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      納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法及應用的制作方法

      文檔序號:6146509閱讀:261來源:國知局

      專利名稱::納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法及應用的制作方法
      技術領域
      :本發(fā)明涉及-,中納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,本發(fā)明還涉及采用所述的糖基功能化分子印跡柱檢測樣木巾痕量細茼毒素的方法,屬于痕量細菌毒素檢測
      技術領域
      。
      背景技術
      :細菌毒素主要有三種外*索、內毒素和非蛋白毒素。外毒素是一種典型的水溶性蛋白,是細菌在指數牛長期分泌的己知可感染人類毒性最強的細菌毒素,在很低濃度時就具有很卨的毒性。隨著檢測方法和分析技術的發(fā)展,人們發(fā)現細菌毒素幾乎廣泛存在T所有的食品和飼料中。因此,開發(fā)-'種準確度高、特異性強、快速檢測細菌毒素的方法,對食物中毒、水污染等突發(fā)事故做出快速診斷,并選擇合適的應對措施,對于食品與環(huán)境控制以及國防安全都是十分重要的。細菌毒素的存在會威脅人類健康,造成社會經濟損失,因此,細菌毒素的預防、去毒、解毒,尤其是快速高靈敏度的檢測方法的建立顯得十分重要。細菌錄素的檢測分析方法主要有生物學方法,如動物測毒法和細胞測辨法;免疫學方法,如有反向被動血凝實驗(RPHA)、被動免疫溶血試驗(PIH)、毒素與抗毒素瓊脂擴散試驗、放射免疫測定(RIA)和酶聯免疫吸陽試驗(ELISA);分子生物學方法,如PCR法。這些檢測方法雖然靈敏度較高,穩(wěn)定性較好,但大多都有周期長,過程復雜,費時費力結果準確性等缺點。由于〗、多數細菌毒素的類似物較多、新發(fā)現的細菌毒素不斷增加、細菌毒素污染的普遍性和危,性被逐步認識等原因,對細菌毒素的快速高靈敏度分析方法也提出了更迫切和更高的耍求。目前,限制細菌毒素檢測研究的難點主要是結構相似物較多,交叉反應普遍;詢素檢測時較易受提取液中其它難f去除的T擾物質的影響等。針對3前細菌毒素危害性大、檢測閑難、不易預防等特點,尤其對商檢和衛(wèi)牛防疫部門來說,更需要有一個簡便、快速、靈敏的方法對細菌毒素進行檢測,對其潛在危害作出判斷,以促進經濟發(fā)展,保障人類健康。
      發(fā)明內容針對現有技術屮存在的不足,本發(fā)明提供了一種檢測速度快、靈敏度高的納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法。本發(fā)明還提供了采用所述的糖基功能化分了印跡柱檢測樣本中痕量細菌毒素的方法。本發(fā)明是通過以下技術方案實現的所述的納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟(1.)選擇能與細菌毒素合成糖某功能化分子印跡聚合物的糖類化合物功能單體;(2)將細菌毒素模板分子、糖類化合物功能單體、交聯劑、致孔劑、引發(fā)劑和仃機溶劑按一定摩爾比混合均勻制成糖基功能化分了印跡聚合物溶液;(3)選取納米材料,按照現有方法制備出納米溶液;(4)利用表面修飾技術,將納米材料和糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。所述細菌毒素模板分子、糖類化合物功能申.體、交聯劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機溶劑的摩爾比為o.i2:2,5:o,i5:40so:o.oio.io:i,oi5。所述糖類化合物功能單體為A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神經節(jié)-皆脂或神經酰胺—己糖苷;所述交聯劑為—羥甲基丙烷—甲基丙烯酸酯、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3,5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇三丙烯酸酯;所述引發(fā)劑為偶氮一異丁腈;所述致孔劑為二氯甲垸、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇、四氯化碳、N,N-二甲基酰胺或二甲基亞砜;所述有機溶劑為二氯甲烷或四氯化碳。所述納米溶液為碳納米管溶液、納米金溶液或納米鉑溶液。所述將納米材料和糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面包括以下步驟(1)選用長度為5-10cm,直徑為2-10mm的玻璃管柱,依次用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹T;(2)將制備的納米溶液超聲處理20-60min,得到分散的納米溶液;(3)將分散的納米溶液注入玻璃管柱內,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,浸泡5-10min,排出管內的納米溶液,將玻璃管柱在室溫下晾干;(4)向步驟(3)中晾千的玻璃管柱巾再注入糖基功能化分子印跡聚合物溶液,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,浸泡540min,然后將玻璃管柱中的分子印跡聚合物溶液排出,)1:]洗脫劑洗脫20-30min,室溫下千燥5-l.Omin;(5)重復歩驟(3)和歩驟(4)過程4-7次,制得所述糖基功能化分子印跡柱。為除去玻璃管柱內表面過量的糖基功能化分了-印跡聚合物,本發(fā)明所述的制備方法,還包括以下歩驟將糖基功能化分子印跡柱浸入pH6.8-7.2緩沖液中,保存在(C冰箱,1224h后使用。所述洗脫劑為乙腈、水、甲醇-乙酸混合液或乙S青-乙酸混合液。所述緩沖液為檸檬酸-磷酸溶液。本發(fā)明所述的檢測痕量細菌毒素的方法,是將按上述的任意--種方法制得的糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,將化學發(fā)光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的細菌毒素進行檢測。所述化學發(fā)光體系溶液為魯米諾溶液、光澤精溶液、N-溴代丁二酰亞胺溶液、Ce(IV)-S032—溶液、魯米諾-KM:n04溶液、魯米諾-11202溶液、異煙肼-NaC10溶液或NaI04-&02溶液。本發(fā)明的有益效果1、將納米材料的納米增效作用引入到分子印跡柱的制備當中,使得所制備的細菌毒素分子印跡柱具有更高的靈敏性和檢測范圍。2、將表面修飾技術應用到分子印跡柱的制備當中,使得納米增效的細菌毒素分了印跡柱的制備具有nj控性,提高了柱了的檢測靈敏度和準確性。3、本發(fā)明所得到的納米增效的痕量細菌毒素糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀用于檢測細齒毒素,可以實現樣本中細齒毒素的卨特異性、卨靈敏度、快速檢測。4、木發(fā)明的糖基功能化分子印跡柱的特異性強,樣品中其它非特異性分子對檢測結果無影響;靈敏度高,可以達到amol級;檢測速度快,完成--個基本檢測過程僅需l.min左右的時間,可在短時間內實現大量樣本的高通量篩選;成本低,檢測l個樣品僅需幾分錢。5、糖基功能化分了印跡柱檢測細菌錄素的方法,操作快速簡單,反應及結果均由儀器自動完成和記錄,避免了主觀因素的影響,并保證有很好的重復性,便于現場檢測。6、將化學發(fā)光體系溶液與分子印跡技術相結合用T細菌毒素檢測,既有生物傳感的專一識別性,又有化學傳感的機械穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性。圖1為納米材料和糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面的過程示意圖。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進-\歩說明。實施例1—種白喉毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟(1.)選擇能與白喉毒素合成糖某功能化分子印跡聚合物的功能單體;(2)碳納米管溶液制備在超盧攪拌的條件下,將2mg多壁碳納米管(Multi-walledcarbonnano加hes,MWCNTs)加入到lml二甲基亞砜溶液中,從『fi]獲得黑色懸濁液即MWCNTs溶液;(3)取制備好的MWCNTs溶液2()pl,超聲3()min,得到均勻分散的MWCNTs溶液;(4)模板分子白喉毒素,功能申.體A-D-吡喃糖基甘露糖,交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA),致孔劑氯仿,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲烷按摩爾比為o.i:2.5:().5:7():().()5:2.o混合均勻,得到白喉毒素糖棊功能化分子印跡聚合物溶液;(5)選用t^度為5cm,直徑為3mm的玻璃管柱,分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH淸洗,然后用雙蒸水徹底淸洗數次,吹干,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖l所示將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將MWCNTs溶液排出,在室溫下干燥10min,再將白喉毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將白喉毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面2()min,.宵至把這一S屮的模板分子白喉毒素完全洗掉,在室溫下干燥10mim再將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中,M滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將MWCNTs溶液排出,室溫下:「燥l()min,再將白喉fT素分了-印跡聚合物溶液汴入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5miti后將白喉毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面2()min,直至把這一層中的模板分子白喉毒素完全洗掉,在室溫下干燥10min。如此循環(huán),重復上述過程5次。(7)將l:述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液巾,保存在4°C的冰tM-118h,以便除去玻璃管柱內表面過量的白喉毒素糖基功能化分子印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后,制備成功納米增效白喉毒素分子印跡柱。將制備成功的O喉毒素分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,將濃度2.0X10-';mo1/L的魯米諾溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的白喉毒素進行檢測,結果見表丄。利用上述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾MWCNTs,制備白喉毒素糖基功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的白喉毒素進行檢測,結果見表l。從表1.巾結果可以看出MWCNTs修飾的白喉毒素糖基功能化分子印跡柱比普通白喉毒素糖基功能化分子印跡柱(未加M:WCNTs修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例2—種破傷風毒素糖基功能化分了印跡柱的制備方法,包括以下步驟(i)選抒能與破傷風毒素合成分子印跡聚合物的功能單休唾液酸神經節(jié)苷脂;(2)納米金溶液的制備取5()mL().()l%HAuCl4加熱至沸騰,迅速加入1mL1%檸檬酸鈉溶液還原,所制備亮玫紅色即納米金溶液,放入4"C冰箱保存?zhèn)溆茫?3)取制備好的納米金溶液2()pl,超聲2()min,得到均勻分散的納米金溶液;(4)模板分子破傷風毒素,功能單體唾液酸神經節(jié)苷脂,交聯劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,致孔劑二氯甲烷,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲烷按摩爾比0.5:2.5:3:45:o.i:5,混合均勻,得到破傷風毒素分子印跡聚合物溶液;(5)選用t^度為8cm,直徑為2mm的玻璃管柱,分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH淸洗,然后用雙蒸水徹底淸洗數次,吹干,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖1所示將納米金溶液注入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將納米金溶液排出,在室溫下干燥10min,再將破傷風毒素MI:Ps溶液注入玻璃管柱巾,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將破傷風毒素MIPs溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這-一層中的模板分子破傷風毒素完全洗掉,在室溫下千燥l()min,再將納米金溶液注入玻璃管柱屮,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將納米金溶液排出,室溫下干燥10mim再將破傷風毒素MIPs溶液注入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將破傷風辨素MIPs溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這-一層中的模板分子破傷風毒素完全洗掉,在室溫下千燥l()min。如此循環(huán),重復上述過程7次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH7.0的檸檬酸-磷酸緩沖液中,保存在4"C的冰箱中12h,以便除去玻璃管柱內表面過量的破傷風毒素分子印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后,制備成功納米增效破傷風毒素糖棊功能化分子印跡柱。將制備成功的納米增效破傷風毒素糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,采用光澤精化學發(fā)光體系,將光澤精溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的白喉毒素進行檢測,結果見表丄。利用上述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾納米金,制備破傷風毒素糖基功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的破傷風毒素進行檢測,結果見表1。從表1中結果可以看出納米金修飾的破傷風毒素糖基功能化分子印跡柱比普通破傷風毒素糖棊功能化分子印跡柱(未加納米金修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例3--種肉毒桿菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下歩驟(l)選擇能與肉毒桿菌毒素合成分子印跡聚合物的功能單體N-乙酰糖胺;(2)納米鉑溶液的制備取4ml5%的H2:PtCl6.6H20溶液被加入到340ml的雙蒸水巾,然后在80TTF邊攪拌邊加熱,加入60ml1%的檸檬酸鈉溶液以后,得到的溶液即納米鉑溶液在80士0.5E,保溫人約4小時,該過程通過吸附光譜記錄,當:PtC1/—的吸附帶消失的時候表明反應結束,即得到納米鉑溶液;(3)取制備好的納米鉑溶液20u1,超盧40mfn,得到均勻分散的納米鉑溶液;ei)模板分了肉毒樸菌毒素,功能單體N-乙酰糖胺,交聯劑N、N-亞甲基二丙烯酰胺,致孔劑甲醇,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲烷按摩爾比i:2,5:5:65:().()8:15,混合均勻,得到肉毒桿齒毒素分子印跡聚合物溶液;(5)選用長度為10cm,直徑為5mm的玻璃管柱,分別用Imol/LHNO^P1mol/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹千,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖l所示將納米鉑溶液注入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,l.Omin后將納米鉑溶液排出,在室溫FF燥l-()min,再將肉毒桿菌毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,lOmin后將肉毒桿菌毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min,直至把這一層中的模板分了肉毒桿菌毒素完全洗掉,在室溫下干燥iOmim再將納米鉑溶液汴入玻璃管柱中,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,l()min后將納米鉑溶液排出,室溫下千燥l()min,再將肉毒桿齒iij素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,10min后將肉毒桿菌毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min,直至把這-一層中的模板分子肉毒桿菌毒素完全洗掉,在室溫下干燥10min。如此循環(huán),重復上述過程7次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH7.2的檸檬酸-磷酸緩沖液中,保存在4°C的冰箱中2他,以便除去玻璃管柱內表面過量的肉力樸菌毒素分了印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底淸洗以后,制備成功肉毒桿菌毒素糖基功能化分子印跡柱。將制備成功的肉毒桿菌毒素糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,采用亞胺類化學發(fā)光體系,將N-溴代丁二酰亞胺(NBS)溶液(5.0X10-2mol/L)與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的肉毒桿茼毒素進行檢測,結果見表l。利用上述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾納米鉑,制備肉毒桿菌毒素糖禍功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的肉毒桿菌毒素進行檢測,結果見表l。從表i中結果可以看出納米鉑修飾的肉毒桿菌毒素糖基功能化糖基功能化分子印跡柱比普通肉毒桿菌毒素糖基功能化糖基功能化分子印跡柱(未加納米鉑修飾)具有更快的響應吋間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例4—種志賀氏毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟(1.)選擇能與忐賀氏毒素合成分子印跡聚合物的功能單體祌經酰胺三己糖苷;(2)納米鉑溶液的制備取4ml5%的H2PtCl66H20溶液被加入到340ml的雙蒸水中,然后在8(rC下邊攪拌邊加熱,加入6()ml1%的檸檬酸鈉溶液以后,得到的溶液即納米鉑溶液在80士0.5t:,保溫大約4小時,該過程通過吸附光譜記5b當PCle2—的吸附帶消失的時候表明反應結束,即得到納米鉑溶液;(3)取制備好的納米鉑溶液20u1,超聲40min,得到均勻分散的納米鉑溶液;(4)模板分子志賀氏毒素,功能申.體神經酰胺三己糖苷,夂聯劑3,5-二(丙烯酰胺)苯甲酸,致孔劑異丙醇,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲垸按摩爾比().8:2.5:i:8()::]2,混合均勻,得到忐賀氏毒素分子印跡聚合物溶液;(5)選用長度為10cm,直徑為10mm的玻璃管柱,分別用1mol/LHN03和1mo1/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹:「,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖i所示將納米鉑溶液fn入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,8mn后將納米鉑溶液排出,在室溫下千燥8min,再將志賀氏毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,lOmin后將志賀氏毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這一層中的模板分子志賀氏毒素完全洗掉,在室溫下干燥lOmin,再將納米鉑溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,l()min后將納米鉑溶液排出,室溫下千燥8min,再將忐賀氏毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,10mfn后將志賀氏毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這一層中的模板分了志賀氏毒素完全洗掉,在室溫下干燥iOmin。如此循環(huán),重復上述過程5次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH7.2的檸檬酸-磷酸緩沖液中,保存在4°C的冰箱中22h,以便除去玻璃管柱內表面過量的志賀氏毒素分子印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后,制備成功納米增效志賀氏毒素糖基功能化分子印跡柱。將制備成功的志賀氏毒素糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,釆用Ce(IV)作氧化劑的化學發(fā)光體系,將Ce(IV)-S032—溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析僅,溶液中Ce(IV)濃度為1,0X10—3mol/L,S032—濃度為3,0X10—4mol/L,對樣品中的志賀氏T^T右進行檢測,結果見表l。利用上述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾納米鉑,制各志賀氏毒素糖基功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的志賀氏毒素進行檢測,結果見表1。從表1中結果可以看出納米鉑修飾的志賀氏毒素糖基功能化分子印跡柱比普通忐賀氏lY索糖^」力能化分子印跡柱(未加納米鉑修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、史W的靈敏度和更低的檢測限。頭她例5--種中毒性休克毒素i糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下歩驟(l)選擇能與中毒性休克毒素1合成分子印跡聚合物的功能單體N-乙酰乳糖胺;(2)納米金溶液的制備取50mL0.01%HAuCl4加熱至沸騰,迅速加入1mL1%檸檬酸鈉溶液還原,所制備亮玫紅色即納米金溶液,放入4。C冰筘保存?zhèn)溆茫?3)取制備好的納米金溶液20u1,超聲50mfm得到均勻分散的納米金溶液;(4)按摩爾比().5:2.5:3:4.0:().()8:2.2稱取模板分子屮泰性休克毒素l.,功能單體N-乙酰乳糖胺,交聯劑季戊四醇-:丙烯酸酯,致孔劑二甲基亞砜,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲烷,混合均勻,得到中辨性休克毒素l分了印跡聚合物溶液;(5)選用長度為丄0cm,直徑為8mm的玻璃管柱,分別用丄mol/:LHN03和丄mol/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹千,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖1所示將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,lOmin后將納米金溶液排出,在室溫下千燥l()min,再將中毒性休克毒素1分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,10min后將中毒性休克毒素l分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,有至把這一S屮的模板分子中毒性休克毒素l完全洗掉,在室溫下干燥10mhi,再將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,l()min后將納米金溶液排出,室溫K'「燥l()min,再將中毒性休克毒素i分子印跡聚合物溶液汴入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,i0min后將中毒性休克毒素l分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這.'S中的模板分子中毒性休克毒素1完全洗掉,在室溫下干燥10min。如此循環(huán),重復k述過程6次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中,保存在4°C的冰箱中24h,以便除去玻璃管柱內表面過量的屮毒性休克毒素1分子印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后,制備成功納米增效中毒性休克毒素l糖基功能化分子印跡柱。將制各成功的中毒性休克毒素i糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,采用卨錳酸鉀(KMnO,;)作氧化劑的化學發(fā)光體系,將魯米諾-KMn04溶液(與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,魯米諾-KMn04溶液中魯米諾的濃度為1.0X10-3m0l/:L,KMn04的濃度為1.0X10-3mol/L,對樣品巾的巾毒性休克毒素1分子進行檢測,結果見表1。利j-tj....匕述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾納米金,制備屮毒性休克毒素l.糖基功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的中毒性休克毒素l進行檢測,結果見表l。從表i中結果可以看出納米金修飾的中毒性休克毒素i糖基功能化分子印跡柱比普通中毒性休克毒素1糖基功能化分子印跡柱(未加納米金修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例6—種鏈球菌致熱外毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟(1)選擇能與鏈球菌致熱外毒素分子合成分子印跡聚合物的功能單體N-乙酰糖胺;(2)碳納米管溶液的制備在超聲攪拌的條件下,將2mgM:WCNTs加入到iml二甲基亞砜溶液中,從而獲得黑色懸濁液即MWCNTs溶液;(3)取制備好的MWCNTs溶液20ul,超聲60min,得到均勻分散的MWCNTs溶液;(4)按摩爾比為2:2,5:4:60:0.03:15稱取模板分子鏈球菌致熱外毒素,功能單體N—乙酰糖胺,交聯劑二乙烯某苯(DVB),致孔劑二氯甲烷,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,W機溶劑二氯甲烷,混合均勻,得到鏈球菌致熱外毒素分子印跡聚合物溶液;(5)選用t^度為5cm,直徑為3mm的玻璃管柱,分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH淸洗,然后用雙蒸水徹底淸洗數次,吹干,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖1所示將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將MWCNTs溶液排出,在室溫下干燥10min,W將鏈球菌致熱外毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將鏈球茼致熱外毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min,直至把這--層屮的模板分子鏈球菌致熱外毒素完全洗掉,在室溫下千燥l()min,再將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5miti后將MWCNTs溶液排出,室溫下干燥l()min,再將鏈球菌致熱外毒素分了印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5miti后將鏈球菌致熱外毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面2()min,直至把這一層中的模板分子鏈球菌致熱外毒素完全洗掉,在室溫下干燥10min。如此循環(huán),重復上述過程5次。(7)將l:述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液巾,保存在4°C的冰筘巾24h,以便除去玻璃管柱內表面過量的鏈球菌致熱外毒素分子印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后,制備成功納米增效鏈球菌致熱外毒素糖基功能化分子印跡柱。將制備成功的納米增效鏈球菌致熱外錄素糖基功能化分了印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,采用過氧化氫(H202)作氧化劑的化學發(fā)光休系,將魯米諾-H202溶液(魯米諾2.5Xl(r2mol/L,H202:5.0X1()-5mol/L)與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的鏈球菌致熱外毒素進行檢測,結果見表1。利用l:述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾MWCNTs,制備鏈球菌致熱外毒素糖基功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的鏈球菌致熱外毒素進行檢測,結果見表l。從表1中結果可以看出MWCNTs修飾的鏈球菌致熱外毒素糖基功能化分子印跡柱比普通鏈球菌致熱外毒素糖基功能化分了印跡柱(未加MWCNTs修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范閨、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例7-f巾霍亂毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟(1.)選擇能與霍亂毒素合成分子印跡聚合物的功能申.體唾液酸神經節(jié)苷脂;(2)納米金溶液的制備取50mL0.01%HAuCl4加熱至沸騰,迅速加入ImL1%檸檬酸鈉溶液還原,所制備亮玫紅色即納米金溶液,放入4t;冰箱保存?zhèn)溆茫?3)取制備好的納米金溶液20ii1,超聲50min,得到均勻分散的納米金溶液;(4)按摩爾比o.2:2.5:2:so:o.oe:丄o稱取模板分子霍亂毒素,功能單休唾液酸神經節(jié)苷脂,交聯劑季戊M醇二丙烯酸酯,致孔劑N,N-二甲基酰胺,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲烷,混合均勻,得到霍亂毒素分子印跡聚合物溶液;(5)選用長度為5cm,直徑為3mm的玻璃管柱,分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹干,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖i所示將納米金溶液注入玻璃管柱屮填滿,將玻璃管柱兩端封閉,10min后將納米金溶液排出,在室溫下干燥10mim再將霍乩毐素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,l()min后將霍亂TlT右分了印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25mim直至把這--層中的模板分子霍亂毒素完全洗掉,在室溫下千燥l()min,再將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,10min后將納米金溶液排出,室溫下干燥10min,W將霍亂毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,l()min后將霍亂毒素分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這-一層中的模板分子霍亂毒素完全洗掉,在室溫--FF燥l()min。如此循環(huán),革:復上述過程7次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中,保存在(C的冰箱中12h,以便除去玻璃管柱內表面過量的霍亂辨素分了印跡聚合物,3玻璃管柱內表面用去離子水徹底淸洗以后,制各成功納米增效霍亂毒素糖基功能化分子印跡柱。將制備成功的納米^效fr亂毒素糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,采用碘酸鈉(Na從表1中結果可以看出納米金修飾的霍亂毒素糖基功能化分子印跡柱比普通霍亂毒素糖基功能化分了印跡柱(未加納米金修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范閨、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例8-f巾綠膿桿菌外毒素a糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟(1.)選擇能與綠膿桿菌外毒素a合成分子印跡聚合物的功能申.體神經酰胺三己糖苷;(2)碳納米管溶液的制備在超聲攪拌的條件下,將2mgMWCNTs加入到lml二甲基亞砜溶液中,從而獲得黑色懸濁液即MWCNTs溶液;(4)按摩爾比().s:2.5:3:4():().i:1.5稱取模板分子綠膿桿菌外毒素a,功能單體神經酰胺三己糖—ff,交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯,致孔劑四氯化碳,引發(fā)劑偶氮二異丁腈,有機溶劑二氯甲烷,混合均勻,得到綠膿桿菌外毒素a分子印跡聚合物溶液;(5)選用長度為5cm,直徑為3mm的玻璃管柱,分別用lmol/LHN03和1mol/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹十,保證玻璃管柱內表面光亮無雜質;(6)如圖i所示將M:WCNTs溶液汴入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將MWCNTs溶液排出,在室溫下千燥1()min,再將綠膿桿菌外毒素a分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將綠膿桿菌外毒素a分子印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min,直至把這一層中的模板分子綠膿桿菌外毒素a完全洗掉,在室溫下干燥lOmin,再將M:WCNTs溶液注入玻璃管柱屮填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將MWCNTs溶液排出,室溫下千燥10mim再將綠膿桿菌外毒素a分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿,將玻璃管柱兩端封閉,5min后將綠膿桿菌外毒素a分了印跡聚合物溶液排出,用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20mim直至把這--------層中的模板分子綠膿桿菌外毒素a完全洗掉,在室溫下千燥l()min。如此循環(huán),重復上述過程5次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中,保存在4"C的冰箱中18h,以便除去玻璃管柱內表面過量的綠膿桿茼外毒素a分子印跡聚合物,當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后,制備成功納米增效綠膿桿菌外毒素a糖基功能化分子印跡柱。將制備成功的納米增效綠膿桿菌外毒素a糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,采用次氯酸鈉(NaC10)化學發(fā)光體系,將異煙肼-NaC10溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的白喉毒素進行檢測,結果見表丄。利用上述同樣方法,但玻璃管柱內表面未修飾MWCNTs,制備綠膿桿菌外毒素a糖基功能化分子印跡柱,連接到化學發(fā)光分析儀,對樣品中的綠膿桿菌外毒素a進行檢測,結果見表l。從表1中結果可以看出MWCNTs修飾的綠膿桿菌外毒素a糖基功能化分子印跡柱比普通綠膿桿菌外毒素a糖棊功能化分子印跡柱(未加MWCNTs修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。表1本發(fā)明納米增效糖基功能化細菌毒素分了印跡柱與普通細菌毒素分了印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求一種納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,其特征在于包括以下步驟(1)選擇能與細菌毒素合成糖基功能化分子印跡聚合物的糖類化合物功能單體;(2)將細菌毒素模板分子、糖類化合物功能單體、交聯劑、致孔劑、引發(fā)劑和有機溶劑按一定摩爾比混合均勻制成糖基功能化分子印跡聚合物溶液;(3)選取納米材料,按照現有方法制備納米溶液;(4)利用表面修飾技術,將納米材料和糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。2.根據權利要求i所述的制備方法,其特征在于所述細菌毒素模板分子、糖類化合物功能單體、交聯劑、致孔劑、弓l發(fā)劑和有機溶劑的摩爾比為().i2:2.5:(u5:4080:o.oio.io:i.oi5。3.根據權利要求1或2所述的制備方法,其特征在于所述糖類化合物功能申.體為A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液酸神經節(jié)苷脂或神經酰胺三己糖苷;所述交聯劑為三羥甲棊丙烷三甲某丙烯酸酯、N、N-亞甲某二丙烯酰胺、3,5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇-:丙烯酸酯;所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈;所述致孔劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇、四氯化碳、N,N-二甲基酰胺或二甲基亞砜;所述有機溶劑為二氯甲烷或四氯化碳。4.根據權利要求1或2所述的制備方法,其特征在于所述納米溶液為碳納米管溶液、納米金溶液或納米鉑溶液。5.根據權利要求1或2所述的制備方法,其特征在于所述將納米材料和糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面包括以下步驟(1)選用長度為5-1—()cm,.宵徑為2-1—()mm的玻璃管柱,依次jlj1—mol/LHN03和lmol/LNaOH清洗,然后用雙蒸水徹底清洗數次,吹干;(2)將制備的納米溶液超聲處理20-6()min,得到分散的納米溶液;(3)將分散的納米溶液注入玻璃管柱內,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,浸泡5-l()min,排出管內的納米溶液,將玻璃管柱在室溫——F晾千;(4)向步驟(3)中晾干的玻璃管柱中再注入糖基功能化分子印跡聚合物溶液,填滿,將玻璃管柱兩端封閉,浸泡5-l()min,然后將玻璃管柱巾的分子印跡聚合物溶液排出,用洗脫劑洗脫20-30min,室溫下干燥5-10min;(5)S復步驟(3)和歩驟(4)過程4-7次,制得所述糖某功能化分子印跡柱。6.根據權利要求5所述的制備方法,其特征在于還包括以下歩驟將糖基功能化分了印跡柱浸入pH6.8-7.2緩沖液中,保存在4t:冰箱,122他后使用。7.根據權利要求5所述的制備方法,其特征在于所述洗脫劑為乙腈、水、甲醇-乙酸混合液或乙腈-乙酸混合液。8.根據權利耍求6所述的制備方法,其特征在T:所述緩沖液為檸檬酸-磷酸溶液。9.一種檢測痕S細菌毒素的方法,其特征在于將按權利要求1至8所述的任意一種方法制得的糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,將化學發(fā)光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品屮的細菌7^吉進行檢測。10.根據權利要求9所述的檢測痕量細菌毒素的方法,其特征在于所述化學發(fā)光體系溶液為魯米諾溶液、光澤精溶液、N-溴代丁二酰亞胺溶液、Ce(IV)-S032—溶液、魯米諾-KMn04溶液、魯米諾-H202溶液、異煙肼-NaCIO溶液或Nal04-H202溶液。全文摘要本發(fā)明涉及一種納米增效的細菌毒素糖基功能化分子印跡柱的制備方法,包括以下步驟選擇能與細菌毒素合成糖基功能化分子印跡聚合物的糖類化合物功能單體;制備糖基功能化分子印跡聚合物溶液;制備納米溶液;將納米材料和糖基功能化分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。本發(fā)明所述的檢測痕量細菌毒素的方法,是將按上述方法制備的糖基功能化分子印跡柱連接到化學發(fā)光分析儀,將化學發(fā)光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發(fā)光分析儀,對樣品中的細菌毒素進行檢測。本發(fā)明的制備方法具有可控性,提高了柱子的靈敏度和準確性;所制備的分子印跡柱特異性強,靈敏度高,檢測速度快,可在短時間內實現大量樣本的高通量篩選,減少了檢測成本。文檔編號G01N21/76GK101692046SQ200910018458公開日2010年4月7日申請日期2009年9月29日優(yōu)先權日2009年9月29日發(fā)明者于京華,孫納新,宋曉妍,張秀明,朱晗,林青,汪世華,葛慎光,袁靚,裴梅山,賀曉蕊,邢憲榮,黃加棟申請人:濟南大學
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