專利名稱：檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的elisa試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)抗體的ELISA試劑盒，屬于 獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域。用于豬圓環(huán)病毒2的抗體檢測，以此判斷豬群中圓環(huán)病毒 2型感染情況以及對該病的流行情況以及免疫效果進(jìn)行監(jiān)測。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus 2， PCV2)與豬群中發(fā)生的許多疾病 密切相關(guān)，諸如斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post weaning multisystem wasting syndrome, PMWS)豬皮炎腎炎綜合癥(Porcine dermatitis and n印hropathy syndrome, PDNS)、母豬繁殖障礙、增生性腸炎、仔豬先天性震顫、 豬呼吸道病綜合征等，我們將由PCV2引起的多種病癥統(tǒng)稱為PCVD (porcine circovirus disease, PCVD)，在諸多PCVD中，以PMWS最為常見，P麗S的主要引 起豬漸進(jìn)性消痩、腹瀉、呼吸道癥狀、皮膚蒼白或出現(xiàn)黃疸、生產(chǎn)性能降低。 PCV2除了本身引起豬病外，因侵害豬的免疫系統(tǒng)，抑制豬的免疫功能，還能與 豬藍(lán)耳病、豬流感、豬支原體肺炎、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌病等常見豬疫病 病原相互作用，加重這些病的危害。目前PCV2已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，給 養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
PCV2的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要包括病理組織學(xué)檢測、病毒的分離與鑒定、 PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、原位雜交(ISH)、免疫組化法(IHC)等，但這些 方法主要用于檢測病原，且對試驗(yàn)條件和技術(shù)要求較高。
近年來，國內(nèi)外不少科研單位建立了檢測PCV2抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)，該方法具有操作簡單、敏感性高、快速、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合于大規(guī)模血清樣品的檢測。而目前用于檢査PCV2抗體的ELISA方法主要是 間接法，該方法的缺點(diǎn)是血清中所含的高濃度的非特異性抗體可直接吸附到固 相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面，從而導(dǎo)致本底較高或者可能出現(xiàn) 假陽性的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種依據(jù)
雙抗原夾心ELISA的原理而研制的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒， 用于豬圓環(huán)病毒2型抗體的檢測。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是 一種檢測豬圓環(huán)病 毒2型抗體的ELISA試劑盒，所述試劑盒依雙抗原夾心ELISA原理研制而成， 包括
a. ELISA板條每個試劑盒包含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含可拆 卸的已包被檢測抗原的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔X 12條；該包被抗原是依 據(jù)GenBank中PCV2的基因序列(登錄號AY943819)，設(shè)計(jì)兩條引物，上游 引物為GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC ; 下游引物為 GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC:通過PCR的方法從豬PCV2基因組中擴(kuò) 增不含核定位信號的C鄰基因，將其克隆到pET32-a(+)原核表達(dá)載體中，構(gòu)建 pET32a-Cap重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，參照Novagen公 司pET Syetem Manual表達(dá)重組Cap融合蛋白，用親和層析法純化表達(dá)的融合 蛋白制得；
b. 洗滌液10倍濃縮的pH為7. 4的含0. 5% (體積百分比)吐溫-20的 1M PBS溶液200ml;
c. IOO倍濃縮的酶標(biāo)抗原500ul:將上述純化的Cap融合蛋白用豬源腸激酶酶切去掉融合部分，并再次使用親和層析柱純化獲得不含核內(nèi)化信號肽的
Cap蛋白，并用超濾管將其濃縮至2.0mg/ml，并采用改良過碘酸鈉法將辣根過 氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上；
d. 酶標(biāo)稀釋液pH為7.4的0. 1M PBS溶液50ml;
e. 底物顯色液50ml:稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，用100ml無水乙醇或DMSO 溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配置顯色液A;稱取9.33g檸檬酸，14.6g 磷酸氫二鈉，加入0. 75%(質(zhì)量體積比)過氧化氫尿素6. 4ml，調(diào)pH值到5. 0 5.4，雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液B;顯色液A、 B等體積混合，即為顯 色劑；量取111. 2ml 18M濃硫酸稀釋定容至1000ml即用；
f. 終止液2M硫酸溶液50ml;
g. 標(biāo)準(zhǔn)PCV2陰、陽性血清各1.0ml。
上述采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上，具體是于 5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M阪104溶液，室溫下避光攪拌20 分鐘，對pH4.4的lmM醋酸鈉緩沖液4。C透析過夜，加20 u 1 0. 2M pH9. 5碳酸 鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加入2ml待標(biāo) 記的Cap蛋白至lml 0. 01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0. lml 新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，4"C放置2小時，對pH7. 4的0. 15M PBS4。C透 析過夜，在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4"C放置1小時后3000rpm離 心半小時，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7. 4 的0. 15M的PBS中，對pH7. 4的0. 15MPBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后， 10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標(biāo)抗原。
雙抗原夾心ELISA由于具有更高的敏感性和特異性，在人醫(yī)上已廣泛使用。 與間接ELISA的主要不同之處在于用酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體，酶標(biāo)抗原不會與非特異性吸附的抗體結(jié)合，同時檢測標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其 敏感性和特異性相對高于間接法。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將酶標(biāo)抗原與待檢血清 同時加入到檢測孔中，使反應(yīng)一步完成。
應(yīng)用本試劑盒對豬繁殖與呼吸綜合癥病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽 性血清、偽狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、豬細(xì)小病毒標(biāo) 準(zhǔn)陽性血清、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性。說明本試劑盒 所用診斷抗原與其它病原抗體之間無交叉反應(yīng)。
而本發(fā)明的ELISA試劑盒與西班牙INGENASA公司試劑盒比較INGENASA公司 檢測PCV2抗體的間接ELISA試劑盒(INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)在歐美等 養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國家被廣泛應(yīng)用，是目前國際上公認(rèn)的一種檢測PCV2抗體的優(yōu)質(zhì)診 斷試劑盒。分別用本試劑盒與INGENASA公司檢測PCV2抗體的間接ELISA試劑盒 (INGEZIM CIRCO IgG 11.PCV.K1)檢測94份臨床送檢血清，比較其結(jié)果的一致 性，結(jié)果見表l。
表1本試劑盒與INGENASA公司試劑盒的比較試驗(yàn) INGENASA 公司本試劑盒檢測結(jié)果 PCV2試劑盒檢測
陽性陰性 陰性符合率陽性符合率總符合率
結(jié)果
陽性48頭份 43頭份 5頭份-- 89.58%
91. 49%
陰性46頭份 3頭份 43頭份93.47% —
從本發(fā)明的ELISA試劑盒與INGENASA公司試劑盒的對比試驗(yàn)來看，大部 分被檢樣品中的最終判定結(jié)果一致，只有少數(shù)弱陽性血清和0D45。值接近判定標(biāo)準(zhǔn)的陰性血清的檢測結(jié)果不一致，這可能與兩種ELISA檢測系統(tǒng)所選用的診斷
抗原不同以及兩個系統(tǒng)本身的誤差有關(guān)。
另夕卜，與INGENASA公司檢測PCV2抗體的間接ELISA試劑盒相比，本發(fā)明 的ELISA試劑盒只需一步孵育，省去了酶標(biāo)抗體孵育過程(30分鐘)和一個6 次的洗滌過程，從而節(jié)省了將近1個小時的檢測時間。
本發(fā)明的ELISA試劑盒與傳統(tǒng)的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的間接ELISA方 法相比，具有相近的敏感性和更好的特異性，且操作過程更加簡單、所需檢測 時間更少。


圖1是重組Cap融合蛋白的表達(dá)及純化后電泳圖。
其中第l泳道重組表達(dá)菌裂解后沉淀；第2泳道重組表達(dá)菌裂解后 上清；第3泳道陰性對照全菌；第4泳道蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，從上至下分別是94KD、 66KD、 45KD、 30KD、 26KD、 20KD、 14KD;第5泳道純化的重組Cap融合蛋白。 圖2是重組Cap融合蛋白的酶切及Cap蛋白的純化與濃縮后電泳圖。
其中第1泳道超濾濃縮后Cap蛋白；第2泳道酶切純化后C即蛋白； 第3泳道重組Cap融合蛋白酶切；第4泳道純化的重組Cap融合蛋白；第 5泳道:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，從上至下分別是97KD、 66KD、 44KD、 29KD、 22KD、 14KD。
具體實(shí)施例方式
包被抗原的制備
根據(jù)GenBank中PCV2的基因序列(登錄號AY943819)，設(shè)計(jì)兩條引物， 上有引物為GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC ; 下游引物為 GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC。通過PCR的方法從豬PCV2基因組中擴(kuò) 增不含核定位信號的Cap基因，將其克隆到pET32-a(+)原核表達(dá)載體(購自Novagen公司，產(chǎn)品編號69015-3)中，構(gòu)建pET32a-Cap重組表達(dá)載體。轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，參照Novagen公司pET Syetem Manual表達(dá)重 組Cap融合蛋白，該蛋白呈可溶性表達(dá)。用親和層析法(Novagen公司His-Bind Kit ，產(chǎn)品編號70239-3)純化表達(dá)的融合蛋白，見圖l。 PCV2抗體檢測板的制備
用0. 05M碳酸鹽緩沖液(PH9. 6)稀釋純化的C即融合蛋白，用方陣法確 定最佳包被濃度為5 u g/ml，取可拆96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 u 1， 4。C包被 24小時后用含0.05%吐溫-20 (體積比)的PBS (pH7.4)洗滌液(PBST)洗滌 2次，用5%脫脂奶粉(質(zhì)量體積比)37。C封閉1小時，用PBST充分洗滌，室 溫風(fēng)干，制備抗體檢測板。
酶標(biāo)抗原的制備
將純化的Cap融合蛋白用豬源腸激酶酶(購自南京金思特公司，產(chǎn)品編號 Z01003)切去掉融合部分，并再次使用親和層析柱純化獲得不含核內(nèi)化信號肽 的Cap蛋白，并用超濾管(購自Millipore公司，濾芯10KDa，產(chǎn)品編號U650886) 將其濃縮至2.0mg/ml用于標(biāo)記，見圖2。
采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)于Cap蛋白上。具體 過程如下于5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M阪104溶液，室溫 下避光攪拌20分鐘，對lmM醋酸鈉緩沖液(PH4. 4)4。C透析過夜，加20 u 1 0. 2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加 入2ml待標(biāo)記的Cap蛋白至lml 0. 01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2 小時，加0. lml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，4。C放置2小時，對O. 15MPBS (PH7.4) 4"C透析過夜，在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4"C放置1小 時后3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0. 15M的PBS (PH7. 4)中，對0. 15M的PBS (PH7. 4)緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標(biāo)抗原。用單項(xiàng)滴定法確定酶標(biāo)抗原的ELISA效價達(dá)1: 6000。緩沖液的制備
配制O. 1MPBS (PH7.4)作為PCV2抗體檢測試劑盒的酶標(biāo)抗原稀釋液，含0. 5%吐溫-20的1M PBS (PH7. 4)為IOX濃縮洗滌液。顯色劑的制備
稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，用100ml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml,配置顯色液A。稱取9.33g檸檬酸，14. 6g磷酸氫二鈉(Na2HP04'12H20)，加入0.75% (質(zhì)量體積比)過氧化氫尿素6.4ml，調(diào)pH值到5.0 5.4，雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液B。顯色液A、 B等體積混合，即為顯色劑。量取111.2ml濃硫酸(18M)稀釋定容至1000ml，備用。陰、陽性對照與判定標(biāo)準(zhǔn).-
在ELISA過程中，不同操作人員和不同的檢測批次之間會存在一定的誤差，比如，加樣和反應(yīng)時間的誤差等，這些誤差會導(dǎo)致檢測樣品OD值的誤差。但檢測樣品OD值/標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值(S/P值)可以消除誤差，準(zhǔn)確反應(yīng)檢測結(jié)果，是優(yōu)化的判定標(biāo)準(zhǔn)。在PCV2標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清中分別加入0.2mg/ml的NaN3，使其能在4t:長期保存而抗體效價變化不大。
判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清0D值》0.8;標(biāo)準(zhǔn)陰性血清0D值〈0.3，說明試驗(yàn)有效。當(dāng)S/P》0. 3，樣品為抗PCV2抗體陽性，當(dāng)S/P<0. 3，樣品為抗PCV2抗體陰性。
試劑盒的組裝
a. ELISA板條每個試劑盒包含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含可拆卸的已包被檢測抗原的ELISA板條，規(guī)格為8孔X 12條。
b. 洗滌液10倍濃縮的含0. 5%(體積)吐溫-20的1MPBS(PH7. 4)200ml。
c. 100倍濃縮的酶標(biāo)抗原500ul。
d. 酶標(biāo)稀釋液50ml。
e. 底物顯色液50ml。
f. 終止液2M硫酸溶液50ml。
g. 標(biāo)準(zhǔn)PCV2陰、陽性血清各1.0ml。樣品檢測的基本操作步驟為
a. 將濃縮的酶標(biāo)抗原用酶標(biāo)稀釋液100被稀釋至使用濃度，加入到ELISA板的反應(yīng)孔內(nèi)，每孔加入80ul，然后每孔加入血清20y 1，震蕩混勻，封板，置37'C孵育1小時。
b. 每孔加入300 u 1洗滌液洗板5次，吸干空內(nèi)殘留液體后每孔加入100ul底物TMB， 37"C避光顯色15分鐘。
c. 每孔加入終止液2M硫酸100 u 1終止顯色，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長下讀數(shù)。
注除濃縮的酶標(biāo)抗原外，其它試劑盒組分以及待檢血清用前恢復(fù)至室溫。
權(quán)利要求
1、一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述試劑盒依雙抗原夾心ELISA原理研制而成，包括a.ELISA板條每個試劑盒包含4塊真空包裝的ELISA板，每塊板含可拆卸的已包被檢測抗原的ELISA微孔板條，規(guī)格為8孔×12條；該包被抗原是依據(jù)GenBank中PCV2的基因序列(登錄號AY943819)，設(shè)計(jì)兩條引物，上游引物為GCGAATTCATGGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC；下游引物為GCGTCGACTTACTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC；通過PCR的方法從豬PCV2基因組中擴(kuò)增不含核定位信號的Cap基因，將其克隆到pET32-a(+)原核表達(dá)載體中，構(gòu)建pET32a-Cap重組表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，參照Novagen公司pET Syetem Manual表達(dá)重組Cap融合蛋白，用親和層析法純化表達(dá)的融合蛋白制得；b.洗滌液10倍濃縮的pH為7.4的含0.5％(體積百分比)吐溫-20的1M PBS溶液200ml；c.100倍濃縮的酶標(biāo)抗原500μl將上述純化的Cap融合蛋白用豬源腸激酶酶切去掉融合部分，并再次使用親和層析柱純化獲得不含核內(nèi)化信號肽的Cap蛋白，并用超濾管將其濃縮至2.0mg/ml，并采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上；d.酶標(biāo)稀釋液pH為7.4的0.1M PBS溶液50ml；e.底物顯色液50ml稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，用100ml無水乙醇或DMSO溶解后，以雙蒸水定容至1000ml，配置顯色液A；稱取9.33g檸檬酸，14.6g磷酸氫二鈉，加入0.75％(質(zhì)量體積比)的過氧化氫尿素6.4ml，調(diào)pH值到5.0～5.4，雙蒸水定容至1000ml，配制顯色液B；顯色液A、B等體積混合，即為顯色劑；量取111.2ml18M濃硫酸稀釋定容至1000ml即用；f.終止液2M硫酸溶液50ml；g.標(biāo)準(zhǔn)PCV2陰、陽性血清各1.0ml。
2、如權(quán)利要求1所述的檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，其特征在于所述采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶偶聯(lián)于Cap蛋白上，具體是于5mg/ml HRP溶液中，加入0. 2ml新配的0. 1M NaI(V溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，對pH4. 4的lmM醋酸鈉緩沖液4'C透析過夜，力B 20 u 1 0. 2M pH9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0 9.5，然后立即加入2ml待標(biāo)記的Cap蛋白至lml O.OIM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時，加0. lml新配的4mg/ml NaBIV液，混勻，4。C放置2小時，對pH7. 4的0. 15MPBS4"C透析過夜，在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4"C放置1小時后3000rpm離心半小時，棄上清；沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量PH7. 4的0. 15M的PBS中，對pH7. 4的0. 15M的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后，10000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶標(biāo)抗原。
全文摘要
一種檢測豬圓環(huán)病毒2型抗體的ELISA試劑盒，該試劑盒依雙抗原夾心ELISA原理研制而成，包括ELISA抗原預(yù)包被板條、洗滌液、100倍濃縮的酶標(biāo)抗原、酶標(biāo)稀釋液、底物顯色液、終止液及標(biāo)準(zhǔn)PCV2陰、陽性血清。本試劑盒采用酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體，酶標(biāo)抗原不會與非特異性吸附于ELISA板的抗體結(jié)合，同時待檢測血清標(biāo)本不需預(yù)先稀釋，直接與工作濃度的酶標(biāo)抗原混合后即可直接用于測定，操作簡單，所需檢測時間更少。
文檔編號G01N33/569GK101629956SQ20091004387
公開日2010年1月20日 申請日期2009年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月9日
發(fā)明者余興龍, 李潤成, 維 羅, 猛 葛, 蔣大良 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)