專利名稱：通過注射到流動溶劑中測定溶液中分子的平均性質(zhì)的方法
通過注射到流動溶劑中測定溶液中分子的平均性質(zhì)的方法
背景技術：
0001溶液中的分子一般被表征為其重均摩爾質(zhì)量M、其均方半 徑々/〉 = p鈿/p附(這里r是與該分子的質(zhì)心的距離并且^n是那
個距離處的小體積的質(zhì)量)和第二位力系數(shù)(維里系數(shù)，virial coefficient)」2。在一些情況中，第三位力系數(shù)^也是關心的。在其它 情況中，兩個截然不同的分子A和B之間的交叉位力系數(shù)j/s是關心 的。M和々/〉是溶液中全部分子求平均的單個分子的性質(zhì)，位力系數(shù) 是溶劑所介導的分子間平均相互作用的度量。對于未分級的溶液來說， 這些性質(zhì)可以通過利用Bruno Zimm在他1948年學術論文(seminal 1948 paper)——其出現(xiàn)在Journal of Chemical Physics,第16巻，第 1093至1099頁——中描述的方法測量它們散射光的方式而測定。從小 體積的溶液中散射的光在一定范圍的角度和濃度內(nèi)進行測量。在一定 范圍的散射角內(nèi)光散射數(shù)據(jù)的收集更常見地被稱為多角度光散射， MALS。由單一種類分子的光散射測量得到的性質(zhì)通過Zimm研究的方 程表達并且由W.A. J. Bryce在Po(ym" 10 804-809 (1969)進行修正 * (c，0) = Mc尸(。-2^2 [M，)c]2 -[342(。-《M戶2 (。][MP(6>)]2 c3 (1)
其中/ ,，0=/^,0/尺*， i (c，0是每單位立體角在方向0上所測量的超瑞 利比(excess Rayleigh ratio),其被定義為i ((9)=[/,(0-/,。/v(6^2/[/0KJ， /,(0是溶液所散射的光的強度，其為角的函數(shù)，/,。/v(0作為角的函數(shù)是 從溶劑中散射的光的強度，/。是入射強度，r是從散射體積到檢測器的 距離，r是檢測器所見的照明體積，尺=4兀2 "浐/f^義力，并且尺* = 7q^"/c/c)2， A^是阿伏加德羅常數(shù)(Avogadro's number), ^/dc是折光率 增量，"。是溶劑折光率，并且々是真空中入射光的波長。iY②是散射分 子的形狀因子，其被定義為尸(^="^^及W/i 仰。尸(^的一般形式通 過R Debye在J. Phys. Colloid Chem., 51 18 (1947)得到，為
，=1-尸>2〔昏、
+尸，sin
"、
^+尺 (2)
2 乂A與均方半徑有關A
,)2
并且A-2;z/A，其中義是溶劑中入射
光的波長。尸2與均方半徑々g、和均四次方半徑(the mean quadri-radius)
< 4>有關P2= ! iorg" - 3〈 "。該方程是基于濃度和sin2(6>/2)
的冪的級數(shù)展開的近似；因為如此，精確程度取決于高次項的相對大 小。進行該測試的標準方法，也被稱為"平穩(wěn)方法(平臺方法 plateau method)",涉及制備一系列具有增加濃度的已知值的樣品；將 樣品順序地導入MALS檢測器，不管是通過在光束中插入含有該樣品 的玻璃瓶還是通過將樣品注射到位于該光束中的流動池中；借助光檢 測器獲得每個角度處的散射強度；計算每個濃度和角度的超瑞利比； 并且將該數(shù)據(jù)擬合到方程(1)以求出M、 <r/〉、 ^和爿3。
來W)
《
d"、
+
乂c c^ 乂
(3)
0012各種種類的在線濃度檢測器是已知的，其包括紫外可見吸 光度、熒光和差示折光率dRI檢測器。dRI檢測器與光散射測量聯(lián)合是 特別有用的，并且足夠通用以測量寬范圍的可溶性大分子。dRI測量的 一個缺點是需要相對于溶劑完全透析蛋白樣品，這恰恰因為dRI檢測 器對可能存在于蛋白樣品但不存在于純緩沖液的鹽和賦形劑以及溶解 的氣體敏感。圖4是溶解于PBS的BSA的傳統(tǒng)席姆圖，其基于圖3的 平穩(wěn)數(shù)據(jù)和通過將平穩(wěn)方法應用于圖4的數(shù)據(jù)而進行的標準分析。 1.1理論描述2Avmj;和 光散射峰,j
光散射蜂,j
方程(5)可被重寫為
M
2」22^ . 2「。
「"尸2 . 4
一,——^sin一
34 44
5_
兄 —組初始濃度d、 c2、 ... q的樣品按順序注射到一組檢測 器中~~MALS檢測器，其包含多個角度沐下的光檢測器，以及濃度 檢測器，諸如
圖1中所示。MALS檢測器的 一 個實例是DAWN-HELEOS，來自Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA，濃度檢測器的實例是Optilab rEX，也來自Wyatt Technology Corporation。在一般的實施方式中，濃度系列符合cm=mZlc，其中m取 1至n的整數(shù)值并且Zlc是固定的濃度躍遷(concentration step)。真實的 峰濃度將因為在流過該系統(tǒng)過程中樣品峰稀釋和變寬，與初始值不同。 借助泵使得樣品連續(xù)流過檢測器。隨著樣品穿過檢測器，數(shù)據(jù)由進行 前述擬合程序的計算機從檢測器中獲得，儲存并且分析。在圖1所示的被稱為"注射閥方法"的第一實施方式中， 溶劑通過泵工具1從溶劑儲罐2中抽出穿過脫氣裝置3，并且然后泵過 過濾工具4進入注射閥11并且通到檢測器8和9中。脫氣裝置3 —般 用于從溶劑中去除溶解的氣體，因為這種氣體可能隨后在溶液中產(chǎn)生 可能干擾溶液本身期望測量的小氣泡。過濾工具4 一般如所示被并入 以便從所述溶劑中去除可能干擾期望測量的殘余顆粒物質(zhì)。泵工具的 一個實例是型號G1310等度泵(恒溶劑泵，isocratic pump)，其來自 Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA。脫氣裝置的實例是Systec多 通道真空脫氣裝置(Systec Multi-Channel Vacuum Degasser)，其可從 Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA得到。溶劑穿過設定在旁路位置的 注射閥ll，以便溶劑沒有流過樣品回路12。注射閥的實例是型號7725 分析注射器，其也來自Upchurch Scientific樣品5的等分試樣一一其 重均摩爾質(zhì)量、均方半徑以及第二和第三位力系數(shù)通過本發(fā)明的方法 得到—通過注射器工具6轉(zhuǎn)移到樣品回路12中。當樣品轉(zhuǎn)移完成時，
注射閥換到注射位置以便溶劑流過樣品回路12，這樣溶劑將樣品攜帶 至檢測器8和9。不同濃度可以預先制備并且手工注射到樣品回路中。 可選地，它們可以預先制備并且借助自動取樣器注入。在優(yōu)選的實施 方式中，商業(yè)自動取樣器諸如1329A——其也來自Agilent Technologies, Inc——被設定程序以通過在小瓶中混合不同體積的儲備溶液和溶劑而 從樣品儲備溶液中產(chǎn)生多種濃度。在另一優(yōu)選實施方式中，多種濃度 通過對自動取樣器設定程序以將不同體積的儲備溶液直接注射到樣品 回路中而產(chǎn)生，其中樣品回路被充以溶劑，并且注射體積小于回路體 積，以至于通過在樣品回路中混合而發(fā)生稀釋。優(yōu)先地，樣品濃度將 跨越一個數(shù)量級或更大。0041在圖2所示的被稱為"復式泵方法"的第二實施方式中， 兩臺計算機控制的泵21a禾卩21b——例如Microlab 500 Dual-Syringe Diluter/Dispenser(復式注射稀釋器/分配器)，Hamilton Corp., Reno, NV， 其包括兩個獨立的可控注射泵(syringe pump)——被用于從樣品儲罐22 抽出樣品以及從溶劑儲罐23抽出溶劑。這些被轉(zhuǎn)移穿過脫氣裝置室 24a和24b，并且被泵過過濾器25a和25b。這兩臺泵的流速借助計算 機進行調(diào)節(jié)，并且這些流被混合并且被泵過混合室——例如Hypershear 軸向靜態(tài)混合器，其可從Analytical Scientific Instruments, El Sobrante， CA得到——以便產(chǎn)生期望濃度的連續(xù)樣品流?；旌虾蟮臉悠房梢员粫?時儲存在保留體積(holding volume) 26中，其包括混合室、管道、脫 鹽柱及可能需要的任何其它體積。在期望體積的混合樣品已經(jīng)被注射 到所述保留體積中后，停止樣品儲備溶液的流動，并且通過泵21a泵 溶劑，以便讓樣品以期望流速從所述保留體積流過檢測器。優(yōu)選的稀 釋范圍如前述實施方式。
0042對本領域技術人員來說顯然的是，第三實施方式按照復式 泵方法用一對泵將混和樣品注射到樣品回路將產(chǎn)生序貫樣品濃度，并 且按照注射閥方法在切換注射閥后通過其它泵工具將樣品推送至檢測 器。 1.3該方法的實施例第二種方法是本發(fā)明的目的。同樣的樣品濃度通過復式泵 方法進行注射，每次注射只使用200 ^，所以流動池沒有完全被充滿并 且沒有達到平穩(wěn)。數(shù)據(jù)顯示在圖5中。它表明90°光散射信號29與dRI檢測器信號30疊加。兩者都已經(jīng)減去基線。從每次注射計算出cw、 A,w、 A,w和Aw。采用線性最小二乘方擬合方法對方程(6)所得的擬 合顯示在圖6中。所得到的結(jié)果是M= 66,700 ± 0.03 kD以及& = 1.17 ±0.01 xlO"mol.mL/g2。這些值與用平穩(wěn)方法獲得的那些值非常一致。
0051] 2.0兩種類表征 [00522.1理論描述
0053對于溶劑中存在的兩種非相關大分子種類來說，濃度中上 至二階的光散射方程，由方程7給出
<formula>formula see original document page 15</formula>對光散射領域的技術人員來說明顯的是，我們己經(jīng)發(fā)明并 描述的方法存在許多顯而易見的變化，這沒有脫離為其實施我們所列 的基本要素；所有這些變化僅僅是上文所述發(fā)明顯而易見的實現(xiàn)方式 并且通過參考下面的權(quán)利要求書而被包括在內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種測定溶劑中分子的溶液的平均分子性質(zhì)的方法，其包括下列步驟A. 提供所述溶劑的儲罐；B. 提供所述溶液的儲罐；C. 用所述溶劑采用稀釋工具從所述儲罐制備一系列所述溶液的n稀釋液Dm(m＝1，n)；D. 提供取樣工具，通過所述取樣工具所述稀釋液Dm(m＝1，n)被按順序注射并且使其逐次流過a. 光散射檢測器，其收集在所述稀釋液Dm(m＝1，n)的每個增加的注射體積Δvi下在多個q角度θk(k＝1，q)散射的光；b. 濃度檢測器，其測量在所述稀釋液Dm(m＝1，n)的每個增加的注射體積Δvi下相應的分子濃度cmi(m＝1，n)；和E. 從在每個流動體積增加的間隔Δvi下測量的散射光強度和所述相應的分子濃度cmi中產(chǎn)生相關的超瑞利比R(θk，cmi)；F. 在各個所述稀釋液m的整個洗脫中，從所述收集的濃度數(shù)據(jù)值cmi計算與所述稀釋液Dm相應的n個和其中m＝1至n；G. 從所述產(chǎn)生的超瑞利比R*(θk，cmi)計算與所述n個稀釋液相應的3qm超瑞利比和，(k＝1，q；m＝1，n)，和H. 通過用下列方程擬合所述數(shù)據(jù)從所述3qn超瑞利比和獲取所述分子溶液的所述平均性質(zhì)其中n0是溶劑的折光率，并且λ0是所述光散射檢測器的入射真空波長。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分子溶液的所述平均性質(zhì)是重均 摩爾質(zhì)量M、均方半徑〈《〉、第二位力系數(shù)A、第三位力系數(shù)^和均四次方半徑化〉。
全文摘要
提供一種測量未分級的大分子溶液的分子性質(zhì)的新方法?？缭揭欢舛确秶臉悠返确衷嚇颖豁樞虻刈⑸涞饺芤毫髦胁⑶伊飨驒z測器。由此每等分試樣產(chǎn)生有效的“峰”，其要素相應于不同濃度的稀釋的等分試樣。溶液中大分子的重均摩爾質(zhì)量、均方半徑和第二位力系數(shù)是由整個相應峰中散射信號的角度和濃度依賴性分析而得到的。與較早的在線方法相比，在使用較小量樣品時，獲得更佳的準確度。還提供用于測定兩種截然不同種類的大分子之間的交叉位力系數(shù)的類似方法。
文檔編號G01N21/53GK101520414SQ200910118078
公開日2009年9月2日 申請日期2009年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日
發(fā)明者D·I·薩姆, S·P·特拉伊諾夫 申請人:懷亞特技術公司