專利名稱：一種高爾基蛋白gp73的夾心elisa定量檢測方法及其檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝癌早期診斷血清標志物的一種免疫學檢測方法，具體涉及一種高爾 基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法及其檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
肝臟是人體最大的器官，肝臟疾病也是發(fā)病率和死亡率最高的疾病。由于肝臟具 有很強的代償能力，部分損傷往往無臨床表現(xiàn)，導致肝臟疾病潛伏性強，待有臨床表現(xiàn)時， 已經(jīng)是肝病晚期，難以有效治療。目前，能夠在臨床上開展的肝功能試驗種類繁多，但是每 一種試驗只能探查肝臟的某一方面的某一種功能，到現(xiàn)在為止仍然沒有能反映肝臟的大部 分功能的指標，因而，往往引起漏檢。目前肝癌治療最有效的手段是手術(shù)切除，但由于缺乏 早期診斷手段，其治療的效果并不理想，65%的肝癌患者發(fā)現(xiàn)并確診時，病情已經(jīng)晚期，失 去了根治手術(shù)的時機，約80%的患者在診斷后很快就死亡，因此肝癌的生存率非常低，這主 要是因為目前尚缺乏有效的早期診斷手段。目前對于肝臟疾病的診斷主要依靠肝功能檢測。臨床應用較為廣泛的肝功能指標 有①反映肝細胞蛋白合成代謝功能的指標總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)。 ②反映肝細胞有無受損及嚴重程度的指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AIJT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、腺苷脫 氨酶(ADA)、膽堿酯酶(ChE)、乳酸脫氫酶(LDH)等。③反映肝臟膽排泄、分泌及解毒功能的 指標總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、總膽酸(TBA)、血氨(NH)。④對診斷膽汁淤積 指示酶(包括同工酶)有幫助的酶堿性磷酸酶(ALP)、r.谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、5_核苷酸 酶(5-NT)。⑤反映肝臟間質(zhì)成分增生(肝纖維化和肝硬化)的指標III型前膠原氨基端 肽(PIIIP)、III型原膠原(PCIII)、IV型膠原c端原肽(CIV/PC)；層黏蛋白(LN)；透明質(zhì) 酸(HA)。⑥對肝腫瘤診斷有意義的血清標志物甲胎蛋白(AFP)。然而現(xiàn)行的種種肝功能試驗只能反映肝功能的一個側(cè)面，并不能反映肝功能改變 的全貌，到目前為止，仍缺乏令人滿意的有效診斷肝臟疾病的早期檢測手段。因此，本領(lǐng)域 迫切需要開發(fā)一種新的有效檢測肝臟異常的方法。GP73，又名Golml或Golph2，是主要定位在高爾基體上一種蛋白質(zhì)，是一個II型 跨膜蛋白，具有5個糖基化位點，分子量約45KD，糖基化后約為73KD，其在GeneBank中的序 列號為51280。該蛋白基因序列保守，從兩棲類到靈長類，都有其同源蛋白，功能相當保守， 在正常人肝臟組織表達量很低，而有肝臟疾患的病人肝臟中卻大量表達。國外的相關(guān)研究 認為，GP73在肝癌患者體內(nèi)表達量會很高，而病毒性肝炎，肝硬化、肝損傷患者與健康人的 GP73含量比較低，所以將其作為肝癌早期診斷標志物；目前只有免疫印跡檢測GP73的方 法，還沒有酶聯(lián)免疫法檢測GP73 ；免疫印跡方法操作繁瑣，靈敏度和特異性都沒有酶聯(lián)免 疫法高。而在我們的研究中顯示，病毒性肝炎，肝硬化和肝損傷患者的SGP73含量也明顯高 于正常人，因此提出將GP73作為肝臟異常的標志物。根據(jù)發(fā)明人所進行的資料檢索，國內(nèi)外尚無其他有關(guān)檢測GP73雙單抗夾心ELISA方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種快捷、靈敏、穩(wěn)定的GP73定量檢測方法，以彌補 現(xiàn)有技術(shù)的不足。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法采用兩株 針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，通過底物顯色 檢測GP73，通過標準品制備的標準曲線確定GP73的含量。優(yōu)選的，所述的針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體之一識別的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的序列。優(yōu)選的，所述的針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體之一識別的蛋白質(zhì)的 氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的序列。本發(fā)明獲得的識別SEQ ID NO 1的單克隆抗體有三株，分別命名為1F2，1A6和 5F10 ；識別SEQ ID NO 2的單克隆抗體有兩株，分別命名為5B12和9D2。通過配對實驗，選 擇出適合夾心 ELISA 檢測 GP73 的最佳 HiAb1-HiAb2 配對有 5B12-5F10 ；5B12-1A6 ；5F10-1A6。所述的包被抗體HiAb1的濃度為1 5 μ g/mL。所述的檢測抗體HiAb2的濃度為5 10 μ g/mL，所述檢測抗體的稀釋液為磷酸鹽緩 沖液，磷酸鹽緩沖液含體積百分比濃度為5%的小牛血清，質(zhì)量百分比濃度為1 3%的聚 乙二醇(PEG)和體積百分比濃度為0. 1 0. 5%的吐溫20 (Tween20)。所述的檢測抗體為標記辣根過氧化物酶HRP的抗體。所述的底物顯色劑為3，3' 5,5' _四甲基聯(lián)苯胺(TMB)單組分顯色液。具體來說，本發(fā)明的GP73的夾心ELISA定量檢測方法采用針對GP73胞膜外區(qū)不 同表位的單克隆抗體(HiAb1)替代一株mAb與兔多抗的搭配，采用HRP-HiAb2替代兔多抗及同 HRP-羊抗兔抗體的結(jié)合反應；制備了多株可識別GP73胞膜外區(qū)不同表位的mAb，并通過交 叉配對選擇出可用于夾心ELISA的最佳搭配，然后對工作條件進行了優(yōu)化，通過簡化的實 施步驟測得標本GP73水平。其中包被抗體為HiAb1，檢測抗體是HRP標記的HiAb2株。優(yōu)化的工作條件是①包被的HiAb1的工作濃度為5 μ g/mL ；②標準品為GP73融合蛋白，標準品的最高工作濃度約為0. 1 μ g/mL，倍比稀釋11 個濃度梯度，空白對照用樣本稀釋液。③HRP-HiAb2 的稀釋液為3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS，最佳工作濃度為 IOug/ HiL(按照mAb5F10的量計算)，PEG為質(zhì)量百分比濃度，Tween20是體積百分比濃度。④底物顯色TMB-H2O2單組分顯色液所簡化的實施步驟是①用包被液稀釋包被HiAb1，加入96孔酶標板，100 μ L/孔，保濕，4度過夜；其中，包 被液為ΡΗ9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液。②用洗滌液洗板3次，加入工作濃度的封閉液，37度孵育2h ；其中，以含0. 1 %的 Tween20的PBS作為洗滌液。
③用洗滌液洗板3次，加入工作濃度標準品GP73融合蛋白和待測標本，100 μ L/ 孔，37度孵育Ih;④洗板3次，加入工作濃度的HRP-mAb2，100 μ L/孔，37度孵育Ih ；⑤洗板3次，以TMB底物顯色，100 μ L/孔，室溫避光顯色IOmin ；⑥IM H2SO4終止；測定0D450nm的吸光值A(chǔ) ；⑦以標準品的A值和相應濃度制作標準曲線，將待測標本的A值與標準曲線相比， 計算待測標本的GP73含量。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測試劑 盒，該試劑盒包括包被抗體和檢測抗體、封閉液、顯色劑、終止液、洗滌液、標準品，所述包 被抗體和所述檢測抗體為兩株針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體，所述標準品為 GP73蛋白。優(yōu)選的，所述檢測抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，所述顯色劑為3， 3' 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)單組分顯色液。所述的封閉液為含5%的小牛血清，0. 1% 吐溫20 (Tween20)和0.01%防腐劑的磷酸鹽緩沖液。其中，防腐劑為prOCline300。優(yōu)選的，夾心ELISA 檢測 GP73 的最佳 HiAb1-HiAb2 配對為 5B12-5F10 ；5B12-1A6 ； 5F10-1A6。本發(fā)明的GP73的夾心ELISA定量檢測方法提高了檢測GP73的靈敏度和特異性， 有良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，縮短了操作時間，降低了成本，并且通過制備了多株針對GP73 不同位點的單克隆抗體，并進行了配對實驗，提供了靈敏度和特異性都較高的雙單抗夾心 ELISA檢測GP73試劑盒。


圖1是本發(fā)明的GP73蛋白結(jié)構(gòu)模式圖，單克隆抗體1F2，1A6，5F10識別IV區(qū)，5B12 和9D2識別V區(qū)；圖2是本發(fā)明用5B12-5F10配對夾心ELISA檢測GP73得到的標準曲線的一個優(yōu) 選實施例；圖3是用本發(fā)明用5B12-5F10配對方法結(jié)合本發(fā)明的試劑盒檢測不同肝病、非肝 病患者和正常人血清GP73含量的一個優(yōu)選實施例的檢測結(jié)果。圖4是根據(jù)圖3的數(shù)據(jù)對不同肝病、非肝病患者和正常人血清GP73含量的柱狀分 布圖，同時對不同組別進行了比較。
具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的具體實施例。需要說明的 是，在本發(fā)明中所用到單抗只是發(fā)明人所列舉的配對較好的抗體，只要用到GP73不同表位 的單抗配對夾心檢測都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，而且本發(fā)明中的標記方法也不局限于所 列舉的酶標法，只要起到放大顯色的作用，則都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。實施例1本發(fā)明中涉及多個可選單抗，這些單抗的識別位點可見圖1，圖1是本發(fā)明的GP73 蛋白結(jié)構(gòu)模式圖，發(fā)明人篩選得到的單克隆抗體1F2，1A6，5F10識別IV區(qū)，5B12和9D2識別V區(qū)。本發(fā)明的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法中可以選擇3組配對單抗， 分別為5B12-5F10 ；5B12-1A6 ；5F10-1A6。選擇其中的一個配對實施例如下，其中，包被抗體 HiAb1 為 5B12，檢測抗體 HiAb2 是 HRP 標記的 5F10，即 HRP-5F10。①用PH9. 6,0. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋包被抗體5B12，其工作 濃度為lug/mL，加入96孔酶標板，100 μ L/孔，保濕，4度過夜；②用洗滌液洗板3次，加入工作濃度的封閉液，37度孵育2h ；③用洗滌液洗板3次，加入工作濃度標準品GP73融合蛋白和待測血清標本， 100 μ L/孔，37度孵育Ih ；④洗板3次，以3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS作為HRP-5F10的稀釋液，加入 HRP-5F10,使其工作濃度為5 μ g/mL，100 μ L/孔，37度孵育1h ；⑤洗板3次，以TMB底物顯色，100 μ L/孔，室溫避光顯色IOmin ；⑥IM H2SO4終止；測定0D450nm的吸光值A(chǔ) ；⑦以標準品的A值和相應濃度制作標準曲線，將待測標本的A值與標準曲線相比， 計算待測標本的GP73含量。標準品為GP73融合蛋白，標準品的最高工作濃度約為0. 1 μ g/mL，倍比稀釋11個 濃度梯度，空白對照用樣本稀釋液，以標準品的吸光值A(chǔ)和相應濃度制作標準曲線，將待 測標本的吸光值A(chǔ)與標準曲線相比，計算待測標本的GP73含量。見圖2，圖2是本發(fā)明用 5B12-5F10配對夾心ELISA檢測GP73得到的標準曲線，該標準曲線為y = 0. 1277x+0. 1137， R2 = 0. 9995 ；說明這一組單抗配對線性范圍比較好，最低可檢測到lng/ml。在另一個實施例中，包被抗體5B12的工作濃度為5 μ g/mL，檢測抗體的工作濃度 為 10 μ g/mLo在另一個實施例中，包被抗體5B12的工作濃度為2 μ g/mL,檢測抗體的工作濃度 為 8 μ g/mL。實施例2本發(fā)明的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測試劑盒的一個優(yōu)選實施例包 括包被抗體和檢測抗體、封閉液、包被液、稀釋液、顯色劑、終止液、洗滌液和標準品，包被 抗體和檢測抗體為兩株針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體，標準品為原核表達純 化的GP73全長蛋白。檢測抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體，所述顯色劑為3， 3' 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)單組分顯色液。封閉液為含5%的小牛血清，0.1%吐溫 20 (Tween20)和0. 01 %防腐劑prOCline300的磷酸鹽緩沖液。包被抗體和檢測抗體為兩株 針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體，其識別的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO=I 和SEQ IDNO :2。以原核表達純化的GP73融合蛋白作為標準品。包被液為PH9. 6，0. 05mol/ L的碳酸鹽緩沖液、稀釋液為磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液含質(zhì)量百分比濃度為1 3% 的聚乙二醇(PEG)和體積百分比濃度為0. 1 0. 5%的吐溫20(Tween20)，終止液為硫酸， 洗滌液為含0. 1% Tween20的磷酸鹽緩沖液。選擇5B12-5F10配對組裝的試劑盒為一個實施例，其使用的具體步驟如下①用包被液稀釋包被HiAb1 5B12，其工作濃度為2yg/mL，加入96孔酶標板， 100 μ L/孔，保濕，4度過夜；
②用洗滌液洗板3次，加入工作濃度的封閉液，37度孵育2h ；③用洗滌液洗板3次，加入工作濃度標準品GP73融合蛋白和待測標本，100 u L/ 孔，37度孵育lh;④洗板3次，以3 % PEG-0. 1 % Tween20_PBS作為HRP-5F10的稀釋液，加入 HRP-5F10,使其工作濃度為8 u g/mL，100 u L/孔，37度孵育lh ；⑤洗板3次，以TMB底物顯色，100 u L/孔，室溫避光顯色lOmin ；
⑥終止液終止；測定0D450nm的吸光值A(chǔ) ；⑦以標準品的A值和相應濃度制作標準曲線，將待測標本的A值與標準曲線相比， 計算待測標本的GP73含量。標準品為GP73融合蛋白，標準品的最高工作濃度約為0. 1 u g/mL，倍比稀釋11個 濃度梯度，空白對照用樣本稀釋液，以標準品的吸光值A(chǔ)和相應蛋白濃度制作標準曲線，將 待測標本的吸光值A(chǔ)與標準曲線相比，計算待測標本的GP73含量。實施例3利用實施例2所述的方法，對血清樣本的GP73含量(SGP73)進行了測定，樣本包 括健康人(70份)；非肝臟病人(131份)；肝炎病人(57份)；肝硬化病人(60份)；肝癌病 人(28份)。具體結(jié)果見圖3，肝炎病人SGP73為110. 83 士60. 33ng/mL，肝硬化病人SGP73 含量為124. 22 士 51. 28ng/mL，肝癌病人SGP73含量為135. 72 士 59. 21ng/mL，所有肝病病人 的 SGP73 含量為 121. 18 士 56. 9ng/mL ；非肝病病人 SGP73 含量為 62. 80 士 34. 91ng/mL，健康 人SGP73含量為53. 45 士 17. 07ng/mL。圖4是根據(jù)圖3的數(shù)據(jù)對不同肝病、非肝病患者和正 常人SGP73含量的柱狀分布圖，同時對不同組別進行了比較。圖4的數(shù)據(jù)說明了肝炎、肝硬 化、肝癌以及所有肝病病人SGP73含量明顯高于健康人和非肝病病人(P < 0. 001)；肝炎， 肝硬化和肝癌病人的SGP73含量沒有差異(P>0.05)；健康人和非肝病病人之間也無差異 (P > 0. 05)。最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當 理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)
和范圍。
序列表
<120> 一種高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法及其檢測試劑盒
<160>2
<210>1
<211>143
<212>PRT
<213>GP-73
<400>1
Pro Gin ProArgLeuGin Ala AlaGlyLeuPro His Thr GluVal Pro
1510
Gin Gly LysGlyAsnVal Leu GlyAsnSerLys Ser Gin ThrPro Ala
202530
Pro SerSerGluValVal LeuAspSerLysArgGinValGluLysGlu
354045
Glu ThrAsnGlulieGin ValValAsnGluGluProGinArgAspArg
505560
Leu ProGinGluProGly ArgGluGinValValGluAspArgProVal
657075
Gly GlyArgGlyPheGly GlyAlaGlyGluLeuGlyGinThrProGin
859095
Val GinAlaAlaLeuSer ValSerGinGluAsnProGluMetGluGly
100105110
Pro GluArgAspGinLeu VallieProAspGlyGinGluGluGluGin
115120125
Glu AlaAlaGlyGluGly ArgAsnGinGinLysLeuArgGlyGlu
130135140
<210>1
<211>53
<212>PRT
<213>GP--73
<400>2
Asp AspTyrAsnMetAsp GluAsnGluAlaGluSerGluThrAspLys
151015
Gin AlaAlaLeuAlaGly AsnAspArg AsnlieAspValPheAsnVal
202530
Glu AspGinLysArgAsp ThrlieAsnLeuLeuAspGinArgGluLys
354045
Arg AsnHisThrLeu
50
權(quán)利要求
一種高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于，用兩株針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，通過底物顯色檢測GP73，通過標準品制備的標準曲線確定GP73的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于， 所述的針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體識別的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于， 所述的針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體識別的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于， 所述的包被抗體的濃度為1 5 μ g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于， 所述的檢測抗體的濃度為5 10 μ g/mL，所述檢測抗體的稀釋液為磷酸鹽緩沖液，所述磷 酸鹽緩沖液含體積百分比濃度為5%的小牛血清，質(zhì)量百分比濃度為1 3%的聚乙二醇 (PEG)和體積百分比濃度為0. 1 0. 5%的吐溫20 (Tween20)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于， 所述的檢測抗體為辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于， 所述的HRP標記的底物顯色試劑為3，3' 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)單組分顯色液。
8.一種高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測試劑盒，包括包被抗體和檢測抗體、包 被液、封閉液、樣品稀釋液、顯色劑、終止液、洗滌液和標準品，其特征在于，所述包被抗體和 所述檢測抗體為針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體，所述標準品為GP73蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測試劑盒，其特征在 于，所述的封閉液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液含體積百分比濃度為5%的小牛血 清、體積百分比濃度為0. 的吐溫20(Tween20)和體積百分比濃度為0.01%的防腐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測試劑盒，其特征 在于，所述的洗滌液為磷酸鹽緩沖液，所述磷酸鹽緩沖液含體積百分比濃度為0. 的吐溫 20(Tween20)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測方法，用兩株針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體分別作為包被抗體和檢測抗體，通過底物顯色和標準曲線檢測GP73的含量。本發(fā)明的GP73的夾心ELISA定量檢測試劑盒包括包被抗體和檢測抗體、封閉液、洗滌緩沖液、顯色試劑、終止液和標準品，包被抗體和檢測抗體為兩株針對GP73胞膜外區(qū)不同表位的單克隆抗體，其識別的蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本發(fā)明的GP73的夾心ELISA定量檢測方法和檢測試劑盒提高了檢測GP73的靈敏度和特異性，有良好的穩(wěn)定性和再現(xiàn)性，縮短了操作時間，降低了成本。
文檔編號G01N33/68GK101988926SQ20091004162
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月3日
發(fā)明者古艷麗, 彭濤 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院