖、用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.2、300mOsm。在一些實驗中，添加無Na+溶液，其中NaCl替換為等摩爾的四乙基氯化銨(TEA-C1)。對于無Ca2+外部溶液，不加CaCl2，但保留Mg"。無二價離子外部溶液(DVF)是基于標(biāo)準(zhǔn)的外部溶液，但不存在CaCl2和MgCl2，并額外地補加10mMEDTA。二價替換溶液是基于標(biāo)準(zhǔn)外部溶液，但用10mMBaCl2替換10mMCaCl2。在一些實驗中，向標(biāo)準(zhǔn)外部溶液添加2-氨基乙氧基二苯基硼酸(2-APB)至終濃度為50iiM。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)部溶液如下(單位是mM):120Cs-谷氨酸鹽，20Cs*BAPTA，3MgCl2，IOHEPES，0.02IPs，用CsOH調(diào)至pH7.2，300mOsm。在圖2的實驗中，使用lOmMEGTA，在圖3中，用20mMCsBAPTA將[Ca2+]t和WebMaxC算得的合適濃度的CaCl2緩沖保持在指定的水平。對于被動耗竭實驗，內(nèi)部溶液中不加IP3。所有的化學(xué)品均購自于Sigma-Aldrich公司。野生型HEK293細(xì)胞通常顯示0.5pA/pF的天然CRAC電流，呈典型的內(nèi)向整流型電流_電壓(I/V)關(guān)系。在野生型HEK細(xì)胞中單純地過表達(dá)CRACM2或CRACM3對內(nèi)源CRAC電流無顯著影響，這與產(chǎn)生放大的CRAC電流額外需要STM1是一致的。在穩(wěn)定過表達(dá)STIM1的HEK293細(xì)胞中瞬時過表達(dá)CRACM2或CRACM3后，當(dāng)用IP3導(dǎo)致f丐池耗竭時，CRACM2-和CRACM3-表達(dá)細(xì)胞中均產(chǎn)生了大的膜電流(圖1A)，呈Icg特征性的內(nèi)向整流型電流-電壓(I/V)關(guān)系(圖IB)。實施例II:CRACM同源物的激活動力學(xué)和電壓依賴行為當(dāng)與STM1共表達(dá)時，CRACM2和CRACM3的_80mV平均電流幅值比CRACM1的相應(yīng)幅值小大約3倍，但仍然比HEK293細(xì)胞中的天然CRAC電流高20倍。CRACM1同源物們的激活動力學(xué)迥然相異，其半最大激活時間(±s.e.m)為CRACM1=35±7s(n=12)、CRACM2=21±3s(n=8)、andCRACM3=63±7s(n=9)(見圖3E)。三種通道的平均1/V關(guān)系，經(jīng)過放縮以在_140mV處匹配后(圖IB中的虛線)，在整流上顯示微小的差異，其中CRACM3的彎曲最顯著，這是由于它的非常顯著的快速Ca"依賴性失活造成的(見圖2)。研究了無IP3存在下用20mMBAPTA造成的被動鈣池耗竭所致的CRACM通道激活。全部三種CRACM都產(chǎn)生了具有一個特征性延遲的CRAC樣電流，該延遲反映通過泄漏途徑被10動地耗竭f丐池所需要的時間。1/V關(guān)系(圖ID)證實這些電流具有CRAC電流特征性的形狀。綜上，這些結(jié)果顯示，所有三種CRACM同源物在與STM1共表達(dá)時都能在鈣池主動或被動耗竭時產(chǎn)生放大的鈣池操縱CRAC電流。實施例III:CRACM異源多聚體考慮到所有三種同源物均形成了鈣池操縱的通道，而且CRACMl已被證明可形成多聚通道復(fù)合體，利用CRACMl的一種可賦予天然CRAC通道以顯性失活表型的非傳導(dǎo)性孔突變(E106Q)來評估CRACMl是否能夠與CRACM2和/或CRACM3組裝成異源多聚體通道復(fù)合體。圖1A顯示，通過CRACM1-E106Q與等量的野生型CRACM蛋白聯(lián)合過表達(dá)，基本上消除了由任一種CRACM同源物攜帶的CRAC電流，提示這種CRACMl孔突變體確實可給予顯性失活作用。與CRACM1-E106Q共表達(dá)的三種同源物在100-120s、-SOmV下的平均電流幅值為:CRACM10.15±0.15pA/pF(n=6)、CRACM20.19±0.13pA/pF(n=6)、和CRACM30.33±0.28pA/pF(n=7)，都低于在表達(dá)STM1的HEK293細(xì)胞中的內(nèi)源CRAC電流(0.69±0.27pA/pF(n=14))。這些結(jié)果顯示，CRACMl能夠與它的兩種同源物形成異源多聚體通道。實施例IV:CRACM同源物的失活動力學(xué)天然CRAC電流受[Ca2+]i的Z調(diào)節(jié)，并且有快速和慢速Ca2+依賴性失活?？焖偈Щ钤诤撩敕秶鷥?nèi)發(fā)生，被認(rèn)為是Ca2+結(jié)合于通道本身的結(jié)果，而歷時數(shù)十秒的慢速失活可能是由于鈣池重新充盈(storerefilling)和/或借助細(xì)胞對通道的反饋機制實現(xiàn)的調(diào)節(jié)機制所造成的。圖IB所見的CRACM同源物們的內(nèi)向整流的差異指示了不同同源物在快速激活動力學(xué)上的差異。在圖2所示的實驗中，利用含有10mMEGTA的細(xì)胞內(nèi)溶液以20iiMIP3誘導(dǎo)了三種同源物攜帶的CRAC電流。上述這種螯合劑螯合Ca2+較緩慢，因此抑制快速Ca2+依賴性失活的效率比BAPTA低。如果在細(xì)胞內(nèi)積累了充足的Ca2+，則EGTA的緩沖能力被克服，而顯示出慢速Ca2+依賴性過程。以0.5Hz的速度輸送歷時50ms、跨度范圍為-100—lOOmV的電壓斜坡，對CRAC電流進(jìn)行連續(xù)監(jiān)視。在CRAC電流被完全激活之后，輸送持續(xù)時間2s的矩形電壓脈沖并增加負(fù)電壓以提高Ca"內(nèi)流。圖2A-C顯示，每個超極化脈沖都導(dǎo)致CRACMl電流幅值快速降低，然后在下一個脈沖被輸送之前緩慢地但非完全地恢復(fù)。所述電流的快速降低是快速失活所致，而所述恢復(fù)可能是兩種相反效應(yīng)——通道從快速失活的恢復(fù)和歷時數(shù)十秒的緩慢失活——的凈結(jié)果(見圖3)。在CRACMl的情形，5個超極化脈沖產(chǎn)生的慢速失活導(dǎo)致在100秒的時期內(nèi)CRAC電流減小大約50%。與此形成顯著對比的是，在表達(dá)CRACM2或CRACM3的細(xì)胞中進(jìn)行相同的實驗方案后僅顯示電流的快速失活，沒有顯著的慢速失活(圖2B和C)。CRACM2總的來說顯示對Ca"誘發(fā)的失活有相當(dāng)?shù)目剐?，僅有小部分的快速失活，而CRACM3則顯示程度高得多的快速失活。在兩種情況下，從快速失活的恢復(fù)均基本上在20s內(nèi)完成。圖2D-F顯示了由圖A-C中的超極化脈沖產(chǎn)生的高分辨CRAC電流的平均值，展示了三種同源物的快速&2+依賴性失活的程度。CRACM3電流展現(xiàn)顯著的&2+依賴性失活，在-80mV下具有下述特征時間常數(shù)t=17ms的顯著指數(shù)式衰減，和一個極小的慢組分t2=130ms。CRACM3的這種急劇失活主要是由Ca2+導(dǎo)致的。在進(jìn)行與圖2C相似的方案的實驗中，在轉(zhuǎn)換到DVF溶液之后于10mMCa2+存在下，施加一個-80mV的超極化電壓脈沖，結(jié)果顯示了在Ca"存在時的一個快速的失活電流(inactivatingcurrent)，和在沒有二價陽11離子的條件下的一個持續(xù)的非失活電流(non-inactivatingcurrent)(圖5)。CRACM2顯示中等快速的Ca"依賴性失活，以兩個時間常數(shù)、二80ms和t2=900ms衰減，兩者對總快速失活貢獻(xiàn)的量大約相等。CRACMl顯示復(fù)雜的行為，可以反映了三種C^+依賴性反饋效應(yīng)，因此不能容易地基于時間常數(shù)加以定量評估。CRACM1電流的慢速失活在圖2D所示記錄中不顯著，因為它的發(fā)生歷時數(shù)十秒(見圖2A)。然而，慢速失活表現(xiàn)在負(fù)脈沖下獲得的電流幅值的總體減少，因為這些幅值比基于內(nèi)向整流型IA所預(yù)測的要小。為了估計CRAC電流的慢速Ca2+依賴性失活，將細(xì)胞用20mMBAPTA和適量的CaCl2灌注，以將游離[C]i鉗制在0-1yM的限定水平上。用I&誘導(dǎo)CRAC電流并通過電壓斜坡加以監(jiān)視。圖3A所示的結(jié)果證明，增加(Ca2+]i可劑量依賴地抑制CRACM1電流，但對CRACM2或CRACM3的影響很小或者不顯著(圖3B和C)。CRACM2或CRACM3未見顯著的慢速失活可能在生理背景下具有一些重要性，因為生理條件下存在的中等[Ca"]i水平(300-500nM)將趨向于維持CRACM2和CRACM3通道的活性，而CRACM1電流將被顯著降低。僅當(dāng)[Ca2+]i為1iiM時，CRACM2和CRACM3電流受抑制的程度才幾乎與CRACM1攜帶的電流一樣強。實施例V:CRACM同源物動力學(xué)的f丐依賴性和f丐內(nèi)流的調(diào)節(jié)通過測定達(dá)到半最大激活的時間(t1/2)來檢驗[C]i對CRAC電流動力學(xué)的影響。對于具有相似的快速激活動力學(xué)的CRACM2和CRACM1而言，該參數(shù)一般不依賴[Ca2+]i(圖3E)。CRACM3電流的激活在低[Ca2+]t水平下顯著慢于其它同源物，但其在150_300nM的中等[Ca"]i下被加速(圖3E)。CRACM同源物之間的動力學(xué)差異以及快速和慢速Ca"依賴性失活的程度對于鑒定天然表達(dá)它們的細(xì)胞中的CRACM種類可能是有用的。對于Ca2+測量，將負(fù)荷有fura-2AM(MolecularProbes,Eugene,0R，USA)細(xì)胞(liiM/60min/37°C)保持在含有如下成分的細(xì)胞外鹽溶液中(單位是mM):140NaCl、2.8KCl、2MgCl2、10葡萄糖、10HEPESNaOH，pH7.2。向浴液添加2iiM毒胡蘿卜素以誘導(dǎo)鈣池耗竭，并且添加2mM&2+用來估計鈣池操縱的012+內(nèi)流。實驗使用ZeissAxiovert100熒光顯微鏡，其安裝有一個雙激發(fā)熒光計成像系統(tǒng)(TILL-Photonics，Grafelfmgen，Germany)，并使用40xPlanNeoFluar目鏡。數(shù)據(jù)獲取和計算用TILLvisION軟件控制。負(fù)荷了染料的細(xì)胞用340和380nm波長激發(fā)，激發(fā)波長由單色器(PolychromeIV)產(chǎn)生。用攝像機(TILL-PhotonicsImago)使用440nm長通濾光片同時記錄數(shù)個單細(xì)胞體的熒光發(fā)射。信號以O(shè).5Hz取樣，并計算成不同波長下的熒光強度的相對比值單位(340/380nm)。結(jié)果作為[C^+]i給出，其是從340/380nm熒光值計算得到的，計算所使用的體內(nèi)Ca2+標(biāo)定是用確定濃度的Ca2+和fura-2組合在膜片吸管中進(jìn)行膜片鉗實驗獲得的。如果慢速Ca2+依賴性失活以上述的方式影響CRACM1電流，那么可以預(yù)期慢速Ca2+依賴性失活會至少部分地影響在[Ca2+]i由于CRAC通道活性增加的完整細(xì)胞中觀察到的Ca2+內(nèi)流量。在表達(dá)各種CRACM蛋白的細(xì)胞中監(jiān)視Fura-2信號。對細(xì)胞實施標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程，其中在不存在細(xì)胞外Ca2+的條件下用毒胡蘿卜素誘導(dǎo)鈣池耗竭，隨后重新加入2mMCa2+以探測鈣池操縱的Ca"內(nèi)流(圖3F)。在空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Ca"的重新加入(Caeadmission)通過經(jīng)由內(nèi)源CRAC通道的牽丐池操縱內(nèi)流(store-operatedentryth麗ghendoge麗sCRACchannels)導(dǎo)致了[Ca2+]i的中等程度的增加(moderateincrease)。過表達(dá)CRACM同源物的細(xì)胞產(chǎn)生了顯著更大的[Ca"]i變化，對fura-2信號進(jìn)行微分來分析Ca"內(nèi)流速度時，這一變化更加引人注目(見圖3F插圖)。盡管在將[C^+]i緩沖保持在接近0時，CRACM1能夠產(chǎn)生比CRACM2或CRACM3大3倍的電流(圖1A)，但是在完整細(xì)胞中利用fura_2進(jìn)行評估時，所有三種同源物均達(dá)到相似的[Ca2+]i絕對水平和初始Ca2+內(nèi)流速度。這種現(xiàn)象的原因可能是更顯著的慢速Ca2+依賴性失活，其限制了CRACM1的Ca2+內(nèi)流速度，使[Ca2+]i無法發(fā)生較大的增加。因此，在總體[C^+]i增加到300-500nM范圍的完整細(xì)胞中獲得的[Ca2+]i信號，與將總體[Ca2+]i鉗制在該范圍內(nèi)的限定水平時觀察到的CRAC電流的幅值是相當(dāng)?shù)?見圖3D)。實施例V:CRACM同源物的離子選擇性先前關(guān)于CRACM1的工作鑒定了該蛋白三個區(qū)域內(nèi)影響通道的選擇性的關(guān)鍵殘基。跨膜(TM)片段1的谷氨酸殘基106和TM3的谷氨酸殘基190被認(rèn)為可形成內(nèi)襯在通道孔內(nèi)的帶負(fù)電氨基酸環(huán)。這兩個殘基在全部三種CRACM同源物中均是保守的，因此不太可能是三種同源物之間選擇性差異的原因。然而，位于TM1和TM2之間的環(huán)內(nèi)的第三個區(qū)域也會影響CRACM1的選擇性。該區(qū)域具有三個關(guān)鍵的天冬氨酸殘基(D110/D112/D114)，它們可以形成另一個帶負(fù)電的環(huán)，其將另一個Ca"離子配位到CRACMl孔(coordinatesasecondCa2+iontotheCRACM1pore)，而且這些殘基在三種同源物中存在差異(CRACM2具有E110/Q112/Q114，而CRACM3具有E110/D112/E114)。對所有三種蛋白質(zhì)針對C^+，B^+和Na+的選擇性譜進(jìn)行了研究(圖4)。當(dāng)在細(xì)胞外存在10mMCa2+條件下記錄由三種同源物攜帶的CRAC電流時，全部三種同源物都在_80mV下產(chǎn)生大的內(nèi)向電流(圖4A)，并顯示相似的內(nèi)向整流I/V關(guān)系(圖4B和C)。當(dāng)除去細(xì)胞外Ca2+時，三種通道中的內(nèi)向電流都以相同的程度被抑制(圖4A-C)，這表明它們具有相似的高Ca2+選擇性，并且在Mg2+離子存在(2mM)時能區(qū)分Na+(discriminateagainstNa+)。還研究了CRACM同源物們對Ba2+離子的選擇性。圖4D顯示，等摩爾替換可大大降低CRACM1中的內(nèi)向電流，提示該蛋白質(zhì)能夠區(qū)分Ca2+離子和Ba2+(discriminateCa2+ionsagainstBa2+)。在過表達(dá)CRACM2或CRACM3的細(xì)胞中，當(dāng)使用Ba2+作為電荷載體時，仍然有顯著更多的內(nèi)向電流，這初看起來可能指示更高的Ba2+滲透。然而，因為Na+離子仍保留在細(xì)胞外溶液中，因此當(dāng)Ba2+存在時Na+也可能對內(nèi)向電流有貢獻(xiàn)。當(dāng)進(jìn)行與圖4D相同的實驗，但是進(jìn)一步用TEA代替N^時，經(jīng)由全部三種同源物的內(nèi)向電流現(xiàn)在均被基本上消除了(圖4E)，表明攜帶了圖4D所見的額外電流的可能是Na+離子而非B^+。為了進(jìn)一步評估CRACM通道的選擇性，在完全沒有任何二級陽離子并額外添加10mMEDTA以螯合任何殘余二價陽離子的條件下，評估在Na+滲透上可能存在的差異。在上述條件下，CRAC通道變成對Na+可滲透，典型地導(dǎo)致過表達(dá)CRACM1的HEK293細(xì)胞中的內(nèi)向電流增加2倍(圖4F)。在相同的實驗程序下，產(chǎn)生的CRACM2電流略微更大，而CRACM3產(chǎn)生顯著更大的單價電流，這再次提示，三種CRACM同源物對Na+離子顯示稍微不同的選擇性。實施例V:CRACM同源物的藥理學(xué)先前已發(fā)現(xiàn)2-APB可以以這樣的方式影響CRACM1通道在低濃度下(《5iiM)增強CRAC電流，而在高濃度下(>10iiM)則抑制之。CRACM1被50yM2-APB完全抑制(見圖4G)。然而，CRACM2對2-APB介導(dǎo)的抑制似乎不敏感得多，相同的濃度僅能使其電流降低大約50%。然而，對CRACM3觀察到的效果最引人注意它不被2-APB抑制，反而被其大大增強。實施例VI:CRACM3響應(yīng)2-APB的選擇性改變13用吸管溶液對過表達(dá)CRACM3的HEK293細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗制，其中Ca2+濃度被鉗制在150nM以防止鈣池耗竭，并額外含有50iiM2-APB以估計細(xì)胞內(nèi)施加2-APB時是否能夠激活通道。在這些條件下，沒有引發(fā)f丐池操縱性或2-APB誘發(fā)性電流，然而當(dāng)從外部施加50iiM2-APB時，很容易地激活了由CRACM3攜帶的CRAC電流(圖6A)。這可能提示2_APB的易化(facilitatory)效應(yīng)是通過蛋白質(zhì)的細(xì)胞外位點介導(dǎo)的；抑或2-APB在膜內(nèi)工作，但從細(xì)胞內(nèi)空間無法達(dá)到其作用位點。2-APB引發(fā)之電流的電流_電壓關(guān)系(圖6D)在正負(fù)膜電壓下均顯示出顯著的整流，反轉(zhuǎn)電位為+30mV，表明通道的選擇性發(fā)生了變化。正常情況下，CRAC電流具有高度的C^+選擇性，而對K+或Cs+的可滲透性低，導(dǎo)致正的反轉(zhuǎn)電位。然而，在細(xì)胞暴露于2-APB時，所觀察到的外向電流顯示出下列現(xiàn)象單價Cs+滲透的顯著增加；反轉(zhuǎn)電位的較大偏移。對此，在額外轉(zhuǎn)染了CRACM3的STM1表達(dá)細(xì)胞中進(jìn)行了更定量的評估，并且使用含Cs+或K+作為主要單價陽離子種類的細(xì)胞內(nèi)溶液測量了由IP3引發(fā)的CRAC電流。在這些條件下，觀察了在2-APB施加之前由IP3誘發(fā)性f丐池耗竭所導(dǎo)致的CRAC電流，這些電流的平均反轉(zhuǎn)電位為+100mV(n=4)。在基于Cst和K+-的溶液中施加2-APB均產(chǎn)生了大的外向電流，而且對于Cs+反轉(zhuǎn)電位遷移到+31mV(n=4)，對于K+反轉(zhuǎn)電位遷移到29mV。這些細(xì)胞中2-APB介導(dǎo)的電流的平均值大約是沒有STM1過表達(dá)時CRACM3電流的2倍。盡管2-APB遷移了CRAC電流的反轉(zhuǎn)電位，但是后者仍保持為正電位，這提示通道仍然保留著一些Ca2+滲透性，這與在完整細(xì)胞的fura-2測量中觀察到的Ca2+內(nèi)流是一致的。在離子替換實驗中研究了單價陽離子滲透性和二價陽離子的滲透性的相對關(guān)系，該實驗中將任何Ca2+從細(xì)胞外液中清除，或者用TEA替換Na+。如圖6C所示，在無Ca2+的細(xì)胞外溶液中施加2-APB后，與含Ca2+溶液相比，平均內(nèi)向電流降低了達(dá)53%，但是外相電流幾乎增至三倍。與此相伴隨的是，反轉(zhuǎn)電位從+94mV遷移到了+10mV。這可能提示，Ca2+負(fù)責(zé)內(nèi)向電流中相當(dāng)大的一部分，并且它還阻礙單價陽離子的向外移動。同時，似乎在2-APB的存在下，CRAC通道對Na+離子的滲透性顯著更高，因為通常情況下不含C的溶液可完全抑制任何經(jīng)由CRAC通道的內(nèi)向電流。相反地，通過用TEA+替換Na+從而將Na+從細(xì)胞外溶液中除去，對由50yM2-APB誘發(fā)的內(nèi)向或外向電流沒有顯著影響。把這些離子的離子濃度和化合價考慮在內(nèi)，CRAC通道對Ca"的滲透性仍然優(yōu)于對化+的滲透性。圖6G中對反轉(zhuǎn)電位的Goldman-Hodgkin-Katz分析得出，在無Ca2+條件下(藍(lán)色I(xiàn)/V，Erev=+10mV)，PNa/PCs的滲透性比=1.5，而PCa/PCs=50(紅色I(xiàn)/V，+30mV)，表明PCa/PNa比=33。顯然，2-APB導(dǎo)致CRAC通道選擇性急劇降低，因為通常，CRAC通道的特征PCa/PNa超過100倍。實施例VII:2-APB對CRACM1孔突變體的影響上面的結(jié)果證明，2-APB可改變CRAC通道的選擇性，而且可以想見，2_APB對CRACM3的門控機制關(guān)聯(lián)著選擇性濾器的放寬(wideningofselectivityfilter)，從而使得離子無需鈣池耗竭或者STM1相互作用即能夠滲透?？追艑挼某潭饶軌驔Q定2-APB對CRAC通道亞型的門控效力，其中CRACM3最敏感，CRACM1剛好能夠激活，而CRACM2的孔不能被2-APB充分放寬到容許離子在無STM1條件下通過。先前的工作已經(jīng)鑒定了跨膜結(jié)構(gòu)域TM1中的谷氨酸殘基E106和TM3中的E190是CRACM1孔選擇性的關(guān)鍵決定基。研究了具有改變的孔結(jié)構(gòu)的孔突變體及它們對2-APB的響應(yīng)。選擇了兩種CRACM114突變體(E106D和E190A)來研究2-APB敏感性。CRACM1的E106D突變體使正常的內(nèi)向整流通道轉(zhuǎn)變成外向整流，并將其反轉(zhuǎn)電位遷移到+16mV，但是其沒有組成性的通道活性，并且需要額外進(jìn)行STMI過表達(dá)和鈣池耗竭方能產(chǎn)生大的CRAC電流，這提示，單純改變孔的選擇性不會導(dǎo)致鈣池非依賴性的門控。僅表達(dá)CRACM1E106D突變體的HEK293沒有組成型CRAC電流，隨后用50yM2-APB剌激時產(chǎn)生了復(fù)雜的響應(yīng)，典型地是導(dǎo)致內(nèi)向電流的快速增加，隨后完全阻斷，在暫停2-APB施加后緩慢地再激活(圖7A)。在停止2-APB施加后，2-APB分子擴散開，局部濃度降低，從而CRAC通道能夠重新激活。在存在的情況下，重新激活電流的大小超過在僅表達(dá)CRACM1通道而沒有額外的STIM1過表達(dá)的細(xì)胞中通常見到的電流大小，表明這些電流是CRACM1的不依賴于鈣池及STIM1的門控作用的結(jié)果。重新激活電流的電流-電壓關(guān)系基本上呈線性，反轉(zhuǎn)電位為0mV(圖7B)，提示2-APB將E106D的反轉(zhuǎn)電位從+16mV進(jìn)一步向左遷移。還評估了同樣對CRAC通道選擇性重要的CRACM1E190殘基。當(dāng)這個殘基被突變成谷氨酰胺時(E190Q)，它將電流的反轉(zhuǎn)電位遷移到+50mV，iI/V曲線同時顯示內(nèi)向和外向整流。在來自SCID患者的C^+內(nèi)流缺陷的T細(xì)胞中，E190Q突變體恢復(fù)S0CE效力微弱，而E190A和E190D突變體則可完全恢復(fù)Ca2+內(nèi)流。圖7C顯示，當(dāng)E190A突變體與STM1共表達(dá)時，其在向細(xì)胞中灌注IP3時的響應(yīng)與野生型CRACM1相似。其在鈣池耗竭之后被快速激活，且其IA關(guān)系與野生型通道相似，顯示出強烈的內(nèi)向整流(圖7D)，盡管其反轉(zhuǎn)電位被遷移到+55mV，與E190Q突變體相似。因此，該突變體似乎具有一種中間型的表型，因為它也可改變CRACM1的選擇性，但是Cs+的向外轉(zhuǎn)運似乎顯著少于在E190Q突變體中所見。當(dāng)在CRAC電流完全活化之后將細(xì)胞暴露于50iiM2-APB時，該化合物引發(fā)了較大的易化(facilitation)隨后又是快速的抑制(圖7C)，在性質(zhì)上與野生型CRACM1相似，但是其易化作用更突出。經(jīng)過易化的電流的特征是外向電流更大，并導(dǎo)致反轉(zhuǎn)電位左移到+33mV(圖7D)，再次顯示2-APB可降低CRAC通道的選擇性。另外還分析了在僅表達(dá)E190A突變體而無STM1的野生型HEK293細(xì)胞中，2-APB對E190A突變體的影響。在這些實驗中，從吸管溶液不加HV并將[Ca2+]i緩沖保持在150nM以避免鈣池耗竭。這完全抑制了全細(xì)胞模式建成后的任何電流的發(fā)生(圖7E)。然而，施加50iiM2-APB導(dǎo)致了內(nèi)向和外向電流均發(fā)生大的瞬時增加，其I/V關(guān)系(圖7F)與在圖7D中觀察到的相似，其中2-APB易化了與STIM1共表達(dá)的f丐池操縱性E190A通道?？傊@些數(shù)據(jù)提示，野生型CRACM1通道大體上對2-APB的f丐池及STM1非依賴性門控作用具有抗性，但是殘基E106和E190的修飾，盡管不足以對該通道形成組成型的門控，但使得2-APB能夠進(jìn)一步修飾CRACM1的孔構(gòu)造，從而使通道以不依賴f丐池及STIM1的方式開放。這些結(jié)果還提示，在2-APB開始施加時形成的低2-APB濃度下更有利于這種門控模式，隨著膜中濃度的增加，可能轉(zhuǎn)變成不再允許離子轉(zhuǎn)運的狀態(tài)。這樣，2-APB能夠同時直接易化和抑制CRAC通道功能，而無需STM1的過表達(dá)。1權(quán)利要求一種用于確定CRACM1對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量所述細(xì)胞的Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和鈣內(nèi)流。2.權(quán)利要求1的測定法，其中Icrac活性的慢速鈣依賴性失活表明CRACM1對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。3.權(quán)利要求1的測定法，其中半最大激活時間(±s.e.m.)為35士7秒的激活動力學(xué)表明CRACM1對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。4.一種用于確定CRACM2對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量所述細(xì)胞的Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和鈣內(nèi)流。5.權(quán)利要求3的測定法，其中半最大激活時間(±s.e.m.)為21士3秒的激活動力學(xué)表明CRACM2對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。6.權(quán)利要求3的測定法，其中非鈣依賴性的失活表明CRACM2對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。7.—種用于確定CRACM3對細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量所述細(xì)胞Icrac活性的失活動力學(xué)、激活動力學(xué)和鈣內(nèi)流。8.權(quán)利要求6的測定法，其中半最大激活時間(±s.e.m.)為63士7秒的激活動力學(xué)表明CRACM3對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。9.權(quán)利要求6的測定法，其中測量失活動力學(xué)包括測量所述失活動力學(xué)的鈣依賴性。10.權(quán)利要求8的測定法，其中所述失活動力學(xué)的鈣依賴性表明CRACM3對所述細(xì)胞的Icrac活性有貢獻(xiàn)。11.一種用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量所述Icrac活性的離子選擇性。12.—種用于確定CRACM1、CRACM2和CRACM3對細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量在2-APB存在下的Icrac活性。13.權(quán)利要求12的測定法，其中在濃度》50iiM的2-APB的存在下Icrac電流的增強表明CRACM3對所述Icrac活性有貢獻(xiàn)。14.權(quán)利要求12的測定法，其中在濃度小于或等于5iiM2-APB的存在下Icrac電流的增強和在大于或等于10yM2-APB的存在下Icrac電流的抑制表明CRACM1對所述Icrac活性有貢獻(xiàn)。15.權(quán)利要求14的測定法，其中所述增強在沒有鈣池耗竭的條件下發(fā)生。16.—種用于確定CRACM1、CRACM2和/或CRACM3對細(xì)胞的Icrac活性的貢獻(xiàn)的測定法，包括測量Icrac活性的激活動力學(xué)、失活動力學(xué)、離子滲透、藥理學(xué)和離子選擇性，其中所述細(xì)胞來源于患有免疫缺陷疾病的受試者。全文摘要本發(fā)明提供了用于確定作為細(xì)胞內(nèi)Icrac活性的基礎(chǔ)的CRACM同源物的身份的方法和組合物。文檔編號G01N33/50GK101730846SQ200880017095公開日2010年6月9日申請日期2008年3月21日優(yōu)先權(quán)日2007年3月23日發(fā)明者安德烈亞·弗萊格,萊因霍爾德·彭納申請人:皇后醫(yī)學(xué)中心