專利名稱：硝酸甘油用藥指導(dǎo)檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種個(gè)體硝酸甘油用 藥指導(dǎo)檢測(cè)的試劑盒，通過(guò)檢測(cè)硝酸酯類藥物用藥靶向位點(diǎn)ALDH2基因多態(tài)性位點(diǎn)來(lái)評(píng)估 個(gè)體硝酸甘油用藥指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
心絞痛(angina pectoris)是冠狀動(dòng)脈供血不足，心肌急劇的、暫時(shí)缺血與缺氧所 引起的臨床綜合征，是冠心病中最常見的類型，嚴(yán)重危害人民健康。據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示， 在我國(guó)，冠心病近年來(lái)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。20世紀(jì)70年代北京、上海、廣州的該病人口死亡率分 別為21. 7/10萬(wàn)人口、15. 7/10萬(wàn)人口和4. 1/10萬(wàn)人口 ；90年代我國(guó)城市男性該病死亡率 為49. 2/10萬(wàn)人口，女性為32. 2/10萬(wàn)人口。冠心病的發(fā)病隨年齡的增長(zhǎng)而增高，程度也隨 年齡的增長(zhǎng)而加重。有資料表明，自40歲開始，每增加10歲，冠心病的患病率增1倍。男 性50歲，女性60歲以后，冠狀動(dòng)脈硬化發(fā)展比較迅速，同樣心肌梗塞的危險(xiǎn)也隨著年齡的 增長(zhǎng)而增長(zhǎng)。年輕的男性患者比年輕的女性患者多，但絕經(jīng)后的女性以及年過(guò)六十的婦女， 其危險(xiǎn)就幾乎與男性相等了，甚至大于男性。老年人心臟病發(fā)作的可能性較高。心絞痛發(fā)作時(shí)應(yīng)立即休息，較重的發(fā)作，可使用作用快的硝酸酯制劑。這類藥物 除了擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，降低其阻力，增加其血流量外，還通過(guò)對(duì)周圍血管的擴(kuò)張作用，減少靜 脈回心血量，降低心室容量、心腔內(nèi)壓、心排血量和血壓，減低心臟前后負(fù)荷和心肌的需氧， 從而緩解心絞痛。在疾病的緩解期也應(yīng)該常備作用持久的抗心絞痛藥物，如硝酸酯制劑， 以防心絞痛發(fā)作。所以硝酸酯類藥物在心絞痛的預(yù)防發(fā)作、緩解癥狀中起極其重要的作 用，常用的該類藥物有1)硝酸甘油(nitroglycerin)，2) 二硝酸異山梨醇(isosorbide dinitrate，消心痛)，3)亞硝酸異戊酯(anyl nitrite)，其中硝酸甘油的應(yīng)用范圍最為廣 泛。但在硝酸甘油的實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有部分患者延遲見效或基本無(wú)效，研究發(fā)現(xiàn)除去藥物 失效及耐藥的情況，患者自身的遺傳體質(zhì)對(duì)藥效的發(fā)揮也產(chǎn)生了重大影響。線粒體乙醛脫氫酶是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性酶超基因家族中的一員，參 與乙醛代謝和硝酸甘油代謝?；蛲蛔兛稍斐删凭卸竞痛x障礙。該基因的第12個(gè)外顯 子存在一個(gè)G/A多態(tài)，即504位的谷氨酸被賴氨酸替代(Glu504Lys，E504K, rs671)。突變 型酶(E504K)對(duì)其脫氫酶底物——乙醛的催化活性嚴(yán)重下降(活性為正常酶活性的6%)； 同時(shí)，這個(gè)單核苷酸多態(tài)也會(huì)明顯的影響線粒體乙醛脫氫酶酯酶的催化活性。通過(guò)舌下含 服硝酸甘油治療心絞痛臨床療效與個(gè)體線粒體乙醛脫氫酶基因型的關(guān)聯(lián)分析，證明了線粒 體乙醛脫氫酶E504K基因多態(tài)顯著影響硝酸甘油對(duì)個(gè)體的療效(2 = 7. 59，P < 0. 01)。硝 酸甘油和乙醛互為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的事實(shí)也暗示線粒體乙醛脫氫酶對(duì)硝酸甘油和乙醛的催 化活性中心重疊。人體內(nèi)線粒體乙醛脫氫酶2(ALDH2)是硝酸甘油的有效代謝一氧化氮形成的關(guān) 鍵。但是，如果病人體內(nèi)的線粒體乙醛脫氫酶2的基因Lys-504發(fā)生突變，就會(huì)影響線粒體 乙醛脫氫酶2的酯酶活性，使硝酸甘油在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程受阻，導(dǎo)致一氧化氮減少甚至無(wú)法產(chǎn)生一氧化氮，也就難以有效發(fā)揮作用。值得注意的是，在亞洲人群中，30% -50%的 人都攜有Lys-504基因突變，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美人群。研究還發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群中，含服硝酸 甘油無(wú)效的比例高達(dá)20%。

發(fā)明內(nèi)容
基于硝酸酯類藥物用藥靶向位點(diǎn)ALDH2基因多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估個(gè)體硝酸甘油用 藥指導(dǎo)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)個(gè)體硝酸甘油用藥指導(dǎo)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)硝酸酯類藥物用藥靶向位點(diǎn)ALDH2基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異 性熒光探針對(duì)；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性熒光探針對(duì) 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 ill，25mM dNTP 混合液 0. 1 u 1,25mM MgC12 溶液 0. 6u 1,5units/ u 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 u 1,20iiM特異性引物對(duì)每條引物各0. 225 iil，10 P M特異性熒光探針對(duì)每條探針各0.25 iil，去離子水 5. 325ii 1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測(cè)試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測(cè)試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 u 1，包含濃度為20ng/ yl的DNA模板2 ill、1 ill 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA 聚合 酶、20 y M的有義引物和反義引物各0. 225 iU、10 y M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各 0. 25ii 1，去離子水 5. 325 u 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析
根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)個(gè)體硝酸甘油用藥指導(dǎo)的試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)硝酸酯類藥物用藥靶向位點(diǎn)ALDH2基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1，`25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,`25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，`5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,`20 μ M特異性引物對(duì)每條引物各0. 225 μ 1，`10 μ M特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)個(gè)體硝酸甘油用藥指導(dǎo)的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)硝酸酯類藥物用藥靶向位點(diǎn)ALDH2基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)檢測(cè)硝酸酯類藥物用藥靶向位點(diǎn)ALDH2基因多態(tài)性位點(diǎn)來(lái)評(píng)估個(gè)體硝酸甘油用藥指導(dǎo)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101928762SQ20091005395
公開日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司