專利名稱：藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種模擬檢 測方法，具體地涉及一種藥物中可被人體吸收的微量元素 含量的模擬檢測方法。
背景技術(shù)：
微量元素與人體健康密切相關(guān)，微量元素在人體內(nèi)按照生理作用的不同可分為必 需微量元素和非必需微量元素，人體必需的微量元素包括鐵、鎂、鋅、鈣和銅等，在人體內(nèi)具 有廣泛的生理作用，如作為構(gòu)成各種生物活性酶的輔助因子，參與激素、維生素的合成，及 作為重要的電子傳遞體等，微量元素還可在藥物吸收中發(fā)揮作用，藥物配位化學(xué)學(xué)說認(rèn)為 微量元素配合物是真正的整體意義上的藥物有效成分，這其中，鐵、銅、鋅等微量元素配合 物在國內(nèi)外已用于臨床治療，又比如，鋅、鉻與黃芩苷形成的配合物的生物活性較黃芩苷提 高，療效增強，此為微量元素配合物是藥物有效性重要基礎(chǔ)的有力佐證。但另一方面，藥物安全性對人體健康至關(guān)重要，微量元素過量對機體造成損傷，乃 至致死，因此，世界衛(wèi)生組織、美國環(huán)保署、美國食品與藥物管理局高度重視微量元素的危 險性評價。中藥作為一種含有大量微量元素的載體，其微量元素分析和測定已有大量報導(dǎo)， 但大多限于總量測定，在樣品處理時則多采用固相微萃取、超臨界流體萃取、加壓液相萃 取、微波輔助萃取或固相萃取等。另外，藥物中微量元素配合物只有具有生物可給性，即可 被胃、腸等主要消化器官所攝取，吸收，通過許多生物膜，才能到達(dá)作用部分，才能發(fā)揮其藥 效，生物可給性是評價微量元素安全性和有效性重要基礎(chǔ)。目前從事微量元素形態(tài)方面的研究甚少，現(xiàn)有的“形態(tài)研究”把微量元素形態(tài)界 定為分子量分布、無機態(tài)、有機態(tài)、懸浮態(tài)、可溶態(tài)、水溶態(tài)、堿溶態(tài)、穩(wěn)定態(tài)、不穩(wěn)定態(tài)、水提 取態(tài)或超臨界CO2流體萃取態(tài)等，此類傳統(tǒng)方法依據(jù)物理、化學(xué)性質(zhì)上的差異性進(jìn)行形態(tài)分 離，沿用“純粹”、“傳統(tǒng)”的物理及化學(xué)形態(tài)概念，與生物膜的結(jié)構(gòu)特性無關(guān)、與微量元素配 合物在人體的消化和吸收情況無關(guān)，無法揭示各“形態(tài)”在生物可給性上的差異，無法為微 量元素作用機制的闡述和有效作用劑量的制定提供依據(jù)，無法為有效性和安全性評價提供 背景資料，忽視藥物系統(tǒng)原理和人體消化系統(tǒng)對形態(tài)和生物可給性的影響。目前藥物中微量元素的生物可給性評價方法有溶解性和吸收性兩類。溶解性評價 的不足之處在于，不能測定被吸收或絡(luò)合的微量元素，只能研究溶解性的非血紅素微量元 素；在吸收性評價中，化學(xué)平衡法是研究人體中微量元素吸收的較好方法，但煩瑣耗時、費 用高；全身示蹤元素計數(shù)法(whole-body counting)具有輻射危害，且測量進(jìn)藥后血漿中 微量元素含量變化對比意義不大；人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞)是近年來國外采用的一種 研究藥物經(jīng)腸吸收的體外模型，但絨毛細(xì)胞培養(yǎng)過程的操作難度較大；白鼠及其他動物活 體實驗則與人體生理環(huán)境差異較大，用其來驗證藥物的藥理效果，其準(zhǔn)確性尚存有疑問。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題。本發(fā)明可以基于藥效模擬檢測可被人體吸收的微
量元素含量。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下 藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法，包括如下的步驟1)在一容器中加入含有微量元素的藥物，而后加入模擬唾液，在36 38°C下振蕩 3 6分鐘；2)而后向上述容器中加入模擬胃液，在36 38°C下繼續(xù)振蕩1 4小時，獲得藥 物的體外胃仿生消化液；3)向步驟2中獲得的體外胃仿生消化液中加入模擬十二指腸液和模擬膽汁，在 36 38°C下繼續(xù)振蕩5 10小時，而后使用孔徑為0. 45 μ m的濾膜抽濾，獲得體外胃腸全 仿生消化液；4)取蛋黃卵磷脂，將其溶于氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液；將上述溶液移 入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使之形成均勻的多層脂質(zhì)膜，而后 向其中充入氮氣以防止多層脂質(zhì)膜被氧化；向其中加入步驟3中獲得的體外胃腸全仿生消 化液，將其加入水浴恒溫振蕩器中，在36 38°C下振蕩，使多層脂質(zhì)膜全部進(jìn)入全仿生消 化液中，而后在-80 -71°C冷凍lh，在36 38°C下融化，反復(fù)凍融3次后，得到含單層脂 質(zhì)體的凍融液，該單層脂質(zhì)體中負(fù)載有微量元素；5)依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m的濾膜抽濾凍融液，從溶液中分離獲得負(fù)載 有微量元素的單層脂質(zhì)體(單層脂質(zhì)體粒徑為0. 3 0. 35 μ m)；6)取上述制得的單層脂質(zhì)體膜放置于聚氯乙烯消解罐中，每克單層脂質(zhì)體膜依 次加入7. 5 8. 5mL濃HNO3和3. 5 4. 5mL30% H2O2，于70 90°C的水浴中預(yù)處理20 30min，待黃煙散盡，再向每克單層脂質(zhì)體膜依次加入3. 5 4. 5mL濃HNO3和1. 5 2. 5mL 30% H2O2，加蓋安全膜后，旋緊外蓋后進(jìn)入密閉微波消解系統(tǒng)消解，獲得消解液，應(yīng)用原子吸 收光譜法、紫外可見分光光度法或電感耦合等離子質(zhì)譜法對消解液中微量元素含量進(jìn)行測 定后獲得。本發(fā)明中所述的含有微量元素的藥物不涉及藥物的具體種類，可以是西藥，也可 以是中藥，一般是指需要做微量元素含量檢測的中藥。本發(fā)明建立的體外全仿生消化技術(shù)在不同消化階段按照不同消化器官在一定時 間內(nèi)分泌出的消化液的成份和量，加入相應(yīng)的仿生消化液，再根據(jù)藥物的不同劑型在人體 消化器官中的排空時間合理安排各個階段的消化時間，并模擬消化器官有規(guī)律的蠕動，建 立微量元素的模擬消化過程，以此來獲得全仿生消化液，合乎中醫(yī)藥理論的系統(tǒng)觀、整體 觀；另外，鑒于消化管和血管間的生物膜是類脂質(zhì)膜，因此，本發(fā)明建立細(xì)胞膜仿生萃取技 術(shù)，提取可與模擬細(xì)胞膜(即單層脂質(zhì)體)結(jié)合的微量元素配合物，微量元素配合物的形態(tài) 不同，靶位環(huán)境不同，親脂性和親水性不同，在生物膜上的吸收性能不同，生物可給性和藥 效必然不同，微量元素配合物對生物膜的親合性對其有效性和安全性起著關(guān)鍵作用，機體 對不同形態(tài)的微量元素配合物的吸收能力和吸收量亦不同。模擬唾液、模擬胃液，模擬十二指腸液和模擬膽汁的組成成分及制備方法可如表1 中所示表1模擬唾液、模擬胃液、模擬十二指腸液及模擬膽汁的組成成份及制備方法

“模擬唾液 模擬胃液模擬十二指腸液模擬膽汁
IOmL 15.7mL40mL 30 mL
89.6g/LKCI NaCl 175.3g/LNaCl 175.3g/L NaCl 175.3g/L
IOmL 3.0mL40mL 68.3 mL
KSCN20g/L NaH2P0488.8g/LNaHCO3 84.7g/L NaHCO3 84.7g/L
IOmL 9.2 mLIOmL 4.2 mL
NaH2P0488.8g/L KCl 89.6gKH2PO4 8g/L KCl 89.6g/L
J IOmL 18mL6.3 mL 0.2 mL
2 Na3P0457g/L CaCl2.2H20 2.2g/LKCl 89.6g/L HQ 37%g/g
= 1.7 mL IOmLIOmL IOmL
刑 NaC1175.3g/L NH4Cl 30.6g/LMgCl2 5g/L CaCl2.2H20 22.2g/L
1.8 mL 8.3 mL0.18 mL
NaOH40g/L HCl 37%g/gHCl 37%g/g
9mL
CaCl2.2H20 22.2g/L
有 8 mL IOmL4 mL
機 尿素25%/L· 葡萄糖65g/L尿素25g/L 試 IOmL 劑 葡萄糖醛酸2g/L
3.4 mL 尿素25g/L IOmL
33g/L葡萄糖胺鹽酸
鹽
生 145mga-淀粉酶Ig牛血清蛋白Ig牛血清蛋白 1.8g牛血清蛋白
物 15mg尿酸 Ig胃蛋白海3g胰酶 6g膽汁
酶 50mg粘液素 3g粘液素0.5 g脂肪酶
pH 6.5±0.2 1.07±0.077.8±0.2 8.0tt0.2 備用鹽酸或氫氧化鉀稀溶液調(diào)pH值，用超純水定容至500mL,在4·0下保存。
_Μ_
----- \根據(jù)藥物中微量元素有效作用劑量胃、腸含量的加和值(胃和腸全仿生消化 液單層脂質(zhì)體結(jié)合態(tài)金屬加和值)和微量元素日推薦允許攝入量(Reference Daily Allowance，RDA，美國食品與藥物管理局(USFDA)制定，見表2)，制訂推薦劑量，保證用藥安 全，實現(xiàn)安全性評價；據(jù)藥物中微量元素有效作用劑量胃、腸含量的加和值和微量元素日攝 入上限(Tolerable Upper Intake Level，UL，USFDA制定，見下表)，制訂限制劑量，做為危 險性評價的依據(jù)。 表2微量元素日推薦允許攝入量
\__
微量元素RDA (mg/day)UL(mg/day)
銅0.910
碘0.151.1
鐵8(男性和51歲以上女生)18(19-50歲女性) 45
銀0.0452
硒0.0550.4
鋅11 (男性)8(女性) 40 本發(fā)明中使用的蛋黃卵磷脂與全仿生消化液的重量體積比為0.005 0. 015g/1000mL，優(yōu)選為0. 01g/1000mL。蛋黃卵磷脂模擬細(xì)胞膜吸收，消化管和血管間的生 物膜是類脂質(zhì)膜，微量元素配合物只有具有細(xì)胞膜親合性，才能進(jìn)入人體，因此可用細(xì)胞膜 仿生萃取技術(shù)得出能進(jìn)入人體的微量元素的量。且0. 005 0. 015g的蛋黃卵磷脂所形成 的模擬細(xì)胞膜的體積大約為2000 6000mL，遠(yuǎn)大于IOOOmL的全仿生消化液體積，足以吸收 全部具有細(xì)胞膜親和性的微量元素配合物。
在推薦的實施例中，還包括將步驟2中獲得的體外胃仿生消化液用孔徑為 0. 45 μ m的濾膜過濾的步驟。本發(fā)明中涉及的含有微量元素的藥物可以是中藥材或中藥復(fù)方的粉劑或水煎液 等，且每日/每次給藥量的粉劑或水煎液中均含有有效劑量的藥物有效成分，在使用粉劑 時，每克粉劑中依次加入模擬唾液2. 0 3. OmL,模擬胃液90 IlOmL,模擬十二指腸液 110 135mL和模擬膽汁40 60mL ；在使用水煎液時，每mL水煎液中依次加入模擬唾液 0. 01 0. 03mL,模擬胃液0. 5 0. 7mL,模擬十二直腸液0. 7 0. 9mL和模擬膽汁0. 28 0. 35mL。另外，相對于粉劑而言，水煎劑在模擬胃液、模擬十二直腸液和模擬膽汁中的消化 時間均有所下降。本發(fā)明中所述的超純水是指將水中的導(dǎo)電介質(zhì)幾乎完全去除，又將水中不離 解的膠體物質(zhì)、氣體及有機物均去除至很低程度的水，電阻率大于18MQ*cm，或接近 18. 3MQ*cm 極限值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以單層脂質(zhì)體為細(xì)胞生物膜模型，以單層脂質(zhì)體-水分 配體系模擬藥物中的微量元素在胃、腸中的全仿生消化液分別在人體胃腸中的分配、吸收 情況，以單層脂質(zhì)體為固相萃取劑，提取負(fù)載有微量元素的單層脂質(zhì)體，而后使用消解法消 解，并應(yīng)用原子吸收光譜法、紫外可見分光光度法或電感耦合等離子質(zhì)譜法測定微量元素 含量，依此給出基于藥效角度的藥物中微量元素配合物有效作用劑量的評價新方法，模擬 檢測可被人體吸收的微量元素含量。本發(fā)明有助于微量元素配合物劑量標(biāo)準(zhǔn)的制訂，并可 用于藥物中微量元素配合物有效性、安全性、危險性評價。
具體實施例方式實施例1
按傳統(tǒng)煎煮方法獲得中藥水煎液，稱取紅花粉末300g，放入600mL的燒杯中，每次 加超純水400mL，加熱至沸騰并保持微沸約lh，煎煮三次，合并三次煎煮液并加熱濃縮，用
0.45 μ m濾膜過濾定容至IOOOmL,獲得紅花的水煎液IOOOmL 取紅花的水煎液250mL加入容量瓶中，而后向其中加入模擬唾液5mL，在37°C下恒 溫下振蕩5min ；而后加150mL模擬胃液，繼續(xù)在37°C下振蕩2h，獲得405mL體外胃仿生消 化液；在所獲得的405mL紅花水煎液體外胃仿生消化液中，加入195mL十二指腸模擬液 和75mL模擬膽汁，在37°C下繼續(xù)振蕩7h，取消化液用0. 45 μ m濾膜抽濾，獲得675mL體外 胃腸全仿生消化液；將體外胃腸全仿生消化液在4°C下恒溫保存。取0. 250mg蛋黃卵磷脂，將其溶于5mL氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液；將上 述溶液移入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)lOmin，使之形成均勻的多 層脂質(zhì)膜，而后向其中充入氮氣以防止多層脂質(zhì)膜被氧化；向其中加入上述步驟中獲得的 全仿生消化液25mL，將其加入水浴恒溫振蕩器中，在37°C下振蕩0. 5h，使多層脂質(zhì)膜全部 進(jìn)入全仿生消化液中，而后在-71 °C冷凍lh，在37°C下融化，反復(fù)凍融3次后，得到含單層脂 質(zhì)體的凍融液，該單層脂質(zhì)體中負(fù)載有微量元素；依次用孔徑為0. 45 μ m和0. 22 μ m的濾膜 抽濾所獲得的全部凍融液，從凍融液中分離獲得負(fù)載有微量元素的單層脂質(zhì)體(固體，粒 徑為0. 3 0. 35 μ m)，冷凍干燥后得到1. 25mg負(fù)載有紅花水煎液仿生消化液中微量元素的 單層脂質(zhì)體；而后重復(fù)上述步驟，每次加全仿生消化液25mL，直到675mL的胃腸全仿生消化 液都制成冷凍干燥的單層脂質(zhì)體，此時微量元素負(fù)載在單層脂質(zhì)體上，即為單層脂質(zhì)體結(jié) 合態(tài)微量元素。取上述制得的單層脂質(zhì)體膜放置于聚氯乙烯消解罐中，每克單層脂質(zhì)體膜依次加 入8. OmL濃HNO3和4. 0mL30% H2O2，于80°C的水浴中預(yù)處理20min，待黃煙散盡，再向每克 單層脂質(zhì)體膜依次加入4. OmL濃HN03、2. OmL 30% H2O2，加蓋安全膜后，旋緊外蓋，放入控 制罐，將其置于MK-III型光纖壓力自控密閉微波消解系統(tǒng)(上海新科微波溶樣測試技術(shù) 研究所)的微波爐內(nèi)的旋轉(zhuǎn)盤上，調(diào)節(jié)壓力檔2檔(IOatm)，5min;3檔(15atm)，5min ;4檔 (20atm)，5min，取出消解液，定容，于4°C下保存。應(yīng)用原子吸收光譜法測定消解液中微量 元素含量，300g紅花粉末中含有單層脂質(zhì)體結(jié)合態(tài)的Fe為6. 852mg、Mn為1. 062mg, Zn為
1.446mg。紅花水煎液胃、腸全仿生消化液單層脂質(zhì)體結(jié)合態(tài)金屬與美國日推薦量(RDA)、最 高日攝取量(UL)比較結(jié)果如表3中所示。表3紅花水煎液胃、腸全仿生消化液單層脂質(zhì)體結(jié)合態(tài)金屬與美國日推薦量 (RDA)、最高日攝取量(UL)比較
權(quán)利要求
藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法，包括如下的步驟1)在一容器中加入含有微量元素的藥物，而后加入模擬唾液，在36～38℃下振蕩3～6分鐘；2)而后向上述容器中加入模擬胃液，在36～38℃下繼續(xù)振蕩1～4小時，獲得藥物的體外胃仿生消化液；3)向步驟2中獲得的體外胃仿生消化液中加入模擬十二指腸液和模擬膽汁，在36～38℃下繼續(xù)振蕩5～10小時，而后使用孔徑為0.45μm的濾膜抽濾，獲得體外胃腸全仿生消化液；4)取蛋黃卵磷脂，將其溶于氯仿中，獲得蛋黃卵磷脂的氯仿溶液；將上述溶液移入具塞的圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使之形成均勻的多層脂質(zhì)膜，而后向其中充入氮氣以防止多層脂質(zhì)膜被氧化；向其中加入步驟3中獲得的體外胃腸全仿生消化液，將其加入水浴恒溫振蕩器中，在36～38℃下振蕩，使多層脂質(zhì)膜全部進(jìn)入全仿生消化液中，而后在 80～ 71℃冷凍1h，在36～38℃下融化，反復(fù)凍融3次后，得到含單層脂質(zhì)體的凍融液，該單層脂質(zhì)體中負(fù)載有微量元素；5)依次用孔徑為0.45μm和0.22μm的濾膜抽濾凍融液，從溶液中分離獲得負(fù)載有微量元素的粒徑為0.3～0.35μm的單層脂質(zhì)體；6)取上述制得的單層脂質(zhì)體膜放置于聚氯乙烯消解罐中，每克單層脂質(zhì)體膜依次加入7.5～8.5mL濃HNO3和3.5～4.5mL30％H2O2，于70～90℃的水浴中預(yù)處理20～30min，待黃煙散盡，再向每克單層脂質(zhì)體膜依次加入3.5～4.5mL濃HNO3和1.5～2.5mL30％H2O2，加蓋安全膜后，旋緊外蓋后進(jìn)入密閉微波消解系統(tǒng)消解，獲得消解液，應(yīng)用原子吸收光譜法、紫外可見分光光度法或電感耦合等離子質(zhì)譜法對消解液中微量元素含量進(jìn)行測定后獲得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法，其 特征在于所使用的蛋黃卵磷脂與全仿生消化液的重量體積比為0. 005 0. 015g/1000mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法，其 特征在于所使用的蛋黃卵磷脂與全仿生消化液的重量體積比優(yōu)選為0. 01g/1000mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3中所述的藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測 方法，其特征在于還包括將步驟2中獲得的體外胃仿生消化液用孔徑為0. 45 μ m的濾膜過 濾的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3中所述的藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測 方法，其特征在于所述的藥物為粉劑，每克粉劑中所依次加入的模擬唾液為2. 0 3. OmL, 模擬胃液為90 IlOmL,模擬十二指腸液為110 135mL，模擬膽汁為40 60mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3中所述的藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測 方法，其特征在于所述的藥物為水煎液，每HiL水煎液中所依次加入的模擬唾液為0. 01 0. 03mL,模擬胃液為0. 5 0. ImL,模擬十二直腸液為0. 7 0. 9mL和模擬膽汁為0. 28 0.35mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種藥物中可被人體吸收的微量元素含量的模擬檢測方法，它主要包括以下的步驟在不同消化階段按照不同消化器官在一定時間內(nèi)分泌出的消化液的成份和量，加入相應(yīng)的仿生消化液(模擬唾液、模擬胃液、模擬十二指腸液和模擬膽汁)，再根據(jù)藥物不同劑型在人體消化器官中的排空時間合理安排各個階段的消化時間，獲得全仿生消化液；而后以單層脂質(zhì)體-水分配體系模擬全仿生消化液在人體胃腸中的分配、吸收情況，得到負(fù)載有微量元素的單層脂質(zhì)體，而后使用消解法消解，并測定微量元素含量，依此給出基于藥效角度的藥物中微量元素配合物有效作用劑量的評價新方法，模擬檢測可被人體吸收的微量元素含量。
文檔編號G01N1/28GK101968480SQ200910112738
公開日2011年2月9日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者李順興, 鄭鳳英 申請人:漳州師范學(xué)院