專利名稱：定量檢測人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人血清中自體a-突觸核蛋白抗體的檢測方法，該方法可用于帕 金森病的診斷。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinsonps disease, PD)是一種發(fā)病率僅次于老年癡呆的老年神經(jīng)退 行性疾病，其主要病理特征以中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失和殘留神經(jīng)元 胞漿內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，稱路易小體。a-突觸核蛋白是構(gòu)成路易小體的主要成分， 主要以聚集體的形式存在。在帕金森病的發(fā)病過程中，高水平的a-突觸核蛋白可形成 對多巴胺能神經(jīng)元具有毒性的變構(gòu)形式，而這種變構(gòu)形式有可能在多巴胺能神經(jīng)元死亡 的局部微環(huán)境形成可導(dǎo)致自體抗體產(chǎn)生，進(jìn)而在帕金森病人的血清中出現(xiàn)自體a-突觸核 蛋白抗體水平增高。到目前為止，只有一篇文獻(xiàn)報道了在希臘的家族性帕金森病人血清 中自體a-突觸核蛋白抗體水平增高，而且存在著病例少和定量方法不完善等缺陷。目 前，帕金森病的診斷主要依靠運(yùn)動癥狀和醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)，有較高的誤診率。臨床病理研究 表明，在散發(fā)性帕金森病的診斷中，至少有24%的誤診率。此外，由于帕金森病患者黑 質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡特征表現(xiàn)為進(jìn)行性死亡，只有當(dāng)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡達(dá)到了 70%左右時，才開始出現(xiàn)運(yùn)動癥狀，而這時已經(jīng)是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡的晚期。此 時除了補(bǔ)充多巴胺的對癥療法外，并無根治療法，勢必嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量和給社 會和家庭增加沉重的負(fù)擔(dān)。因此早期發(fā)現(xiàn)、診斷帕金森病對于及時治療、保護(hù)多巴胺能 神經(jīng)元、延緩病情、改善患者的生活質(zhì)量具有十分重要的意義。 本發(fā)明研究出檢測人血清中自體a-突觸核蛋白抗體的方法，可用于對帕金森病 的診斷，是篩選帕金森病高危人群和臨床診斷帕金森病的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種帕金森病的診斷方法，其中包括人血清中自體a-突觸核蛋白抗 體的檢測方法。 本發(fā)明用抗原(重組人a-突觸核蛋白)和抗體(兔抗人a-突觸核蛋白多克隆 抗體)制備成試劑盒，用抗原抗體反應(yīng)原理檢測帕金森病人和正常健康人血清中的自體 a-突觸核蛋白抗體的存在數(shù)量并進(jìn)行比較，試劑盒采用顯色反應(yīng)來判斷人血清中的自體 a -突觸核蛋白抗體的存在與否和數(shù)量多少。
本發(fā)明的帕金森病的診斷方法包括以下步驟
步驟1、人a -突觸核蛋白的制備
步驟2、抗a -突觸核蛋白多克隆抗體的制備
步驟3、帕金森病人和正常健康人血清的制備
步驟4、人血清中自體a-突觸核蛋白抗體的檢測
步驟5、比較檢測結(jié)果
本發(fā)明的疾病診斷方法包括使用診斷試劑對人血清中自體a -突觸核蛋白抗體進(jìn) 行檢測。 因此本發(fā)明包括診斷試劑盒。 本發(fā)明的診斷試劑盒的組成包括 抗原(重組人a -突觸核蛋白) 抗體(兔抗人a -突觸核蛋白多克隆抗體) 本發(fā)明的試劑盒還包括以下輔助組成成分用于抗原抗體的反應(yīng)測定。
抗原稀釋液(0.05M碳酸緩沖液，pH9.6)
抗體與血清稀釋液(10% BSA/PBS)
洗板液(0.1% (v/v)Tween-20/PBS)
封閉液(10% BSA/PBS) 標(biāo)記二抗(AP-山羊抗兔IgG ; AP-山羊抗人IgG) 顯色底物(p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System, Sigma)96孑L ELISA板。 本發(fā)明的試劑盒，各試劑分別包裝，優(yōu)選使用包裝管，每個包裝管中裝入試劑 的量以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴(kuò)大到IO個，100個，IOOO個樣本的使用量。
本發(fā)明還包括的人血清中自體a-突觸核蛋白抗體的檢測方法，該方法包括以下 步驟 抗原(重組人a -突觸核蛋白)和抗體(兔抗人a -突觸核蛋白多克隆抗體)進(jìn)行 反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)顯色的差異判斷人血清中的自體a-突觸核蛋白抗體的存在與否和數(shù)量多 少。 采用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測的方法如下 1)包板人a -突觸核蛋白(10 y g/ml，碳酸緩沖液溶解)100 y 1/孔包被96孔 ELISA板，4°C， 24小時。 2)洗板用含0.1 % (v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200 y 1/孔洗板3次，每次5分鐘。 3)封閉采用含10% BSA/PBS 200 ii 1/孔封閉1小時。 4)加樣在96孔板的1 3列加入從1 : 10000 1 : 640000不同稀釋度的兔 抗人a-突觸核蛋白多克隆抗體100iU/孔(20X山羊正常血清/PBS稀釋)，每個稀釋度3 個做3個復(fù)孔。9 12列加入稀釋的人血清樣本100iU/孔(1 : 100， 20%山羊正常血 清/PBS稀釋)，每個樣本做3個復(fù)孔。4°C，過夜。 5)洗板用含0.1 % (v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200 y 1/孔洗板3次，每次5分鐘。
6)加入標(biāo)記二抗在1 3列的兔多抗樣本加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔 IgGlOO ii 1/孑L (1 : 5000， 10% BSA/PBS稀釋)，9 12列人血清樣本加入堿性磷酸酶標(biāo) 記山羊抗人IgG 100iU/孔(1 : 5000， 10% BSA/PBS稀釋)，室溫孵育1小時。
7)洗板用含0.1 % (v/v)Tween-20的PBS(PBS-T)200 y 1/孔洗板3次，每次5分鐘。8)顯色力口入顯色底物(p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System,
5Sigma)100iU/孔，37°C， 30分鐘。 9)終止顯色反應(yīng)3N NaOH 100 ii 1/孔終止顯色反應(yīng)。
10)檢測吸光度酶標(biāo)儀405nm測吸光度。
ll)抗體單位值計(jì)算 將最高稀釋度1 : 640000設(shè)置為含1抗體單位，依次1 : 320000為2抗體單 位，1 : 160000為4抗體單位，1 : 80000為8抗體單位，1 : 40000為16抗體單位， 1 : 20000為32抗體單位，1 : IOOOO為64抗體單位。根據(jù)各抗體單位的平均吸光度， 作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)線性相關(guān)公式，可計(jì)算出血清樣本含自體抗人a-突觸核蛋白抗體 的相對量。如80314血清3個復(fù)孔的吸光度分別是0.84973， 0.86223， 0.69677。 吸 光度均值為0.80291。根據(jù)公式可計(jì)算出該血清中自體人a -突觸核蛋白抗體的相對量是 37.27744。 本發(fā)明的試劑盒，其中重組人a -突觸核蛋白的制備如下 pGEX-h a -SYN重組質(zhì)粒(由美國帕金森氏病研究所饋贈)常規(guī)轉(zhuǎn)化BL21感受 態(tài)細(xì)胞，取1菌落植入10ml 2X YTA-amp液體培養(yǎng)基(每升含16g蛋白胨、10g酵母提取 物、5gNaCl和0.1g氨芐青霉素)37t:振蕩過夜，預(yù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至1升新鮮的2X YTA-amp 培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)3h后加IPTG(最終濃度0.1mmol/L)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后收獲細(xì)菌，以冰冷PBS懸浮細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌后離心，上清經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose 親和層析純化得到GST-ha-SYN融合蛋白，再經(jīng)凝血酶分解、酶切過柱純化得到重組人 a -突觸核蛋白。冷凍干燥，-S(TC保存待用。BCA法定量a -突觸核蛋白。Western Blot鑒定重組a -突觸核蛋白(圖1)。兔抗人a -突觸核蛋白多克隆抗體的制備如下
家兔4只，免疫前采血，制備血清備用。2mla-突觸核蛋白溶液(lmg/ml)與等 量的經(jīng)充分震蕩的福氏完全佐劑充分乳化。每只動物接受0.8ml乳化后的抗原溶液皮下 注射，初次免疫14天后，采血制備抗血清，檢測免疫效果。初次免疫4周后，動物接受 強(qiáng)化免疫，2周后，采血制備抗血清。采取硫酸銨鹽析法分離純化抗體，Western Blot檢 測抗體的特異性和敏感性(圖2)。 在使用本發(fā)明的試劑盒時，需要采集帕金森病人和正常健康人對照血清，所述 對照血清的制備方法如下 收集靜脈血在采血管(BD公司)中，避免溶血。緩慢地上下振蕩采血管5次， 使血液中的凝結(jié)塊混勻。室溫(25t:)垂直放置l小時，使血液凝結(jié)。(血液必須精確凝 結(jié)1小時，否則，樣品凝結(jié)時間不同可能會導(dǎo)致差異)。室溫下，用離心機(jī)以2000g離心 IO分鐘。吸取上清液，分裝(10iU/管)到對應(yīng)的已標(biāo)記樣品管中。立即凍存血清樣品 于-8(TC冰箱。避免反復(fù)凍融。 在本發(fā)明的試驗(yàn)中，其中使用的試劑和原材料包括pGEX-ha-SYN重組質(zhì)粒
均可從市場上購買得到，屬于公知技術(shù)。


圖1為96孔ELISA板示意圖。 圖2為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 圖3為重組人a -突觸核蛋白的鑒定
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圖4為兔抗人a -突觸核蛋白多克隆抗體的鑒定 圖5為帕金森病人血清中自體a -突觸核蛋白抗體含量明顯高于正常健康對照
本發(fā)明的方法操作簡單，靈敏度高，檢測費(fèi)用少，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，可提前 診斷，具有良好的醫(yī)用效果。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1 l.原核表達(dá)、純化和鑒定重組人a-突觸核蛋白 WESTERN BLOT結(jié)果顯示，50 lOOOng的純化后的重組人a -突觸核蛋白與 小鼠抗人單克隆抗體(3D5)結(jié)合后，顯示了大小不等的陽性條帶，蛋白分子量的大小大約 為18kD左右，與人a-突觸核蛋白分子量一致，證明重組表達(dá)的蛋白為以人a-突觸核 蛋白(圖3)。 2.:兔抗人a -突觸核蛋白多克隆抗體生產(chǎn) 采用重組表達(dá)的人a-突觸核蛋白免疫家兔后，收獲的抗血清進(jìn)行的WESTERN BLOT結(jié)果顯示，抗血清可在l : 30000的稀釋度明顯顯示重組表達(dá)的人a-突觸核蛋 白，表明該兔抗血清和抗原有很好的親和力；而大鼠腦勻漿的結(jié)果顯示，在l : 10000的 稀釋度，該抗體僅顯示了與a-突觸核蛋白分子量大小吻合的一個條帶，表明該抗血清有 較好的特異性。
實(shí)施例2
試劑盒的制備 試劑盒構(gòu)成96孔ELISA板(康寧公司)、包被抗原(重組人a-突觸核蛋 白)、標(biāo)準(zhǔn)抗體(兔抗人a-突觸核蛋白多克隆抗體)、抗原稀釋液(0.05M碳酸緩沖 液，pH 9.6)、抗體與血清稀釋液(10 % BSA/PBS)、洗板液(0.1 % (v/v)Tween-20/PBS)、 封閉液(10% BSA/PBS)、標(biāo)記二抗(AP-山羊抗兔IgG; AP-山羊抗人IgG)、顯色底物 (p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System, Sigma)有關(guān)稀釋液，洗禾反液，封閉液， 標(biāo)記二抗，顯色底物的組成和配制方法屬于公知技術(shù)。
實(shí)施例3 血清樣本中自體人a -突觸核蛋白抗體的檢測 采用相對定量ELISA法，對116例臨床診斷的帕金森病人和78例健康對照血清 中自體a-突觸核蛋白抗體進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示帕金森病人血清中自體a-突觸核蛋白 抗體含量為30.3± 11.69抗體單位，帕金森病人中血清中自體a-突觸核蛋白抗體最高值 為64.72567;而正常健康對照血清該抗體含量為15.7±5.99抗體單位，最高值為27.665。 帕金森病人血清中自體a-突觸核蛋白抗體含量明顯高于正常健康對照(p〈0.01)。圖 5.相對定量ELISA法檢測人血清中自體a-突觸核蛋白抗體含量。"p < 0.01。
權(quán)利要求
定量檢測人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括人α-突觸核蛋白和抗人α-突觸核蛋白抗體。
2. 權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于，還含有以下輔助試劑， 抗原稀釋液0.05M碳酸緩沖液 抗體與血清稀釋液10%BSA/PBS洗板液0.1% (v/v)Tween-20/PBS 封閉液10% BSA/PBS標(biāo)記二抗AP-山羊抗兔IgG ; AP-山羊抗人IgG顯色底物p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System96孑L ELISA板。
3. —種人血清中自體a-突觸核蛋白抗體的定量檢測方法，其特征在于，用人a-突 觸核蛋白和抗人a-突觸核蛋白抗體進(jìn)行反應(yīng)，用反應(yīng)結(jié)果的顯色程度來檢測人血清中的 自體a-突觸核蛋白抗體的存在和數(shù)量。
4. 權(quán)利要求3的檢測方法，其特征在于，包括用權(quán)利要求2的試劑盒進(jìn)行檢測的步驟。
5. 權(quán)利要求4的檢測方法，其特征在于，所述用權(quán)利要求2的試劑盒進(jìn)行檢測包括以 下步驟1) 包板人a -突觸核蛋白10 y g/ml，碳酸緩沖液溶解100 ii 1/孔包被96孔ELISA 板，4°C， 24小時；2) 洗板用含0.1 % (v/v)Tween-20的PBS或PBS-T 200 y 1/孔洗板3次，每次5分鐘；3) 封閉采用含10% BSA/PBS 200 y 1/孔封閉1小時；4) 加樣在96孔板的1 3列加入從1 : 10000 1 : 640000不同稀釋度的兔抗 人a-突觸核蛋白多克隆抗體100iU/孔，20X山羊正常血清/PBS稀釋，每個稀釋度3個 做3個復(fù)孔。9 12列加入稀釋的人血清樣本100 ii 1/孔，1 : 100， 20%山羊正常血清 /PBS稀釋，每個樣本做3個復(fù)孔。4°C，過夜；5) 洗板用含0.1 % (v/v)Tween-20的PBS或PBS-T 200 y 1/孔洗板3次，每次5分鐘；6) 加入標(biāo)記二抗在1 3列的兔多抗樣本加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgGlOO ii 1/ 孔，1 : 5000， 10% BSA/PBS稀釋，9 12列人血清樣本加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗人 IgG100iU/孑L 1 : 5000， 10% BSA/PBS稀釋，室溫孵育l小時；7) 洗板用含0.1 % (v/v)Tween-20的PBS或PBS-T 200 y 1/孔洗板3次，每次5分鐘；8) 顯色力口入顯色底物p-Nitrophenyl Phosphate Liquid Substrate System, 100 u 1/孔，37°C， 30分鐘;9) 終止顯色反應(yīng)3NNaOH 100 y 1/孔終止顯色反應(yīng)；10) 檢測吸光度酶標(biāo)儀405nm測吸光度；11) 抗體單位值計(jì)算。
6. —種帕金森病的診斷方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟l、人a-突觸核蛋白的制備步驟2、抗a-突觸核蛋白多克隆抗體的制備 步驟3、帕金森病人和正常健康人血清的制備 步驟4、血清中自體a-突觸核蛋白抗體的檢測 步驟5、比較檢測結(jié)果。
7. 權(quán)利要求6的診斷方法，其特征在于，包括使用權(quán)利要求2的診斷試劑盒對人血清 中自體a-突觸核蛋白抗體進(jìn)行檢測的步驟。
8. 權(quán)利要求1的試劑盒，其中人a -突觸核蛋白的制備如下pGEX-h a -SYN重組質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，取1菌落植入 10ml2XYTA-amp液體培養(yǎng)基(每升含16g蛋白胨、10g酵母提取物、5g NaCl和O.lg氨芐 青霉素)37t:振蕩過夜，預(yù)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至1升新鮮的2XYTA-amp培養(yǎng)基中，37。C振蕩培 養(yǎng)3h后加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后收獲細(xì)菌，以冰冷PBS懸浮細(xì)菌，超聲破 碎細(xì)菌后離心，上清經(jīng)谷胱甘肽-Sepharose親和層析純化得到GST-h a -SYN融合蛋白， 再經(jīng)凝血酶分解、酶切過柱純化得到重組人a-突觸核蛋白。
9. 權(quán)利要求1的試劑盒，其中抗人a -突觸核蛋白抗體的制備如下家兔4只，免疫前采血，制備血清備用；2mla-突觸核蛋白溶液與等量的經(jīng)充分震 蕩的福氏完全佐劑充分乳化；每只動物接受0.8ml乳化后的抗原溶液皮下注射，初次免疫 14天后，采血制備抗血清，檢測免疫效果；初次免疫4周后，動物接受強(qiáng)化免疫，2周 后，采血制備抗血清；采取硫酸銨鹽析法分離純化抗體。
10. 權(quán)利要求I的試劑盒，其特征在于，使用過程中，血清樣品的采集方法如下 收集靜脈血在采血管中，避免溶血；緩慢地上下振蕩采血管5次，使血液中的凝結(jié)塊混 勻；室溫垂直放置1小時，使血液凝結(jié)；室溫下，用離心機(jī)以2000g離心10分鐘；吸取 上清液，分裝到對應(yīng)的已標(biāo)記樣品管中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種定量檢測人血清中自體α-突觸核蛋白抗體的方法，本發(fā)明用抗原重組人α-突觸核蛋白和抗體兔抗人α-突觸核蛋白多克隆抗體制備成試劑盒，用抗原抗體反應(yīng)原理檢測帕金森病人和正常健康人血清中的自體α-突觸核蛋白抗體的存在數(shù)量并進(jìn)行比較，試劑盒采用顯色反應(yīng)來判斷人血清中的自體α-突觸核蛋白抗體的存在與否和數(shù)量多少。
文檔編號G01N33/68GK101692092SQ20091009326
公開日2010年4月7日 申請日期2009年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者徐勝利, 陳彪 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院