專利名稱：：二苯乙烯苷及其衍生物抑制突觸核蛋白過度表達(dá)的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及二苯乙烯苷或其衍生物的一種新的醫(yī)藥用途，尤其涉及二苯乙烯香或其衍生物在抑制a-突觸核蛋白過度表達(dá)的用途，屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：二苯乙烯香(2,3，5,4，-tetmhydroxystilbene-2-O-/3-"-glucoside，TSG)的結(jié)構(gòu)式如下其中R為-0-]3-D-葡萄糖。二苯乙烯苦可以直接在市場上購買得到，可通過高效液相色譜法對其進(jìn)行含量分析。突觸核蛋白(synuclein)最初從太平洋電鱘魚(Torpedocalifomia)的帶電器官中分離發(fā)現(xiàn)的突觸小分子蛋白質(zhì)，因其主要位于神經(jīng)突觸和細(xì)胞核膜上，故而得名。研究顯示，一些常染色體顯性遺傳的家族性帕金森病與a-突觸核蛋白(a-synuclein)的3種基因錯(cuò)義突變型(A53T、A30P、G46L)相關(guān)。隨后又發(fā)現(xiàn)a-突觸核蛋白是散發(fā)性帕金森病路易小體(Lewybody,LB)的主要成分，而路易小體是帕金森病的病理學(xué)標(biāo)志。除帕金森病以外，a-突觸核蛋白也是構(gòu)成路易體癡呆(dementiawithlewybody,DLB)、單純性自主神經(jīng)功能障礙和多系統(tǒng)萎縮(multiplesystemicatrophy,MSA)等細(xì)纖維樣包涵物的主要成分，提示帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙和多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)變性疾病可能有共同的病理基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制，從而奠定了(x-突觸核蛋白在神經(jīng)變性病發(fā)病中的作用。oc-突觸核蛋白病理性積聚是神經(jīng)變性疾病臨床癥狀發(fā)生、發(fā)展及受累腦區(qū)變性的原因，其共同病理特征是a-突觸核蛋白選擇性地在易損的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中積聚，形成包涵體。路易小體的出現(xiàn)及其分布不同可引起不同的癥候群腦干路易小體與帕金森病相關(guān)；彌漫性皮質(zhì)路易小體與癡呆相關(guān)；腦干、脊索、交感神經(jīng)節(jié)路易小體則與自主神經(jīng)功能障礙相關(guān)。帕金森病(Parkinsondisease,PD)是一種常見于中老年期的慢性進(jìn)展的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其臨床癥狀和體征為肌強(qiáng)直或肌僵直，靜止性震顫，運(yùn)動徐緩，平衡及行走障礙等。神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性、缺失、變性神經(jīng)元胞漿內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體路易小體。a-突觸核蛋白是帕金森病路易小體的主要成分，它是由140個(gè)氨基酸殘基組成的酸性蛋白。1997年從常染色體顯性遺傳家族性PD中發(fā)現(xiàn)其氨基末端兩個(gè)罕見的錯(cuò)義突變。自然狀態(tài)下，a-突觸核蛋白呈無序的未折疊結(jié)構(gòu)，但在高濃度時(shí)，它可轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸劾w維樣的/3-折疊結(jié)構(gòu),形成寡聚體,具有細(xì)胞毒性。a-突觸核蛋白可增加形成原纖維的傾向性。經(jīng)過泛素-蛋白酶體通路降解，過表達(dá)或突變的a-突觸核蛋白可形成/3-折疊結(jié)構(gòu)，使其在泛素化后也不易被UPP降解，并可與蛋白酶體26S中的亞單位6S結(jié)合，抑制其活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)a-突觸核蛋白不能被UPP及時(shí)有效地清除而出現(xiàn)病理性積聚及路易小體形成，黑質(zhì)神經(jīng)元的氧化應(yīng)激增加，引起線粒體功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。路易體癡呆(DLB)約占老年期癡呆的20%，不少報(bào)道認(rèn)為其是引起老年期癡呆的第二大變性疾病。一般于中老年期起病，臨床表現(xiàn)為波動性認(rèn)知功能障礙伴明顯的注意力和警覺性改變。病理學(xué)方面發(fā)現(xiàn)整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)特別是大腦皮質(zhì)和紋狀體的乙酰膽堿能神經(jīng)元內(nèi)有大量路易小體形成，a-突觸核蛋白是路易小體的主要成分。單純DLB在海馬、海馬旁回?zé)o或僅出現(xiàn)少量老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。路易體病引起癡呆的病理機(jī)制多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它與大腦皮質(zhì)內(nèi)路易小體的數(shù)量、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶以及多巴胺耗竭有關(guān)。多系統(tǒng)萎縮(MSA)包括橄欖橋腦小腦萎縮(OPCA)、紋狀體黑質(zhì)變性(SND)和ShyDmger綜合征(SDS),臨床表現(xiàn)為不對稱的運(yùn)動功能障礙及小腦、錐體束以及自主神經(jīng)損害的癥狀和體征。病理改變?yōu)榧y狀體、黑質(zhì)、橄欖核、腦橋和小腦等部位出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)包涵體(glialcytoplasmicinclusion,GCI)以及神經(jīng)元喪失、膠質(zhì)細(xì)胞增生等，其中GCI是確診MSA的特征性改變。研究顯示MSA患者的GCI中有大量a-突觸核蛋白存在。目前研究發(fā)現(xiàn)，處于第I階段的MSA患者腦內(nèi)有GCI的廣泛分布時(shí)，其神經(jīng)元的喪失往往局限于黑質(zhì)和藍(lán)斑而未累及紋狀體。提示GCI的出現(xiàn)是MSA的原發(fā)性損害，并通過髓鞘-軸索-神經(jīng)元的逆行性損害？1起神經(jīng)元的繼發(fā)性改變。單純性自主神經(jīng)功能障礙是路易體病的一種臨床表現(xiàn)。它是一種特發(fā)的散發(fā)性神經(jīng)變性疾病，原發(fā)性體位性低血壓是其主要的臨床癥狀，此外，患者可出現(xiàn)出汗異常、怕熱、尿路功能障礙、便秘或腹瀉、勃起困難等。有研究發(fā)現(xiàn)中樞和周圍自主神經(jīng)結(jié)構(gòu)有嚴(yán)重?fù)p害，在節(jié)前和節(jié)后的交感及副交感神經(jīng)系統(tǒng)存在明顯的路易小體、路易軸突和神經(jīng)元損傷；此外，在黑質(zhì)、藍(lán)斑、大腦腳核、背側(cè)中縫核也存在不同數(shù)量的路易小體和神經(jīng)元損傷；在路易小體中有大量的a-突觸核蛋白存在。二苯乙烯苷是中藥何首烏的主要有效成分之一，以往的研究發(fā)現(xiàn)該類化合物對動物腦缺血損傷有良好的保護(hù)作用，同時(shí)對各種因素導(dǎo)致癡呆的動物模型有良好的改善作用，迄今為止，沒有發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷能夠有效抑制體內(nèi)a-突觸核蛋白過量表達(dá)這一藥理功能的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人經(jīng)過細(xì)胞模型試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二苯乙烯苷能夠有效抑制a-突觸核蛋白的過量表達(dá)。由于a-突觸核蛋白過量表達(dá)與帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙和多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)變性疾病有直接和密切的關(guān)系，降低或抑制a-突觸核蛋白在體內(nèi)的過量表達(dá)，必然對于由于a-突觸核蛋白過量表達(dá)所導(dǎo)致的帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙、多系統(tǒng)萎縮[多系統(tǒng)萎縮(MSA)包括橄欖橋腦小腦萎縮(OPCA)、紋狀體黑質(zhì)變性(SND)和ShyDrager綜合征(SDS)等]等神經(jīng)變性疾病有確切的預(yù)防或治療作用，因此，二苯乙烯苷及其衍生物可用于預(yù)防或治療諸如帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙或多系統(tǒng)萎縮等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。所述的"二笨乙烯苷衍生物"是指二笨乙烯苷在3、5或4，位被d—6烷基或卣素所取代而得到的衍生物，或者是指二笨乙烯普與可藥用有機(jī)酸(如乙酸)或無機(jī)酸(如鹽酸)等形成的酯。本發(fā)明還涉及一種用于預(yù)防和/或治療a-突觸核蛋白過度表達(dá)引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含有效量的二笨乙烯苷或其可藥用衍生物作為活性成分。所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括但不限于帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙、多系統(tǒng)萎縮等。所述藥物組合物還可包含一種或多種可藥用載體，所述載體可以是現(xiàn)有技術(shù)中廣泛使用的各種載體，如賦形劑(例如水)等；本發(fā)明的藥物組合物還可以包含一種或多種其它組分，如香味劑、著色劑、甜味劑等。上述藥物組合物可以按現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行制備成臨床上可接受的制劑，例如采用混合、制?；驂浩榷喾N方式，所述的制劑可以是口服劑型(例如片劑、膠嚢劑、顆粒劑、丸劑等)，也可以是注射制劑等。二苯乙烯苷或其衍生物在治療帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙和多系統(tǒng)萎縮等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的用法與用量包括對需要治療的患者施用有效量的二苯乙烯苷或其衍生物，作為參考二苯乙烯苦或其衍生物的口服劑量一般為0.5-50mg/Kg體重/日，注射劑量一般為0.1-10mg/Kg體重/曰。圖l免疫印跡法檢測a-突觸核蛋白表達(dá)的結(jié)果；(l)模型對照；(2)12.5/mioL/L的二苯乙烯苷；(3)25MmoL/L的二苯乙烯苷；(4)50MmoL/L的二苯乙烯苦；(5)100lUmoL/L的二苯乙烯芬；(6)200/mioL/L的二苯乙烯苦。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1片劑的制備二苯乙烯苷50mg,羧曱基纖維素240mg，乳糖100mg，石更脂酸鎂10mg。將上述組分粉碎，混合，壓片，制成片劑。實(shí)施例2針劑的制備二苯乙烯普25mg和生理鹽水lOOmL,混合，制成針劑。試驗(yàn)例1二苯乙烯苷抑制a-突觸核蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型a-突觸核蛋白的過表達(dá)一、試驗(yàn)?zāi)康挠^察二苯乙烯苷對a-突觸核蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型a-突觸核蛋白表達(dá)量的影響。二、i式-瞼方法人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y細(xì)胞，通常以此細(xì)胞系代表神經(jīng)元細(xì)胞)轉(zhuǎn)染a-突觸核蛋白是體外培養(yǎng)的a-突觸核蛋白過表達(dá)細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[張宇新，張子明，楊慧，等.a-突觸核蛋白在體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)可導(dǎo)致氧應(yīng)激.中國病理生理雜志.2005,21(8):1532-1535]制備，SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)在含有DMEM培養(yǎng)基的35mm的培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞生長至70%融合時(shí)，用Lipofectamine試劑(Invitrogen)和質(zhì)粒a-突觸核蛋白-增強(qiáng)型纟錄色焚光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染36h后用熒光顯微鏡(Leica)檢測基因a-synuclein-pEGFP的表達(dá)產(chǎn)物；加入600Mg/mlG418(Sigma)篩選，待用。選擇轉(zhuǎn)染a-synuclein成功的細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，在5。/。C02孵箱37。C培養(yǎng)，每周換液2次，傳代1代。將細(xì)胞以lxl0MVml的密度接種于6孔板中；將其中的一個(gè)孔作為模型對照，不用二苯乙烯芬進(jìn)行處理，其余的5個(gè)孔分別加入濃度為12,5]LimoL/L,25/mioL/L,50/xmoL/L,100/mioL/L,200/noL/L的二苯乙烯苷(購自中國藥品生物制品檢定所)，培養(yǎng)24小時(shí)。貼壁細(xì)胞用生理鹽水洗2次，加入預(yù)冷的裂解緩沖液，刮下細(xì)胞，在冰上裂解120分鐘，將裂解物以12000r/分鐘在4。C離心兩次，每次20分鐘，收集上清，得到所表達(dá)的a-突觸核蛋白。用免疫印跡法(westernblotting)檢測a-突觸核蛋白等量蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，常規(guī)方法經(jīng)一抗(抗a-突觸核蛋白抗體)及二抗孵育后，用發(fā)光液顯影。用ImageJ圖像分析軟件對各組蛋白表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。三、試驗(yàn)結(jié)果如圖l所示，與模型對照組(沒有用二苯乙烯苦處理)比較，二苯乙烯苦處理的各組條帶面積明顯變小，灰度變淺，顯示a-突觸核蛋白的表達(dá)減少，并且隨著二笨乙烯苦濃度的增大，a-突觸核蛋白的表達(dá)逐漸減少(表l、圖l)。其中，100/mioL/L和200/imoL/L二苯乙烯苷加藥組a-突觸核蛋白的表達(dá)減少與模型對照組相比有顯著差異(PO.05)。表l.二苯乙烯爺對a-突觸核蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型a-突觸核蛋白表達(dá)的影響組別二苯乙烯苦(拜ol/L)模型對照12.52550100200條帶面積1821,3±365.11663.7±675.61504.3±849.51476.7士660.1185.0±689.7*1089.7±530.0*M士SD;*P<0.05,與模型對照組比較。試驗(yàn)例2二苯乙烯苦對過表達(dá)《-突觸核蛋白小鼠模型的抑制作用一、試驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)利用過表達(dá)a-突觸核蛋白的小鼠模型，觀察二笨乙烯苦對在體動物腦內(nèi)a-突觸核蛋白表達(dá)的影響，二、試驗(yàn)方法過表達(dá)a-突觸核蛋白的沖莫型小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，雌雄各半。喂養(yǎng)至10月齡時(shí)隨機(jī)分為4個(gè)組，其中l(wèi)個(gè)組為模型組，不給予二苯乙蜂香；其余3個(gè)組分別為二苯乙烯苷小劑量(0.05g/kg/d)組、中劑量(0.1g/kgZd)組、大劑量(0.2g/kg/d)組。二苯乙烯苷組行灌胃給藥至16月齡；模型組和正常對照組(體內(nèi)正常表達(dá)a-突觸核蛋白的10月齡小鼠)給以蒸餾水灌胃至16月齡。處理結(jié)束后，取上述5個(gè)組小鼠的腦組織，用RT-PCR法檢測小鼠a-突觸核蛋白基因表達(dá)，用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行a-突觸核蛋白蛋白表達(dá)的研究。三、試驗(yàn)結(jié)果1-二苯乙蜂苷對模型小鼠腦內(nèi)a-突觸核蛋白的基因表達(dá)的影響用RT-PCR法檢測各組小鼠腦內(nèi)a-突觸核蛋白mRNA表達(dá)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于16月齡模型小鼠海馬Z皮層cx-突觸核蛋白mRNA表達(dá)的增多，二苯乙烯苷(TSG)有明顯的抑制作用(表2)。表2.二苯乙烯苷對模型小鼠腦內(nèi)a-突觸核蛋白mRNA表達(dá)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>M±SD;Ap〈0.05,△△PO.01,模型與正常相比；*P<0.05,**P<0.01，用藥組與模型組相比2、二苯乙烯苷對模型小鼠腦內(nèi)a-突觸核蛋白的蛋白表達(dá)的影響用免疫組織化學(xué)方法檢測各組小鼠腦內(nèi)a-突觸核蛋白的蛋白表達(dá)的改變，圖像分析的結(jié)果顯示對于16月齡APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層a-突觸核蛋白表達(dá)的增加，二苯乙烯苷有明顯的抑制作用。表3.二苯乙烯苷對模型小鼠腦內(nèi)a-突觸核蛋白的蛋白表達(dá)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>M±SD;AP<0.05，△△P<0.01,模型與正常相比；*:P<0.05，**P<0.0],用藥組與模型組相比權(quán)利要求1、二苯乙烯苷或其衍生物在制備抑制α-突觸核蛋白過度表達(dá)的藥物中的用途。2、二苯乙烯苷或其衍生物在制備預(yù)防和/或治療由oc-突觸核蛋白過度表達(dá)所引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途。3、按照權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙或多系統(tǒng)萎縮。4、一種用于抑制a-突觸核蛋白過度表達(dá)的藥物組合物，其特征在于含有治療上有效量的二苯乙烯苦或其衍生物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。5、一種預(yù)防和/或治療由a-突觸核蛋白過度表達(dá)所引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物組合物，其特征在于含有治療上有效量的二苯乙烯苷或其衍生物和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。6、按照權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述的神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙或多系統(tǒng)萎縮。7、按照權(quán)利要求3或6的用途，其特征在于所述的多系統(tǒng)萎縮包括橄欖橋腦小腦萎縮、紋狀體黑質(zhì)變性、ShyDrager綜合征。8、按照權(quán)利要求1或2的用途，其特征在于所述的二苯乙烯苷衍生物是指二苯乙烯苷在3、5或4'位被d—6烷基或卣素所取代而得到的衍生物；或者是指二苯乙烯苦與可藥用有機(jī)酸或無機(jī)酸所形成的酯。9、按照權(quán)利要求8的用途，其特征在于所述的可藥用有機(jī)酸是乙酸；所述的可藥用無機(jī)酸是鹽酸。全文摘要本發(fā)明公開了二苯乙烯苷或其衍生物在抑制α-突觸核蛋白過度表達(dá)中的用途。試驗(yàn)結(jié)果表明，二苯乙烯苷或其衍生物能有效抑制α-突觸核蛋白的過度表達(dá)，可用于治療或預(yù)防由α-突觸核蛋白過度表達(dá)所引起的帕金森病、路易體癡呆、單純性自主神經(jīng)功能障礙、多系統(tǒng)萎縮等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。文檔編號A61K31/7034GK101161245SQ20071017835公開日2008年4月16日申請日期2007年11月29日優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日發(fā)明者瑩劉,蘭張,林李,魏海峰申請人:首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院