專利名稱：：改進(jìn)的通過(guò)顆粒結(jié)合來(lái)檢測(cè)靶分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)利用小珠(優(yōu)選易于檢測(cè)的聚集小珠)以及各種物理化學(xué)方法來(lái)對(duì)特異的分子間相互作用，例如核酸雜交、抗原-抗體反應(yīng)、受體-配體相互作用以及其它特異分子間相互作用進(jìn)行檢測(cè)和定量。本發(fā)明廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、軍用和民用工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及科學(xué)研究。
背景技術(shù)：
：核酸雜交、抗原-抗體反應(yīng)和受體-配體結(jié)合是分子間相互作用的實(shí)例，由于相互作用的特異性，使其在鑒別或檢測(cè)這些物質(zhì)時(shí)具有重要的價(jià)值。這些特異的分子間相互作用可以通過(guò)具有不同靈敏度和特異性的涉及靶分子或信號(hào)擴(kuò)增的各種方法來(lái)檢測(cè)。抗原-抗體反應(yīng)的擴(kuò)增基于信號(hào)放大，例如通過(guò)酶反應(yīng)。核酸既可以通過(guò)信號(hào)》文大也可以通過(guò)聚合酶《連式反應(yīng)(PCR)的靶擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。雖然PCR非常靈敏，但其費(fèi)力而且無(wú)法穩(wěn)定地保持準(zhǔn)確性。此外，由于PCR要求變性、退火和延伸的多次循環(huán)，至少需要一個(gè)小時(shí)。近來(lái)，實(shí)時(shí)PCR改進(jìn)了終點(diǎn)檢測(cè)，從而減少了完成整個(gè)過(guò)程的時(shí)間。然而，仍然需要進(jìn)行循環(huán)。除此之外，在等溫環(huán)境中引入了增強(qiáng)靶核苷酸擴(kuò)增的靈敏度和特異性的技術(shù)。因此，理想的情況是開發(fā)出一種無(wú)需靶擴(kuò)增并能提高靶分子檢測(cè)速度的簡(jiǎn)單和廉價(jià)方法和儀器。發(fā)明概述本發(fā)明提供了檢測(cè)或鑒定微量靶分子以及測(cè)定溶液中生物分子濃度的方法。這些方法是基于大分子相互之間的特異親合力，例如互補(bǔ)核酸分子之間的Watson-Crick結(jié)合以及抗原-抗體結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，合成一對(duì)與靶分子具有高親合力和特異性的探針。其中一個(gè)探針結(jié)合到固相表面上，另一個(gè)探針結(jié)合到由各種材料制成的顆粒("小珠")上，優(yōu)選的是鐵磁和金屬顆粒。這些小珠既可以是可溶性的也可以是不溶性的。在靶分子存在的情況下，連接到一個(gè)探針上的小珠進(jìn)一步與靶分子的一部分結(jié)合。連接到固相表面上的另一個(gè)探針則與靶分子的其它部分結(jié)合。這樣，靶分子就夾在功能化小珠和功能化固相表面之間。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案，檢測(cè)懷疑含有靶分子的樣品中的靶分子的方法包4舌將能與靶分子的一部分相連的第一種探針分子連接到小珠上，從而形成小珠結(jié)合探針；將能與靶分子其他部分相連的第二種探針分子連接到支持物上，從而形成支持物結(jié)合探針；使樣品與小珠結(jié)合探針和支持物結(jié)合探針接觸，并使靶分子與所述小珠結(jié)合探針和所述支持物結(jié)合探針結(jié)合，以便使耙分子夾在支持物和小珠之間，并使小珠附著到支持物上；檢測(cè)支持物上小珠的存在情況，其中支持物上小珠的檢測(cè)結(jié)果表明了樣品中靶分子的存在情況。根據(jù)本發(fā)明，小珠可以利用它對(duì)光的作用來(lái)進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)。當(dāng)一束激光照射到反射表面例如支持物上時(shí)，它會(huì)被完全反射回來(lái)，而反射激光可以通過(guò)沿預(yù)定的反射光路經(jīng)過(guò)適當(dāng)設(shè)置的傳感器來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在暗材料例如黑色非反射小珠聚集體存在時(shí)，僅有少量的激光被反射回去一由于光分散到不同方向上而使反射光減弱。相反的效應(yīng)也可以類似地應(yīng)用于小珠的檢測(cè)，例如在非反射表面上存在反射小珠的情況下，會(huì)產(chǎn)生一些反射至傳感器的光。因此，表面上小珠的存在或缺失可以通過(guò)將一束激光發(fā)射至表面上并考察反射激光強(qiáng)度的變化來(lái)進(jìn)行判斷。在該方法中，二進(jìn)制輸出信號(hào)0，在小珠存在時(shí)變成二進(jìn)制信號(hào)1，反之亦然。為了使檢測(cè)小珠變得更方便，在檢測(cè)之前小珠可以被聚集起來(lái)。在靶分子和探針相互作用后，可以將未結(jié)合的小珠以及其它試劑和樣品去除以便消除噪音。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用靶分子與一對(duì)分子探針之間的特異性相互作用來(lái)檢測(cè)或鑒定痕量靶分子的儀器，其中該對(duì)分子探針中的一個(gè)探針與小珠相連。該儀器包括小珠結(jié)合探針，其含有與能夠和靶分子的一部分相連的第一種探針分子相連接的小珠；支持物結(jié)合探針，其含有與能夠和靶分子的另一部分相連的第二種探針分子相連接的支持物；用于使樣品與小珠結(jié)合探針和支持物結(jié)合探針接觸并使靶分子與所述小珠結(jié)合探針和所述支持物結(jié)合探針結(jié)合的裝置，以便使把分子被夾在支持物和小珠之間，并使小珠連接到支持物上；以及用于檢測(cè)支持物上小珠的存在情況的裝置，其中支持物上小珠的檢測(cè)結(jié)果代表了樣品中耙分子的存在情況。該儀器的優(yōu)選技術(shù)方案是將本發(fā)明中生物芯片微陣列沿著小型化常規(guī)光盤的軌跡排布，用常規(guī)技術(shù)將生物芯片的內(nèi)容和地址信息烙制(burninto)在光盤表面上。常規(guī)光盤通過(guò)沿著起始自光盤中心的連續(xù)螺旋形軌跡嵌入一系列的反射性和非反射性元件來(lái)存貯二進(jìn)制數(shù)據(jù)。當(dāng)光盤沿著它的中心軸旋轉(zhuǎn)時(shí)，隨著激光對(duì)嵌入的元件進(jìn)行掃描時(shí)，聚焦在軌跡上的激光束就會(huì)被反射或散射。適當(dāng)放置的光敏二極管接收反射激光或減弱了的反射光，從而閱讀出光盤上的二進(jìn)制數(shù)據(jù)。烙制常規(guī)光盤的過(guò)程一般包括利用比閱讀激光強(qiáng)且不同的激光發(fā)出的熱能來(lái)改變嵌入介質(zhì)的反射性。根據(jù)本發(fā)明，儀器可以有結(jié)合了不同探針的多個(gè)孔，以便檢測(cè)或鑒定不同的分子。為了對(duì)同一分子的不同數(shù)量進(jìn)行定量，儀器可以帶有結(jié)合了不同數(shù)量的同種探針的多個(gè)所述孔。為了保證質(zhì)量，儀器至少帶有兩個(gè)具有等量的同類型結(jié)合探針的孔，以便用于質(zhì)量控制，例如在同樣的支持物上可以制造兩個(gè)或多個(gè)同樣的生物芯片。當(dāng)多個(gè)相同的生物芯片上進(jìn)行多次閱讀對(duì)比，這一措施可以彌補(bǔ)制造缺陷、灰塵污染和其它不可預(yù)見的技術(shù)故障，進(jìn)一步確保了統(tǒng)計(jì)計(jì)算結(jié)果的"可信程度"。為了進(jìn)一步使檢測(cè)更方便，儀器還可以帶有用于聚集結(jié)合在支持物上小珠的裝置。例如，產(chǎn)生磁場(chǎng)的物體可以使未磁化的鐵磁小珠磁化，從而使它們聚集在一起。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一些提高在生物芯片表面上結(jié)合的小珠數(shù)量的方法，以便在靶分子極少的情況下提供另一層次的信號(hào)擴(kuò)增。這些方法包括》茲《連反應(yīng)(MagneticChainReaction)l斤方法和其它可能的方法，例》口通過(guò)添力口連接的DNA雙鏈來(lái)聚集用寡核苦探針功能化的金微粒(美國(guó)專利文獻(xiàn)6261944)、通過(guò)添加親和素或鏈親和素來(lái)聚集生物素化的小珠或反之亦然、通過(guò)添加免疫球蛋白二聚體或多聚體來(lái)聚集連接了葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白的小珠、通過(guò)多價(jià)抗生物素抗體來(lái)聚集生物素化的小珠以及其它來(lái)自免疫分析的方法。一分子的鏈親和素具有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。將鏈親和素加入到表面連接了生物素的小珠的懸浮液或溶液中會(huì)導(dǎo)致小珠之間的交聯(lián)，從而引起聚集。同樣地，多價(jià)免疫球蛋白分子在與小珠表面上的特異分子(例如生物素)結(jié)合時(shí)會(huì)使小珠連接，從而導(dǎo)致小珠聚集。磁鏈反應(yīng)是磁體在其磁場(chǎng)影響下自發(fā)聚集的現(xiàn)象。在本發(fā)明中，如果采用未磁化的鐵磁材料構(gòu)建小珠，那么小珠磁化將會(huì)導(dǎo)致小珠自然聚集。該過(guò)程可以要求或不要求微擾以幫助溶解性小珠的沉淀。對(duì)于不溶性的小珠，僅僅需要輕微的攪動(dòng)就可以使小珠聚集。一旦小珠在磁力的影響下聚集起來(lái)，檢測(cè)它們就變得容易多了。根據(jù)本發(fā)明，固體表面上小珠的存在情況可以利用小珠的物理特性用各種方法進(jìn)行檢測(cè)。相應(yīng)地，如果小珠是金屬的，可通過(guò)外部磁場(chǎng)在其中感應(yīng)可檢測(cè)的磁場(chǎng)(金屬檢測(cè))。如果小珠是鐵磁材料制成的，可以通過(guò)首先被〃磁化然后再檢測(cè)小珠的^f茲場(chǎng)而得到檢測(cè)。鐵^磁小珠也可以通過(guò)施加快速變化的外部磁場(chǎng)而被加熱，同時(shí)機(jī)器的非鐵磁金屬和非金屬元件則不被加熱。這樣加熱的小珠產(chǎn)生的紅外線會(huì)增加，然后通過(guò)靈敏的紅外線傳感器或以下任意一種方法進(jìn)行一企測(cè)1、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光增強(qiáng)?；瘜W(xué)反應(yīng)可通過(guò)提高溫度而加速。酶反應(yīng)也可以通過(guò)不使酶變性的一定溫度范圍內(nèi)增加熱能而加速。引起發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)例如化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光反應(yīng)可通過(guò)提高溫度來(lái)加速，從而導(dǎo)致光輸出強(qiáng)度的增加。這種光輸出的增加可以用光敏二極管檢測(cè)。2、如果采用熱發(fā)光材料包被小珠，那么加熱小珠就可以散發(fā)出能被檢測(cè)的光。3、上述反應(yīng)產(chǎn)生的光可被用來(lái)"泵擊(pump)"激光，從而通過(guò)光放大的方式產(chǎn)生出更大的、更易于檢測(cè)的光信號(hào)。生物芯片表面上鐵磁小珠的存在情況也可以通過(guò)先磁化它們，然后采用靈敏的聲學(xué)設(shè)備在變化的外部磁場(chǎng)來(lái)回晃動(dòng)(flip)它們時(shí)傾聽其聲學(xué)變化從而進(jìn)行一企測(cè)。這類似于巴克豪森(Barkhausen)效應(yīng)，其不同之處在于小珠的聚集體是多個(gè)獨(dú)立磁體而不是一個(gè)磁體。應(yīng)用包括(但;;限于)分、子濃度的觀i定:^傳:用例如突變檢測(cè):單核苷酸多態(tài)性(SNP)分布、重復(fù)核酸序列的計(jì)數(shù)及其應(yīng)用、腫瘤的診斷和分子分類、基因表達(dá)分析、蛋白組和藥物篩選。本發(fā)明的其它目的和特性將在結(jié)合相應(yīng)附圖的詳細(xì)說(shuō)明中變得清楚明了?？梢岳斫獾氖?，附圖僅僅是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍通過(guò)權(quán)利要求來(lái)限定。進(jìn)一步應(yīng)當(dāng)理解的是附圖不一定嚴(yán)格按尺寸要求，除非另有說(shuō)明，它們僅僅是用來(lái)概念性地說(shuō)明本文所要描述的結(jié)構(gòu)和過(guò)程。更具體地，本發(fā)明涉及1、檢測(cè)樣品中靶分子的方法，該樣品懷疑含有靶分子，該方法包括將能與靶分子的一部分連接的第一探針分子連接到小珠上，從而形成小珠結(jié)合探針；將能與靶分子的第二部分連接的第二探針分子連接到支持物的預(yù)定區(qū)域上，從而形成支持物結(jié)合探針；使樣品與小珠結(jié)合探針和支持物結(jié)合探針接觸，并使靶分子與所述小珠結(jié)合探針和所述支持物結(jié)合探針相結(jié)合，以便使靶分子夾在支持物和小珠之間，并使小珠連接到支持物上；為支持物提供轉(zhuǎn)動(dòng)；檢測(cè)旋轉(zhuǎn)支持物預(yù)定區(qū)域上小珠的存在情況，其中支持物上小珠的檢測(cè)結(jié)果代表了樣品中靶分子的存在情況。2、項(xiàng)l的方法，其中在樣本中檢測(cè)出至少兩種不同的靶分子。3、項(xiàng)1的方法，其中一個(gè)靶分子至少祐)險(xiǎn)測(cè)兩次。4、項(xiàng)l的方法，其中進(jìn)一步包括在檢測(cè)支持物上小珠的存在情況之前將未結(jié)合的小珠去除的步驟。5、項(xiàng)1的方法，其中小珠結(jié)合探針的數(shù)量多于樣品中靶分子的數(shù)量。6、項(xiàng)l的方法，其中進(jìn)一步包括將未結(jié)合到支持物上的小珠聚集到連接到支持物上的小珠周圍的步驟。7、項(xiàng)6所述方法，其中聚集小珠的步驟包括選擇消磁的黑色非反射性小珠用來(lái)制備所述小珠結(jié)合探針；在所述靶分子與所述小珠結(jié)合探針和所述支持物結(jié)合探針結(jié)合之后采用磁場(chǎng)磁化所述小珠；開始聚集所述磁化小珠；并且將沒有連接到所述支持物上的小珠去除。8、項(xiàng)7所述方法，其中檢測(cè)聚集磁化小珠存在情況的步驟包括給所述小珠聚集體施加波動(dòng)磁場(chǎng)；檢測(cè)由所述小珠聚集體產(chǎn)生的聲學(xué)信號(hào)。9、項(xiàng)6所述方法，其中所述聚集步驟包括在小珠上結(jié)合化學(xué)成分；在所述靶分子與所述小珠結(jié)合探針和所述支持物結(jié)合探針發(fā)生所述結(jié)合之后，加入帶有多個(gè)同樣的與所述化學(xué)成分具有高度親合力并特異性結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)的化學(xué)試劑，以便使支持物上的小珠進(jìn)行化學(xué)結(jié)合并聚集起來(lái)。10、項(xiàng)9所述方法，其中化學(xué)成分是生物素，化學(xué)試劑是親和素或鏈親和素。11、項(xiàng)9所述方法，其中化學(xué)成分是生物素，化學(xué)試劑是IgM抗生物素抗體。12、項(xiàng)9所述方法，其中化學(xué)成分是葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白，化學(xué)試劑是免疫球蛋白二聚體或多聚體。13、項(xiàng)1的方法，其中檢測(cè)支持物上小珠存在情況的步驟包括使支持物具有光反射性表面；將激光直射到反射性支持物上；監(jiān)控激光的反射情況，以便檢測(cè)由于支持物反射性區(qū)域上存在非反射性小珠而引起的激光減弱并以此檢測(cè)支持物上小珠的存在情況。14、項(xiàng)7所述方法，其中檢測(cè)支持物上小珠存在情況的步驟包括提供具有光反射性表面的支持物；將激光直射到反射性支持物上；監(jiān)控激光的反射情況，以便檢測(cè)由于支持物反射性區(qū)域上存在非反射性小珠而引起的激光減弱并以此檢測(cè)支持物上小珠的存在情況。15、項(xiàng)1的方法，其中小珠含有金屬成分，并且所述支持物上小珠存在情況的檢測(cè)步驟包括給小珠施加外部;茲場(chǎng)，以便誘導(dǎo)小珠產(chǎn)生對(duì)抗的磁場(chǎng)；檢測(cè)誘導(dǎo)磁場(chǎng)的存在，以便檢測(cè)支持物上小珠的存在情況。16、項(xiàng)1的方法，其中小珠含有鐵磁成分，并且所述支持物上小珠存在情況的檢測(cè)步驟包括磁誘導(dǎo)支持物上的小珠發(fā)熱；并且檢測(cè)由發(fā)熱的小珠所發(fā)出的紅外線輻射，以便檢測(cè)支持物上小珠的存在情況。17、項(xiàng)16所述方法，其中輻射通過(guò)紅外線傳感器來(lái)檢測(cè)。18、項(xiàng)16所述方法，其中小珠通過(guò)快速變化的磁場(chǎng)而被加熱。19、項(xiàng)16所述方法，其中將熱發(fā)光劑加入到支持物上的小珠上，由發(fā)熱的小珠發(fā)出的輻射使熱發(fā)光劑發(fā)出可以由光敏二極管檢測(cè)的光。20、項(xiàng)16所述方法，其中將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光劑加入到支持物上小珠的周圍，由發(fā)熱的小珠產(chǎn)生的熱能使化學(xué)反應(yīng)速度加快以及發(fā)出的光增強(qiáng)，該光可以由光敏二極管沖企測(cè)。21、項(xiàng)19所述方法，其中發(fā)出的光用于泵擊激光，從而放大了發(fā)出的光信號(hào)。22、項(xiàng)20所述方法，其中發(fā)出的光用于泵擊激光，從而放大了發(fā)出的光信號(hào)。23、項(xiàng)1的方法，其中支持物含有與至少第二探針分子相關(guān)的機(jī)可讀的信息，該信息被包含在連接第二探針分子的支持物表面上的離散區(qū)域中。24、項(xiàng)23所述方法，其中機(jī)可讀的信息包含連接到支持物上的至少一個(gè)探針分子的特性。25、項(xiàng)23所述方法，其中機(jī)可讀的信息包含與多個(gè)探針分子連接到支持物表面的過(guò)程相關(guān)的信息。26、項(xiàng)23所述方法，其中機(jī)可讀的信息包含與采用多個(gè)探針分子相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件相關(guān)的信息。27、項(xiàng)23所述方法，其中機(jī)可讀的信息包含與采用多個(gè)探針分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)的信息。28、項(xiàng)23所述方法，其中機(jī)可讀的信息是數(shù)字的。29、項(xiàng)1的方法，其中進(jìn)一步包括確定樣品中耙分子濃度的步驟基于在至少兩種不同濃度的靶分子存在的情況下，在支持物上存在的可檢測(cè)小珠數(shù)量差異的基礎(chǔ)上。30、一種用于檢測(cè)樣品中的靶分子的儀器，該樣品懷疑含有靶分子，該儀器包括小珠結(jié)合探針，含有與能夠和靶分子的一部分相連的第一探針分子相連接的小珠；位于支持物預(yù)定區(qū)域的支持物結(jié)合探針，含有與能夠和靶分子的另一部分相連的第二探針分子相連接的支持物；用于使樣品與小珠結(jié)合探針和支持物結(jié)合探針接觸并使靶分子與所述小珠結(jié)合探針和所述支持物結(jié)合探針相結(jié)合的裝置，以便使靶分子夾在支持物和小珠之間，并使小珠連接到支持物上；為支持物提供旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的裝置；以及用于檢測(cè)旋轉(zhuǎn)支持物上小珠的存在情況的裝置，其中支持物上小珠的檢測(cè)結(jié)果代表了樣品中靶分子的存在情況。31、項(xiàng)30所述儀器，其中用于檢測(cè)支持物上小珠存在情況的裝置是，能直射到支持物上的激光和檢測(cè)來(lái)自支持物激光的反射或缺失的傳感器。32、項(xiàng)30所述儀器，其中用于檢測(cè)支持物上小珠存在情況的裝置是，用來(lái)施加磁場(chǎng)從而誘導(dǎo)支持物上d、珠產(chǎn)生對(duì)抗磁碭的裝置和檢測(cè)從d、珠誘導(dǎo)而來(lái)的^f茲場(chǎng)的傳感器。33、項(xiàng)30所述儀器，其中用于檢測(cè)支持物上小珠存在情況的裝置是，用來(lái)提供快速變化的磁場(chǎng)以使支持物上鐵磁小珠發(fā)熱從而導(dǎo)致結(jié)合到小珠表面的熱發(fā)光材料或加入到小珠，圍的化，，光或生物發(fā)光材料所發(fā)出的激光器。34、項(xiàng)30所述儀器，其中用于檢測(cè)支持物上小珠存在情況的裝置是，提供變化的磁場(chǎng)以誘導(dǎo)支持物上的小珠產(chǎn)生聲學(xué)信號(hào)的裝置和檢測(cè)聲學(xué)信號(hào)的傳感器。35、項(xiàng)30所述儀器，其中支持物含有與至少第二探針分子相關(guān)的機(jī)可讀信息。40、一種將靶核酸與包含預(yù)定核苷酸序列的參比序列相比較的方法，該方法包括(a)將包含靶核酸的樣品與固定在固相支持物預(yù)定區(qū)域上的核酸探針陣列互補(bǔ)配對(duì)，該陣列含有包含了多個(gè)探針的第一探針系列，每個(gè)探針含有與參比序列的亞序列完全互補(bǔ)的核普酸片段，該片段包括至少一個(gè)與參比序列中的相應(yīng)核苷酸互補(bǔ)的探測(cè)位點(diǎn)；(b)使配對(duì)樣品與含有第；探針系列的溶液接觸，其中第二探針系列包含針對(duì)第一探針系列中每一個(gè)探針的相應(yīng)探針，第二探針系列中的每一個(gè)相應(yīng)探針都結(jié)合到小珠上，并且當(dāng)與參比序列互補(bǔ)配對(duì)時(shí)對(duì)于第一系列探針是連續(xù)的；(c)檢測(cè)支持物預(yù)定區(qū)域上的小珠的存在情況；(d)使固相支持物與含有DNA連接酶的溶液接觸；(e)使第一和來(lái)自支持物上的第二探針系列的耙核酸變性；并且(f)在變性完成之后檢測(cè)固相支持物預(yù)定區(qū)域上的小珠的存在情況，小珠的存在表示靶核酸序列與參比序列的亞序列相同，也即該序列和預(yù)定區(qū)域中固定的第一探針系列以及它們相應(yīng)的探針完全互補(bǔ)。41、項(xiàng)40所述方法，其中參比序列為未突變的基因序列。42、項(xiàng)40所述方法，其中參比序列為來(lái)自未突變基因的帶有至少一個(gè)核香酸錯(cuò)配的基因序列。43、項(xiàng)40所述方法，其中參比序列為包含重復(fù)元件的基因序列。44、項(xiàng)40所述方法，其中參比序列與包含至少一個(gè)的重復(fù)單元的基因序列相同。48、項(xiàng)1的方法，其中檢測(cè)支持物上小珠存在情況的步驟包括提供具有光反射性表面的支持物；將激光直射到反射性支持物上；并且監(jiān)控激光的反射情況，從而檢測(cè)由于支持物非反射性區(qū)域上存在反射性小珠而引起的激光反射并以此檢測(cè)支持物上小珠的存在情況。49、項(xiàng)7所述方法，其中檢測(cè)支持物上小珠存在情況的步驟包括提供具有光反射性表面的支，物；將激光直射到反射,支持物上；，并且監(jiān)控引起的激光反射并以此檢測(cè)支持物上小珠的存在情況。現(xiàn)在結(jié)合實(shí)施例并參考相應(yīng)的附圖將對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的形式進(jìn)行描述，其中圖1是兩個(gè)生物芯片的示意圖，通過(guò)將耙分子特異的探針(核酸在左，抗體在右)結(jié)合到反應(yīng)孔上而被功能化。圖2簡(jiǎn)要示意了兩個(gè)連接了小珠的生物芯片，由于功能化生物芯片、靶分子和功能化小珠(帶有靶分子特異的不同區(qū)域的探針)之間的特異性結(jié)合而使小珠結(jié)合到生物芯片上。圖3示意性地描繪了在有核酸探針的生物芯片中加入連接步驟。圖4A-4D描繪了磁鏈反應(yīng)及其對(duì)結(jié)合到生物芯片上的小珠數(shù)量的放大效應(yīng)。圖5A-5B示意性表示生物芯片的螺旋-線性微陣列以及通過(guò)在小珠存在時(shí)激光散射而小珠不存在時(shí)激光反射來(lái)檢測(cè)生物芯片上聚集的非反射性小珠的存在情況的優(yōu)選方案。支持物介質(zhì)必須對(duì)激光具有反射性。圖6A-6B概念性地示意了生物芯片編址和數(shù)字坐標(biāo)布置的方案。圖7描繪了POC便攜式設(shè)備的設(shè)計(jì)方案。圖8描繪了采用優(yōu)選的螺旋-線性微陣列的便攜式設(shè)備的優(yōu)選設(shè)計(jì)方案。圖9A-9B示意性地描繪了一種竟?fàn)幮詼y(cè)定方法的原理，以及如何在許多生物芯片的微陣列中應(yīng)用它來(lái)進(jìn)行分析物濃度的檢測(cè)。圖10A-10B示意性地描繪了第二種竟?fàn)幮詸z測(cè)方法的原理。圖IOA描繪了存在的分析物的量少于小珠的情況。圖10B描繪了存在的分析物過(guò)量于小珠的情況。圖11A-11C簡(jiǎn)要示意了用于輔助判斷兒童出滲熱的診斷用生物芯片微陣列。圖12A-12C簡(jiǎn)要示意了生物芯片另一項(xiàng)在以基因轉(zhuǎn)位為特點(diǎn)的各種腫瘤，這里為軟組織肉瘤的"^斷和分子分類中的應(yīng)用。圖13描述了生物芯片微陣列和等位基因特異的寡核苷雜交用于測(cè)量(本例中為Huntington病)基因組DNA中的重復(fù)單元數(shù)量的思想。圖13A簡(jiǎn)要示意了針對(duì)Huntingtin基因重復(fù)區(qū)域的兩個(gè)探針(SEQIDNO1和2)的設(shè)計(jì)。探針中重復(fù)單元的合并數(shù)目與給定患者的基因組DNA相匹配。雜交后能夠形成連接。圖13B簡(jiǎn)要示意了合并的重復(fù)單元數(shù)目少于給定患者中的真實(shí)重復(fù)單元數(shù)目的另一組探針(SEQIDN03和2)。探針的兩個(gè)末端沒有發(fā)生連接。圖13C簡(jiǎn)要示意了合并的重復(fù)單元數(shù)目多于給定患者中的重復(fù)單元的真實(shí)數(shù)目的另一組探針(SEQIDNO4和2)，結(jié)果出現(xiàn)有突出端的探針而且連接失敗。圖14A-14F例舉了相似設(shè)計(jì)方案在單核苷酸多態(tài)性(SNP)的確定或突變檢測(cè)中的應(yīng)用(SEQIDNO57)。圖15A-15B描繪了應(yīng)用竟?fàn)幮越Y(jié)合檢測(cè)的第二種方法測(cè)定mRNA水平和蛋白質(zhì)濃度。圖16示意性地描繪了采用連接了不同蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)微陣列和小珠文庫(kù)來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用的研究。-圖17描繪了微陣列在藥物篩選中的應(yīng)用。能夠鑒定出對(duì)特定蛋白質(zhì)具有高親合力的藥物。優(yōu)選實(shí)施方案詳述定義在本文中采用的下列術(shù)語(yǔ)一般具有以下含義"核酸"指的是單鏈或雙鏈以及任何化學(xué)修飾的DNA、RNA。修飾包括(但不限于)那些具有其它化學(xué)基團(tuán)的成分。"配體"指的是特異地與受體相結(jié)合并借此在細(xì)胞中產(chǎn)生信號(hào)的分子，例如激素就是一種配體，當(dāng)它與受體結(jié)合時(shí)觸發(fā)細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)或其它反應(yīng)。在本文中所采用的"雜交"指的是兩個(gè)互補(bǔ)DNA單鏈的結(jié)合(DNA/DNA"分析物"指的是存在于患者血液或體液中的物質(zhì)。分析物的濃度一般隨新陳代謝或疾病的狀態(tài)而改變，是臨床醫(yī)生掌握特定患者健康狀況的4呂息。"抗原"指的是其分子表面結(jié)構(gòu)能觸發(fā)免疫應(yīng)答例如抗體的產(chǎn)生，和/或與其特異性抗體發(fā)生反應(yīng)(抗原-抗體反應(yīng))的物質(zhì)。"抗體"是能識(shí)別并結(jié)合某種抗原而成為免疫應(yīng)答的一部分的蛋白質(zhì)(免疫球蛋白)。"探針分子"指的是具有與同類或不同類的另一種分子特異性結(jié)合特性的任何核酸、蛋白質(zhì)或其它分子。一般來(lái)說(shuō)，核酸與序列互補(bǔ)核酸特異結(jié)合。也就是說(shuō)，帶有如下序列A-G-G-C-G-T-A(從5'至3'端)的探針(在本例中是核酸分子)將特異性地與含有下列序列區(qū)T-A-C-G-C-C-T(從5'至3'端)的另一條DNA鏈結(jié)合，其中A,T，G,C分別代表腺噤呤、胸腺嘧啶、鳥噤呤和胞嘧啶。針對(duì)某抗原的抗體能作為該抗原的探針分子。"表位，，指的是抗原分子結(jié)合到抗體上的部分。抗原可以帶有許多不同的表位，這些表位與不同的抗體結(jié)合。"鐵磁小珠，，指的是由具有能感應(yīng)產(chǎn)生磁性的任何物質(zhì)組成的小珠，鐵磁小珠在迅速變化的磁場(chǎng)中由于內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生渦流從而產(chǎn)生熱。"微衛(wèi)星，，指的是一小段非常簡(jiǎn)單的DNA序列(通常為l-4bp)的串聯(lián)重復(fù)DNA鏈(通常小于O.lkb),例如(CA、。"微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性，，指的是某些肺瘤細(xì)胞所特有的現(xiàn)象，即在DNA復(fù)制期間微衛(wèi)星重復(fù)單元的拷貝數(shù)量發(fā)生隨機(jī)變化。"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)"指的是在試管中制造一條DNA鏈的許多拷貝的技術(shù)。它采用由雙鏈DNA的變性、合適的寡核苷探針的退火以及通過(guò)聚合酶進(jìn)行引物延伸所組成的重復(fù)熱循環(huán)過(guò)程。"反轉(zhuǎn)錄酶"指的是存在于RNA病毒中、能由RNA摸板合成DNA的酶復(fù)合物。"反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)"指的是RNA的擴(kuò)增技術(shù)，包括先利用反轉(zhuǎn)錄酶從耙RNA合成互#卜DNA(cDNA)，然后對(duì)cDNA進(jìn)行PCR。生物芯片的結(jié)構(gòu)生物芯片包括由任何種類材料制成的固相支持物上的小斑點(diǎn)(孔)組成，但優(yōu)選地采用包被了反射性惰性材料例如金的硬質(zhì)透明聚碳酸酯聚合物。在生物芯片的表面上結(jié)合有假定的靶分子特異的一對(duì)探針分子中的一種。圖1是生物芯片[l]的示意圖，包括帶有中心小孔[2]的固相支持物，小孔[2]與核酸探針[3](左)、特異性抗體[3](右)或其它分子共價(jià)結(jié)合。另一成分是與小而黑的非反射性可溶或不可溶的(沉底的)小珠結(jié)合的第二種特異性探針，小珠可以由導(dǎo)電性、半導(dǎo)性或非導(dǎo)電材料(優(yōu)選4失^磁材料例如鐵、鐵氧化物，單獨(dú)地、電鍍地或以各種混合物或合金形式)制成。生物芯片的原理采用這種生物芯片以及特異探針結(jié)合的生物芯片和小珠的結(jié)構(gòu)，當(dāng)靶分子存在并處于合適的條件下時(shí)，它會(huì)被結(jié)合并夾在探針之間。圖2表示出了該種思想。在這里，一些靶分子[4]被特異性探針[6]功能化的小珠[5]和孔結(jié)合探針[3]所捕獲。其它的靶分子則結(jié)合到功能化小珠或孔上，但不會(huì)與兩者都結(jié)合。通過(guò)孔結(jié)合探針[3]的定位性能，結(jié)合到靶分子[4]的功能化小珠[5]被固定在生物芯片[1]的孔[2]中。左側(cè)圖描繪的是核酸探針和靶分子，右側(cè)圖描繪的是特異性抗體探針和抗原靶分子。反應(yīng)之后，未結(jié)合的小珠以及其它試劑和樣品可以被去除以消除噪音，小珠的檢測(cè)可以通過(guò)各種方式進(jìn)行。靶分子濃度的檢測(cè)范圍非常寬，從一個(gè)分子到與小珠結(jié)合探針同樣多的分子都可以檢測(cè)，這反映了設(shè)計(jì)方案的穩(wěn)固性。然而，靈敏度并沒有下降。該裝置理論上可以檢測(cè)單一靶分子的存在。此外，當(dāng)它用于檢測(cè)特定的核酸序列時(shí)，無(wú)需進(jìn)行預(yù)先的擴(kuò)增。本方法用途廣泛，可以用于檢測(cè)DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及其它大分子。探針分子的制備首先制備一對(duì)特異性探針分子。核酸探針可以依據(jù)靶序列的信息來(lái)制備。這些序列信息經(jīng)常可以在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，例如Entrez基因組(國(guó)家生物技術(shù)信息中心，國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)。與靶分子的兩個(gè)末端序列互補(bǔ)的探針序列可以用商業(yè)途徑合成。此外，探針可以依照這樣的思^各來(lái)設(shè)計(jì)即，在與耙分子雜交以后，探針的兩個(gè)末端盡可能靠近，以便DNA連接酶(使相互靠近的DNA鏈共價(jià)結(jié)合的酶)能夠?qū)蓚€(gè)末端連接在一起從而加強(qiáng)了"孔"和小珠之間的結(jié)合?？贵w可以從暴露于抗原的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上制備。由于上述原因，要保證抗原的來(lái)源。反應(yīng)將足量制備的樣品加到芯片上。含有假定靶分子的空氣可以起泡通過(guò)合適的溶質(zhì)(solute)。固體或液體可以溶解在溶液中。完整的細(xì)胞和組織需要經(jīng)過(guò)化學(xué)或物理或其它方式進(jìn)行裂解，從而釋放出被檢測(cè)的分子。加入相對(duì)于靶分子過(guò)量的功能化小珠(在樣品加入之前、之中或之后進(jìn)行)。如果耙分子是雙鏈DNA，需要在特定溫度下加熱一段預(yù)定的時(shí)間，從而使DNA變性成為單鏈DNA。這樣反應(yīng)才能進(jìn)行。在本優(yōu)選技術(shù)方案中解釋了應(yīng)對(duì)微流體性的解決方案，其中小珠由消磁的磁性材料制成，并在微陣列下面的可移動(dòng)磁場(chǎng)的控制下，在旋轉(zhuǎn)的生物芯片微陣列的表面上保持固定的位置，以便能夠系統(tǒng)而有序地在通過(guò)的生物芯片上檢測(cè)被捕獲的靶分子。由于固定的小珠相對(duì)于溶液中的靶分子和通過(guò)的生物芯片而移動(dòng)，這就使反應(yīng)動(dòng)力學(xué)向有利的方向發(fā)展?？刂菩≈榈拇艌?chǎng)不應(yīng)該太強(qiáng)以免過(guò)程中的小珠被永久磁化。為了增強(qiáng)耙核酸與核酸探針之間的雜交反應(yīng)的特異性，可以包括任選的使兩個(gè)探針連接起來(lái)的步驟。這一點(diǎn)如圖3所示。寡核苷酸探針[3與6]被設(shè)計(jì)與靶序列[4]的相鄰片段雜交從而使探針末端相接觸。加入DNA連接酶[7]導(dǎo)致寡核苷酸探針間的糖-磷酸酯骨架共價(jià)相連。除了增強(qiáng)反應(yīng)的特異性之外，這一步驟也增強(qiáng)了小珠與生物芯片的連接。因而使僅靠單一核苷酸分子與生物芯片相連的小珠或圍繞著特異性結(jié)合小珠而聚集的小珠(下一節(jié)一小珠的聚集)不會(huì)因?yàn)闆_洗期間施加的水壓或生物芯片微陣列旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的輕微離心力而中斷。小珠的聚集在優(yōu)選的技術(shù)方案中，小珠的聚集是通過(guò)在反應(yīng)的最后向生物芯片上加入與小珠上的化學(xué)分以高親和力并特異結(jié)合的分子來(lái)進(jìn)行的。這些化學(xué)相互作用包括但不限于1、親和素/生物素或4連親和素/生物素一每一個(gè)親和素和4連親和素有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)。因此，當(dāng)把親和素或鏈親和素加入到表面上結(jié)合有生物素的小珠的懸浮液(或溶液)中時(shí)，小珠就會(huì)聚集起來(lái)，這是由于親和素(或鏈親和素)使兩個(gè)或多個(gè)小珠交聯(lián)在一起，而小珠表面上的其它生物素分子則可以自由地連接更多的親和素(或鏈親和素)分子，因而連接上了其它的小珠。2、蛋白A/IgG或蛋白G/IgG—葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白對(duì)于免疫球蛋白分子Fc片段(結(jié)晶片段)具有強(qiáng)親合力。由于每一個(gè)免疫球蛋白G(IgG)分子只有一個(gè)Fc片段，因此帶有兩個(gè)或更多同樣表位的普通抗原與免疫球蛋白二聚物例如IgG的兩個(gè)分子相結(jié)合，從而導(dǎo)致表面上含有蛋白A或蛋白G的小珠進(jìn)行交聯(lián)。3、抗體/抗原對(duì)一針對(duì)生物素的抗生物素抗體可以使表面結(jié)合了生物素分子的小珠聚集。多價(jià)抗體例如IgA和IgM對(duì)于使小珠聚集更為有效，這是由于它們分別是二價(jià)和五價(jià)的。4、DNA/DNA,DNA/RNA—當(dāng)加入具有互補(bǔ)序列的連接雙鏈DNA時(shí)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合了核酸分子的經(jīng)適當(dāng)處理過(guò)的小珠聚集(Mirkin，美國(guó)專利文獻(xiàn)6261944)。5、可以利用的其它特異性分子間相互作用。例如，酶結(jié)合到底物上以催化反應(yīng)。如果采用與天然底物結(jié)構(gòu)類似但不能被酶分開的小分子(例如藥物)替代天然底物而加入到溶液中，它就會(huì)通過(guò)親合力與酶結(jié)合。如果酶被_結(jié)合到小珠表面，帶有多于兩個(gè)酶結(jié)合位點(diǎn)的小分子就會(huì)引起小珠的聚集。由HIV病毒產(chǎn)生的蛋白質(zhì)Gpl20特異性地與人類T細(xì)胞產(chǎn)生的CD4分子結(jié)合。因此如果T細(xì)胞加入到溶液中，就會(huì)使含有Gpl20的小珠聚集。利用磁鏈反應(yīng)聚集小珠在特別的優(yōu)選技術(shù)方案中，此處指磁鏈反應(yīng)，用鐵磁材料制作小珠。小珠最初是消磁的。當(dāng)與靶分子的反應(yīng)結(jié)束后，生物芯片或整個(gè)生物芯片微陣列受到足夠強(qiáng)的磁場(chǎng)作用而使小珠磁化。之前的小珠是溶解的、懸浮的或沉于生物芯片底部，而且彼此之間無(wú)相互作用。在將》茲能轉(zhuǎn)移給小珠之后，由于材料的剩磁性導(dǎo)致凈;茲場(chǎng)的存在，它們開始彼此相互作用。小珠系統(tǒng)相互作用的目的是要尋求達(dá)到可能最低能量狀態(tài)。而這種最低能量狀態(tài)就是小珠排列成行，聚集起來(lái)。由于未結(jié)合的小珠聚集成一大團(tuán)，該反應(yīng)被稱為"磁鏈反應(yīng)"。特異性地與生物芯片結(jié)合的磁化小珠也會(huì)聚集，但在不結(jié)合小珠的生物芯片上就不會(huì)發(fā)生聚集。鐵磁小珠的磁化很容易通過(guò)采用例如在普通用戶型的錄音機(jī)上就可以找到的電磁體所產(chǎn)生的磁場(chǎng)來(lái)進(jìn)行。雖然生物芯片上單個(gè)結(jié)合的小珠很難檢測(cè)，但是大量的聚集體就很容易檢測(cè)，甚至可以用肉眼看到，這使得采用多種方法檢測(cè)聚集體成為可能。圖4示意性地描繪了在小珠磁化后引起鐵磁小珠聚集體形成的各個(gè)階段，這被稱為磁鏈反應(yīng)。才企測(cè)小3朱的方法1、通過(guò)激光的散射檢測(cè)小珠在特定的優(yōu)選技術(shù)方案中，在結(jié)合小珠存在時(shí)反射激光的減弱被用作靶分子與孔結(jié)合和珠結(jié)合探針特異性反應(yīng)的檢測(cè)手段。如果生物芯片采用反射性介質(zhì)作為支持物，那么聚焦在沒有結(jié)合小珠的生物芯片上的激光將被反射回去。預(yù)先放置好的光敏二極管(傳感器)對(duì)反射光進(jìn)行^r測(cè)。被聚集小珠所覆蓋的生物芯片會(huì)散射激光，結(jié)果，反射到傳感器上的激光強(qiáng)度就會(huì)減弱。通過(guò)這種方式，生物芯片上的特異性反應(yīng)就很方便地被檢測(cè)并產(chǎn)生二進(jìn)制信號(hào)。圖5A顯示出在生物芯片[l]上存在非反射性小珠聚集體時(shí)，掃描激光束[8]的散射情況。所述生物芯片[1]在微小壓縮光盤樣微陣列[9]上沿螺旋形軌跡排列，所述微陣列疊置在軌跡上并且與軌跡的反射性和非反射性(數(shù)字)元件完全整合。為了清楚起見，僅顯示出了中間的兩條螺旋線。在小珠聚集體不存在(圖5B)以及如果生物芯片是由反射性材料制成時(shí)，激光束將被反射回傳感器[IO]。這種二進(jìn)制信號(hào)(小珠存在時(shí)為(l)，小珠不存在時(shí)為(O))與有關(guān)生物芯上存在的信息一起被轉(zhuǎn)送給嵌入的微處理器，從而提供分析結(jié)果。除了單個(gè)螺旋形軌跡，也可以采用多個(gè)同心的軌跡或一些其它形式?；蛘?，小珠也可以由反射性材料制成，而生物芯片定位在軌跡的非反射性元件上。小珠在生物芯片表面上的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了將編碼信號(hào)從非反射性(二進(jìn)制l)轉(zhuǎn)換為反射性(二進(jìn)制O)的相同目標(biāo)。在另一種技術(shù)方案中，微陣列利用了光盤的兩個(gè)表面(透明微陣列)，其中編碼的數(shù)字信息(反射性或非反射性的)位于透明支持介質(zhì)中的插入層內(nèi)。生物芯片位于光盤的上表面。利用在光盤下面的激光和兩個(gè)傳感器(光盤一面一個(gè))，與激光同面的傳感器(軌道傳感器)作為與普通光盤中一樣的編碼數(shù)字信息的閱讀器，而位于激光相反面的傳感器(生物芯片傳感器)作為小珠存在情況的檢測(cè)器，因?yàn)樾≈榈拇嬖趯p弱傳導(dǎo)給生物芯片傳感器的激光。在小珠結(jié)合到生物芯片表面的情況下，軌道傳感器起到閘門的作用，從而忽略了來(lái)自生物芯片下表面的微弱背面散射激光。與之相類似，規(guī)劃生物在另一種技術(shù)方案中，采用了同樣的透明微陣列。數(shù)字信息被編碼成不透明的和透明的節(jié)段。探測(cè)激光位于生物芯片的反面(在其之下)，位于生本種技二方案檢測(cè)的是由對(duì);;光不透明的^f上d、珠傳導(dǎo)激光的減i。圖6描繪了用數(shù)字編碼整合生物芯片的方案以及使用糾錯(cuò)EFM(8-14調(diào)制)，因而把激光正在掃描的微陣列部分、生物芯片的地址以及生物芯片的內(nèi)容等信息反饋給微處理器。在圖6A和圖6B中，三排讀數(shù)作為一個(gè)連續(xù)字符，中間無(wú)間隔(圖中畫出的間隔是為了清楚起見)。每個(gè)由14個(gè)二進(jìn)制數(shù)字組成的塊編碼一個(gè)鍵盤輸入符(此處代表任意的)。通過(guò)在合適的位置沉積探針，介質(zhì)變成生物芯片。這里例舉了炭疽生物芯片[ll]，它攜帶有針對(duì)炭疽致死因子的寡核酸探針。在從炭疽孢子樣本中提取的編碼炭疽致死因子的DNA序列存在的情況下，它們將既與生物芯片結(jié)合又與攜帶了針對(duì)炭疽致死因子不同區(qū)域的特異性寡核苷酸探針的功能化小珠結(jié)合。通過(guò)激光掃描來(lái)檢測(cè)生物芯片上連接的小珠的存在情況，同時(shí)可以伴隨或不需要磁鏈反應(yīng)。在示意圖中(圖6A)，當(dāng)生物芯片含有激光散射小珠時(shí)，數(shù)字塊(IIOIIOIIOIOIOO)讀作"Y"，表示小珠存在；而小珠不存在時(shí)，數(shù)字塊(IIOOIOIIOOOIOO)讀作"N"，表示小珠不存在。在圖6B中，例舉了編碼的"簡(jiǎn)并性"，其中10011011010100和10111011111100都代表炭疽陽(yáng)性鑒定結(jié)果。由于大的小珠聚集體可能溢過(guò)生物芯片的邊界而進(jìn)入鄰近的區(qū)域(每個(gè)"o"或"r是一個(gè)數(shù)字區(qū)域)，因此不同的編碼就編制成代表相同的結(jié)果。這種編碼的"簡(jiǎn)并性"類似于天然氨基酸的多個(gè)編碼子。例如，CCA，CCG，CCC和CCU全都編碼脯氨酸。2、金屬檢測(cè)金屬檢測(cè)可以應(yīng)用于金屬小珠或含有相當(dāng)金屬數(shù)量的小珠。金屬檢測(cè)的原理已經(jīng)在別處描述過(guò)了。其要點(diǎn)是，當(dāng)金屬物體受外部磁場(chǎng)微擾時(shí)，其內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生渦流，從而產(chǎn)生相反的磁場(chǎng)。誘生的磁場(chǎng)隨后可通過(guò)靈敏的電/f茲體進(jìn)行^r測(cè)。3、；茲4匕后；茲場(chǎng)的4企測(cè)采用靈敏的高斯測(cè)量?jī)x(gaussmeter)或其它儀器可以檢測(cè)聚集小珠的磁場(chǎng)。事實(shí)上，可以采用在普通磁帶、數(shù)字磁帶和計(jì)算機(jī)硬盤上微小磁體磁場(chǎng)的檢測(cè)作為貯存和檢索類似物和數(shù)字型數(shù)據(jù)的方法。4、聲音的檢測(cè)Barkhausen效應(yīng)描述了受到波動(dòng)性磁場(chǎng)干擾的永磁體所產(chǎn)生的干擾(crackling)噪音。所述噪音是由外部磁場(chǎng)強(qiáng)大的調(diào)整力而導(dǎo)致的磁體內(nèi)相鄰》茲力區(qū)域之間的相互作用而產(chǎn)生的。Barkhausen效應(yīng)可以用來(lái)檢測(cè)》茲性顆粒的聚集體。5、對(duì)受外場(chǎng)(能源)例如變化磁場(chǎng)和電磁波激發(fā)后小珠產(chǎn)生的熱/紅外線的沖企測(cè)施加外部電磁場(chǎng)的情況下，金屬微粒吸收能量，導(dǎo)致微粒被加熱。熱量隨后以紅外線形式向外輻射。a、散發(fā)的紅外線可以通過(guò)單獨(dú)地或結(jié)合有激光束(激光熱度計(jì))的靈敏紅外線光敏二極管來(lái)檢測(cè)。b、如果生物芯片事先包括熱加速化學(xué)反應(yīng)，那么散發(fā)到小珠緊鄰環(huán)境中的熱量就可以增強(qiáng)其周圍化學(xué)發(fā)光混合物的化學(xué)發(fā)光。化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生的光強(qiáng)度足以利用光敏二極管來(lái)檢測(cè)，并且其與結(jié)合的小珠數(shù)量、受外場(chǎng)激發(fā)的程度以及外場(chǎng)作用的持續(xù)時(shí)間成正比。c、按照同樣的原理使周圍生物發(fā)光混合物的生物發(fā)光增強(qiáng)。發(fā)出的光也可以用來(lái)才企測(cè)和定量小J朱。d、誘發(fā)提前包被到小珠上熱發(fā)光材料發(fā)光。熱發(fā)光材料將過(guò)量熱能以可見光形式輻射出來(lái)。發(fā)出的光可以用光敏二極管進(jìn)行檢測(cè)。e、利用從a-d發(fā)出的光進(jìn)行固有激光器的原位光擴(kuò)增。從小珠或其鄰近環(huán)境所發(fā)出的光用來(lái)"泵擊，，小激光器中的激光器產(chǎn)生激光束，其原理是散發(fā)輻射剌；敫光擴(kuò)增(LightAmplificationbyStimulationofEmission因此就可以鑒別要檢測(cè)的耙分^:在與否。采用光電倍增管也4以達(dá)二同樣的目的。微陣列和POC(point-of-care)設(shè)備的裝配在優(yōu)選技術(shù)方案中，將多個(gè)單芯片裝配成兩維或三維的格狀微陣列。在圖7中，示意性地描繪了這樣一個(gè)安裝到POC便攜式設(shè)備中的微陣列[12]。為清楚起見，將激光掃描儀和其它電子元件省略。單個(gè)生物芯片制成檢測(cè)不同的分子或進(jìn)行不同的定量分析。在相同微陣列上可包含兩個(gè)或三個(gè)同樣的芯片以保證質(zhì)量。在特別優(yōu)選的技術(shù)方案中，如同在光盤一樣在圓形反射性表面上，生物芯片的螺旋形線性微陣列還設(shè)置"平地(land)"和"溝槽(pit)"形式的數(shù)字坐標(biāo)。"平地"和"溝槽"分別散射或反射一束緊密聚焦的激光束，并隨后被傳感器解釋為相應(yīng)的二進(jìn)制"ON"或"OFF";這樣就編碼關(guān)于激光束掃描位置的信息以及有關(guān)生物芯片的信息。激光對(duì)生物芯片的掃描揭示了聚集體存在與否，而其存在與否則分別與加入生物芯片之間數(shù)字坐標(biāo)中的"平地"和"溝槽"相對(duì)應(yīng)。圖8例舉了微陣列的特別優(yōu)選技術(shù)方案，很多方面與光盤類似。微陣列由塑料制成并包被有反射性材料，呈圓形或其它能圍繞中心軸旋轉(zhuǎn)的任何形狀。"溝槽"和"平地，，通過(guò)常規(guī)壓縮光盤燒制技術(shù)就可以燒制或印刷于其上，從而為微處理器(數(shù)字坐標(biāo))、生物芯片地址以及生物芯片內(nèi)容(數(shù)字條形碼)提供反饋信息。在預(yù)先編制的位置(生物芯片地址)中，沒有印刷"平地"。替代的是，一對(duì)探針其中之一(核苷酸、抗體、蛋白質(zhì)或其它大分生物芯片上。另一種探針用單獨(dú)的方法連接到小珠上。上面定位有數(shù)字坐標(biāo)和生物芯片的軌跡為螺旋形的，并象在常規(guī)光盤中那樣起始自微陣列的中心。用于POC的便攜式設(shè)備制備成帶有接收卡盒的狹槽?？ê邪㈥嚵胁⒃噭┖蜆悠废拗圃谖㈥嚵械谋砻妗Ｋ尤霕颖竞驮噭┑目?、用于在反應(yīng)結(jié)束時(shí)利用離心力來(lái)收集未結(jié)合小珠和試劑的溝槽以及其它被認(rèn)為適于有效執(zhí)行微陣列功能的部件?？ê械捻敳渴峭该鞯?，從而可以用激光和傳感器來(lái)探測(cè)微陣列表面上的生物芯片和數(shù)字信息。插入卡盒，要保證微陣列的位置與機(jī)械齒輪、電磁體、激光、傳感器以及便攜式設(shè)備的其它元件相匹配。傳感器對(duì)微陣列進(jìn)行鑒別，進(jìn)行電自檢并在反應(yīng)結(jié)束后顯示出作為被檢測(cè)的"生物劑"、分析物的"濃度"的結(jié)果或其它利用慣用微陣列進(jìn)行的科研結(jié)果。定量(分子檢測(cè))已知的體液中的生物分子經(jīng)常需要進(jìn)行濃度檢測(cè)。例如在曱亢或曱低時(shí)沖全測(cè)甲狀腺素。本發(fā)明只需體液或血液的樣i量樣本就可以進(jìn)行住院或臨床POC檢測(cè)各種待分析物即時(shí)濃度。利用在一系列生物芯片(每一個(gè)芯片不同之處在于具有依次略微減少的結(jié)合分析物分子和隨后功能化的小珠)中預(yù)先固定的小珠可以測(cè)定未知樣品中分析物的濃度(圖9A與圖9B)。加入待測(cè)樣品[13]產(chǎn)生竟?fàn)幮越Y(jié)合以及小珠結(jié)合探針的替代。只有那些帶有足量結(jié)合小珠的生物芯片，才有能用任何檢測(cè)小珠的方法進(jìn)行檢測(cè)的信號(hào)。小珠被替代偏離檢測(cè)閾值的生物芯片將指示陰性信號(hào)。一系列信號(hào)-產(chǎn)生和信號(hào)-缺失的生物芯片的轉(zhuǎn)換點(diǎn)就與分析物的濃度相關(guān)聯(lián)。用已知標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的預(yù)校準(zhǔn)保證了測(cè)試樣品的精確定量。a、方法1在圖9A中，描繪了加入樣本導(dǎo)致的竟?fàn)幮越Y(jié)合以及預(yù)先結(jié)合的小珠和夾心分析物的被替代的過(guò)程。給定樣本中分析物的濃度越高，被替換的預(yù)先結(jié)合的小珠就越多。圖9B描繪了帶有數(shù)量減少的結(jié)合小珠的一系列生物芯片的微陣列。加入含未知濃度分析物[13]的樣本導(dǎo)致特定的生物芯片上的小珠在通過(guò)激光散射或由外場(chǎng)誘導(dǎo)的生物芯片發(fā)出的信號(hào)被檢測(cè)時(shí)位于檢測(cè)閾值之外。所述臨界點(diǎn)的定位給出有關(guān)分析物濃度的信息。b、方法2:另一種利用竟?fàn)幮越Y(jié)合原理定量分析物的方法(圖IOA)不要求預(yù)先用固定的小珠和分析物裝配生物芯片的陣列。其優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需預(yù)先制造、分離和純化分析物分子。將制備的未稀釋樣品(圖IOA，右上)加到生物芯片中，平行地將稀釋樣品加到另一生物芯片中(圖10A,右下)。在一種優(yōu)選的技術(shù)方案中，至少采用一或兩個(gè)生物芯片。將分析物和功能化小珠加到生物芯片上，發(fā)生兩個(gè)探針與分析物之間的結(jié)合，導(dǎo)致以下產(chǎn)物的比例變化結(jié)合到功能化小珠上的分析物、結(jié)合到生物芯片上的分析物、既與生物芯片結(jié)合又與功能化小珠結(jié)合的分析物以及游離的分析物。如果分析物的絕對(duì)數(shù)量少于結(jié)合到小珠上的探針絕對(duì)數(shù)量，那么所有的分析物分子均被功能化小珠捕獲。稀釋樣本將導(dǎo)致能被捕獲的分析物數(shù)量更少，因此結(jié)合到生物芯片上的小珠數(shù)量也更少。當(dāng)分析物的數(shù)量少于結(jié)合探針的功能化小珠數(shù)量時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度與分析物的濃度直接成正比。如果分析物的絕對(duì)數(shù)量多于結(jié)合到小珠上的探針的絕對(duì)數(shù)量，那么分析物的加入量相對(duì)于功能化小珠過(guò)量導(dǎo)致除了結(jié)合到生物芯片上的分析物之外還有游離的分析物。由于生物芯片結(jié)合探針的教量有限，因此游離分析物與分析物結(jié)合的小珠之間發(fā)生竟?fàn)?。稀釋樣品以及在帶有同等?shù)量功能化小珠的相同生物芯片中進(jìn)行測(cè)試，其結(jié)果是較少的游離分析物與分析物結(jié)合的小珠發(fā)生竟?fàn)帯＿@自相矛盾地說(shuō)明較大量的結(jié)合小珠時(shí)，分析物濃度與生物芯片結(jié)合的小珠數(shù)量之間的關(guān)系相反。因此在分析物的數(shù)量比帶有結(jié)合探針的小珠數(shù)量多時(shí)，信號(hào)的強(qiáng)度與分析物的濃度成反比。通過(guò)對(duì)含未知數(shù)量分析物的稀釋樣和未稀釋樣品的進(jìn)行平行檢測(cè)，就有可能通過(guò)采用適合于如上述闡述情況的方程式和常數(shù)來(lái)測(cè)定分析物的濃度。微處理器采用運(yùn)算法則來(lái)選擇合適的用于計(jì)算分析物濃度的方程式。對(duì)于絕大多數(shù)分析物，其濃度范圍通常落入上述特定情況其中之一，但不會(huì)兩者兼有。需要預(yù)先的校準(zhǔn)和常數(shù)。由于該方法對(duì)給定的分析物只需幾個(gè)生物芯片，因此多個(gè)重復(fù)芯片能進(jìn)一步確保質(zhì)量。POC設(shè)備具有足夠的容量，使用一個(gè)微陣列立刻進(jìn)行許多不同分析物多重的檢測(cè)。其它應(yīng)用1、傳染病因子的鑒定許多傳染性疾病具有相似的癥狀。例如炭疽、流感、登革熱、天花、單純性感冒、紅滲等最初的癥狀都包括有不舒服(比平常狀況差)、發(fā)熱、肌肉疼痛和非特定皮滲。為了使初診醫(yī)生能準(zhǔn)確鑒定這么多癥狀相似但后果完全不同的疾病，可以采用本發(fā)明對(duì)全部這些臨床傳染性因子經(jīng)濟(jì)而快速地進(jìn)行;徵量測(cè)定(并且在早期)。許多患者無(wú)需住院觀察，一旦致病原因被準(zhǔn)確鑒定就可以回家，從而為患者節(jié)約了金錢并減小了風(fēng)險(xiǎn)(如果他們需要在醫(yī)院中進(jìn)行監(jiān)護(hù)的話，可能會(huì)染上有害的微生物)。在圖11中，通過(guò)一塊能進(jìn)行疾病判斷的微陣列平板例舉了本發(fā)明作為傳染病臨床附助診斷的實(shí)用性。這里描繪的微陣列，是用于鑒定兒童中共同起始癥狀為發(fā)熱和皮滲的一組傳染因子。雖然這些病的起始癥狀相似，但如果未經(jīng)改變和治療，其發(fā)展和最終結(jié)果有很大不同。其中嬰兒紅滲傳染對(duì)于免疫力活躍的兒童來(lái)說(shuō)無(wú)關(guān)緊要，而傳染性腦膜炎則是病程進(jìn)展快而且發(fā)病率和致死率都很高的疾病。利用生物芯片的微陣歹ij[llA],其中每一塊芯片連接了不同傳染因子的探針，加入與待尋找的傳染因子相對(duì)應(yīng)的功能化小珠的文庫(kù)[圖IIB]以及臨床樣本，結(jié)果只有功能化小珠與相對(duì)應(yīng)的特定傳染因子生物芯片形成了連接。在假定情形中，麻疹通過(guò)功能化小珠與麻滲生物芯片的結(jié)合而被鑒別出來(lái)(圖11C,左)，沒有小珠結(jié)合到風(fēng)疹生物芯片上(圖11C,右)，對(duì)于風(fēng)滲的讀取結(jié)果為陰性。2、腫瘤的分子分類許多癌癥是由于部分基因在基因內(nèi)或基因間轉(zhuǎn)座(嵌合基因)而造成的。這些例子太多無(wú)法——例舉，包括有甲狀腺濾泡癌、某些急性骨髓性白血病、許多軟組織肉瘤例如滑液(synovial)肉瘤和骨外粘液樣軟骨肉瘤。雖然這些嵌合基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本(嵌合轉(zhuǎn)錄本)的鑒定可以很容易通過(guò)常用的RT-PCR來(lái)進(jìn)行，但該方法很慢而且很費(fèi)力。采用本發(fā)明(圖12),可以制備出能與嵌合轉(zhuǎn)錄本的兩個(gè)部分雜交的一對(duì)探針。一個(gè)探針結(jié)合到孔上而另一個(gè)探針與小珠結(jié)合。如果腫瘤是白血病或一種在其早期或晚期容易進(jìn)入血液循環(huán)的類型，那么用銳利的針頭從腫瘤或血液循環(huán)中抽取微量樣品就可以得到肯定鑒定結(jié)果。采用此方法可以立刻篩選出許多不同的癌癥。在圖12中，描繪了本發(fā)明作為分子診斷工具，用來(lái)探測(cè)許多瘤(在這里例舉的是滑液軟組織肉瘤)獨(dú)特的核酸嵌合鏈的兩個(gè)或多個(gè)部分。滑液肉瘤的分子特征是SYT轉(zhuǎn)座到SSX1(或SSX2或SSX3)。在此，采用銳利針頭吸出適當(dāng)?shù)刂苽浞瘟黾?xì)胞，并將其mRNA[14]加載到生物芯片微陣列上。(在本例中，是針對(duì)軟組織透明細(xì)胞肉瘤)，而在[圖12A與圖12B]右側(cè)的生物芯片則針對(duì)SSX1。在同一微陣列上的其它生物芯片(未示出)上，連接用于臨床區(qū)分診斷的其它軟組織肉瘤的特異性探針。還顯示出了加入小珠文庫(kù)，所述文庫(kù)被連接軟組織肉瘤中(例如EWS和SYT)存在的核酸鏈特異互補(bǔ)的探針功能化。為了清楚起見，沒有表示出被待尋找的其它肉瘤的特異探針功能化的小珠。通過(guò)小珠與SYT特異探針的連接鑒定出嵌合轉(zhuǎn)錄靶分子(SYT/SSX-1)[14]與包含SSX-1結(jié)合探針的生物芯片的特異性雜交(圖12B,右)。對(duì)包含結(jié)合SSX-1探針的生物芯片上的小珠的檢測(cè)表明待定的軟組織肉瘤是含有SYT/SSX-1嵌合轉(zhuǎn)錄本的滑液肉瘤。在該例中，包含連接ATF-1特異(軟組織透明細(xì)胞肉瘤)探針的生物芯片[圖12B,左]上沒有連接小珠，這是因?yàn)檐浗M織透明細(xì)胞肉瘤特異的嵌合轉(zhuǎn)錄本(EWS/ATF-1)不存在。3、重復(fù)DNA中重復(fù)片段的計(jì)數(shù)許多遺傳疾病是由于含重復(fù)序列的特定區(qū)域過(guò)度延長(zhǎng)而引起的。例如，一種致死性疾病一Huntington氏病就是由于位于4號(hào)染色體的Huntingtin基因中重復(fù)序列"CAG"出現(xiàn)36次之多引起的(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgiid=143100)。為了檢測(cè)人體中Huntingtin基因中重復(fù)片段的數(shù)量，常規(guī)方法采用PCR。本發(fā)明簡(jiǎn)化了對(duì)重復(fù)序列數(shù)目的測(cè)定[圖13]。設(shè)計(jì)出跨越與重復(fù)序列相鄰的基因不變序歹l)的才笨4十(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/entrez/query.fcgicmd=Retrieve&db=nucleotide&List-uids=450395&dopt=GenBank)。"孑Li，，數(shù)目不同:小珠結(jié)合探針則攜帶位于重復(fù)^列另一側(cè)的不變序列:及固定數(shù)目的重復(fù)序列。如果孔結(jié)合探針包含4個(gè)重復(fù)序列而小珠結(jié)合探針包含1個(gè)重復(fù)序列，那么一個(gè)帶有給定數(shù)目重復(fù)序列例如5個(gè)"CAG"重復(fù)體的人中的樣品與這兩個(gè)探針雜交時(shí)，使之完全首尾相連。在其它包含測(cè)定值大于4(例如5或更多)或小于4(例如3或更少)的孔結(jié)合探針的孔中，也將發(fā)生雜交，但不會(huì)產(chǎn)生末端完全排列的雜交。利用DNA連接酶(使結(jié)合于同一條互補(bǔ)鏈上并且末端靠近的兩條DNA鏈共價(jià)相連的酶)，這兩個(gè)探針可以共價(jià)連接起來(lái)。而帶有重復(fù)序列合并以后數(shù)目大于5的探針對(duì)則會(huì)帶有末端突出鏈，不能與另一條鏈連接而同樣帶有合并以后重復(fù)序列數(shù)目小于5的探針則會(huì)在兩個(gè)探針末端之間形成缺口。在雜交和連接反應(yīng)之后，改變反應(yīng)條件使探針和靶分子分離(融化)，將導(dǎo)致帶有不是正好4個(gè)CAG重復(fù)序列孔結(jié)合探針的生物芯片的信號(hào)缺失。在雜合體中，兩個(gè)生物芯片將產(chǎn)生確定信號(hào)，分別給出兩個(gè)等位基因重復(fù)序列的長(zhǎng)度。因此本發(fā)明就能快速而準(zhǔn)確地測(cè)定人體Huntingtin基因中CAG重復(fù)序列的數(shù)目。這項(xiàng)用途可應(yīng)用于任何種類的帶有重復(fù)序列數(shù)量可變的遺傳病以及測(cè)量微衛(wèi)星DNA中重復(fù)序列的數(shù)量和在遺傳或獲得性條件下微衛(wèi)星不穩(wěn)定性中重復(fù)序列數(shù)目的不穩(wěn)定性。采用本方法測(cè)定微衛(wèi)星分布可以用于親了鑒定和法醫(yī)中對(duì)尸骸的鑒定。圖13描繪了上述介紹的原理在測(cè)定DNA重復(fù)序列中的應(yīng)用。在本例中采用的假定Huntingtin基因包含4個(gè)CAG重復(fù)序列。圖13A顯示了設(shè)計(jì)的小珠結(jié)合探針[15]帶有如下探針序列CTGGAAGGA，而"孔"結(jié)合探針[16]帶有如下序列GGTGGCGGCTGTTGCTGCTGCTG(SEQIDNO1)。如圖所示，上部鏈[17]是該特定患者中具有4個(gè)"CAG"重復(fù)序列的靶基因。僅僅描繪了與探針互補(bǔ)區(qū)域的實(shí)際核香酸序列。其它末端(5'[18]和3'[19])用箭頭表示。雜交的小珠結(jié)合探針[15]和孔結(jié)合探針[16]采用同樣的慣例來(lái)描繪。探針的下劃線部分(在圖上)代表位于重復(fù)序列區(qū)域邊上的非重復(fù)部分。圖中所示的是帶有與靶分子相匹配合并數(shù)目的重復(fù)序列(正好4個(gè))的兩個(gè)探針。這樣，這些探針的5'和3'端就可以在酶(DNA連接酶)的作用下連接起來(lái)。在圖13B中僅描繪了不同的"孔"結(jié)合探針[20]序列，而小珠結(jié)合探針是相同的。所述"孔"結(jié)合探針[20]位于同一微陣列中的另一塊生物芯片上。這里例舉出的"孔"結(jié)合探針僅有2個(gè)重復(fù)序列，導(dǎo)致兩個(gè)探針與靶分子雜交后存在一個(gè)缺口。兩個(gè)探針不能被連接起來(lái)。而在圖13C中則顯示出了帶有太多重復(fù)序列(數(shù)量為5)的"孔"結(jié)合探針[21]。因此雜交后多余部分形成"突出端"[22]。也不能形成連接。4、突變一企測(cè)與SNP描繪基因(有時(shí)非常大)中單點(diǎn)突變的常規(guī)檢測(cè)方法是基于將基因的區(qū)域擴(kuò)增，其缺點(diǎn)在于大片段無(wú)法擴(kuò)增，因此在經(jīng)濟(jì)而系統(tǒng)地研究給定人基因的點(diǎn)突變時(shí)能力有限。本發(fā)明所用的探針對(duì)("孔，，結(jié)合的和小珠結(jié)合的)可以根據(jù)非突變的基因序列的資料(可在公開的數(shù)據(jù)庫(kù)中找到)而被設(shè)計(jì)出來(lái)。探針對(duì)被設(shè)計(jì)成與連續(xù)的序列鏈互補(bǔ)。需要許多探針對(duì)覆蓋要研究基因的全長(zhǎng)，不同的"孔"結(jié)合探針連接到各自的生物芯片，而它們所針對(duì)的區(qū)域被貯存在卡盒獨(dú)特標(biāo)識(shí)符中。通過(guò)這樣的方式以及使之能重復(fù)使用的特殊設(shè)備結(jié)構(gòu)，就能快速、經(jīng)濟(jì)而系統(tǒng)地進(jìn)行基因突變的研究。同樣的方法可以用來(lái)確定單核苷酸多態(tài)性。首先要確定基因的序列。由于需要設(shè)計(jì)許多對(duì)探針跨越基因序列的全長(zhǎng)，因此一對(duì)探針中的一個(gè)探針與一條DNA鏈雜交而另一個(gè)探針則與其相鄰的序列雜交，雜交采用下述方式，當(dāng)兩者都與DNA雜交時(shí)一個(gè)探針的5'端就會(huì)遇到另一個(gè)探針的3'端。探針對(duì)中的一個(gè)探針連接到有特定位點(diǎn)的生物芯片上，而另一個(gè)探針則與小珠相連。在能辨別單核苷酸錯(cuò)配的環(huán)境中，例如最佳的氯化納濃度和/或退火溫度中在雜交和連接后出現(xiàn)小珠與生物芯片的連接。為了提高單個(gè)核苷酸錯(cuò)配的分辨能力，可以加入斷裂酶、錯(cuò)配修復(fù)酶或其它酶用來(lái)檢測(cè)或斷裂帶有錯(cuò)配的雙鏈DNA。探針對(duì)是這樣設(shè)計(jì)的，即當(dāng)與研究的基因雜交時(shí)，它們?cè)谄渖锨昂蟮嘏帕?，相鄰探針?duì)之間有一定程度的重疊，這樣就可以探測(cè)基因的全部序列而不會(huì)遺漏任何區(qū)域，如內(nèi)含子和外顯子。如果兩個(gè)探針之中的任一個(gè)與靶基因之間均沒有錯(cuò)配(這樣導(dǎo)致兩個(gè)探針都與之雜交)，那么DNA連接酶加入后就會(huì)使每一對(duì)探針連接起來(lái)。相鄰探針對(duì)由于序列的重疊而不會(huì)連接。采用這樣的方式，反應(yīng)之后不連接小珠的生物芯片給出了任意SNP的定位。這種"生物芯片標(biāo)記的"DNA鏈隨后可以通過(guò)一種核苷酸擴(kuò)增方法而被擴(kuò)增并且通過(guò)測(cè)序揭示SNP的類型。為了識(shí)別雜合體中的等位基因，采用了"數(shù)字截短測(cè)試(digitaltruncationtest)"的改進(jìn)方法(Traverso等)。利用96孔微量滴定板，基因組DNA經(jīng)稀釋等分到每個(gè)孔中。稀釋程度為在一個(gè)孔中僅存在一或兩個(gè)待測(cè)基因。每個(gè)孔都進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，使擴(kuò)增長(zhǎng)度片段可以涵蓋全部基因，因此在反應(yīng)結(jié)束后，每一個(gè)基因片段都有許多拷貝。隨后隨機(jī)選擇一些產(chǎn)物作為耙分子，用SNP或突變的生物芯片微陣列進(jìn)行分別檢測(cè)。由于在一些"靶分子"中只有一個(gè)等位基因，因此可以實(shí)現(xiàn)等位基因的識(shí)別。對(duì)于基因組DNA的變換形式，基因的mRNA可采用相似方式進(jìn)行探測(cè)。通過(guò)進(jìn)一步改變方法，也可以方便地用生物芯片微陣列來(lái)鑒定LOH和染色體的非整倍性?？梢栽谡＝M織和肺瘤組織的雜交反應(yīng)中利用針對(duì)某一染色體區(qū)域的已知微衛(wèi)星標(biāo)記，來(lái)比較其存在或缺失，如果兩個(gè)雜合等位基因中有一個(gè)缺失就可以標(biāo)識(shí)為L(zhǎng)OH。這一點(diǎn)結(jié)合突變4企測(cè)就可以成為公認(rèn)的腫瘤抑制基因進(jìn)行研究的有力工具。通過(guò)微衛(wèi)星標(biāo)記可方便地檢測(cè)腫瘤中染色體的非整倍性，并結(jié)合先有應(yīng)用形式，形成了以及基于幾個(gè)從脫落的上皮細(xì)胞(例如尿、宮頸)或經(jīng)皮針頭抽吸出來(lái)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因分布以及腫瘤診斷的一組重要工具。圖14描繪了本發(fā)明在鑒定SNP定位或點(diǎn)突變/缺失/插入中的應(yīng)用。設(shè)計(jì)了許多足以覆蓋給定基因全長(zhǎng)的探針對(duì)(連接到生物芯片和d、珠上)。如果由DNA連接酶介導(dǎo)的連接就會(huì)使'J、珠連接到生物芯片上(圖14A)。如果SNP存在于連接位點(diǎn)上，則沒有連接發(fā)生(圖14B)。如果其中一個(gè)探針在其它地方帶有單核苷酸錯(cuò)配(圖14C)，那么在特定溫度(Tm)或鹽濃度視窗的嚴(yán)格環(huán)境中就沒有雜交發(fā)生。加入識(shí)別和裂解帶有單個(gè)錯(cuò)配的雙鏈DNA的酶[23]例如裂解酶或錯(cuò)配修復(fù)酶，將使帶錯(cuò)配的探針裂解并防止兩個(gè)探針結(jié)合。其結(jié)果是生物芯片上小珠的缺失代表了包含SNP的DNA序列片段(圖14D，14E以及14F)。圖14F示出了這樣一個(gè)微陣列上的最后結(jié)果，即不帶有結(jié)合小珠的生物芯片顯示核酸鏈存在SNP或突變。隨后該鏈("生物芯片標(biāo)記的")可以在另一反應(yīng)中被擴(kuò)增，并被測(cè)序從而確定SNP。5、定量基因表達(dá)在科研中，科學(xué)家們經(jīng)常需要研究基因表達(dá)。在多細(xì)胞有機(jī)體中，攜帶相同一組基因的細(xì)胞經(jīng)過(guò)特化(specialize)而執(zhí)行多種的生理功能，例如覆蓋機(jī)體表面(外殼或皮膚)、吸收體液和電解質(zhì)(腸)以及與外界相互作用(神經(jīng)系統(tǒng))。結(jié)果，細(xì)胞需要一些僅在特化的細(xì)胞中表達(dá)而不在其它分化細(xì)胞中表達(dá)的工具。到目前為止，基因表達(dá)的研究是采用熒光探針或其它方式單個(gè)或利用微陣列進(jìn)行，在微陣列上印刷或連接了與信使RNA(或cDNA)雜交的探針分子，并產(chǎn)生了靶分子是否存在的定性結(jié)果。不用說(shuō)，這些微陣列不具有定量以低水平表達(dá)mRNA的能力。低水平表達(dá)也可能很重要，這是因?yàn)榧热患?xì)胞中蛋白質(zhì)濃度是動(dòng)態(tài)的，我們就無(wú)法知道低水平表達(dá)是否等同于少量蛋白質(zhì)的合成，以及是否代表產(chǎn)生和消耗的平衡。正如以上"定量(分子才企測(cè))"中所述，采用本發(fā)明來(lái)定量mRNA和相應(yīng)蛋白質(zhì)是很簡(jiǎn)單的。圖15描繪了利用微陣列和竟?fàn)幮越Y(jié)合原理來(lái)分別檢測(cè)mRNA(圖15A)和蛋白質(zhì)(圖15B)。；險(xiǎn)測(cè)方法已經(jīng)在圖IO和正文中描述過(guò)了。6、蛋白組單細(xì)胞有機(jī)體的蛋白組或多細(xì)胞有機(jī)體各種細(xì)胞的蛋白組中含有成千上萬(wàn)的蛋白質(zhì)。要研究這些蛋白質(zhì)之間以及它們與其它分子間的相互作用經(jīng)濟(jì)地研究蛋白質(zhì)與;白質(zhì)以及蛋白質(zhì)與其它分子之間相互作用的方法。在圖16中，描繪了微陣列用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。首先將細(xì)胞或有機(jī)體的各種蛋白質(zhì)分離出來(lái)并沉積在生物芯片微陣列的特定位點(diǎn)上。接著，將這些各種蛋白質(zhì)中的每一個(gè)分別結(jié)合到鐵磁小珠的表面。當(dāng)d、珠在合適的條件下通過(guò)適當(dāng)?shù)牧黧w載體被依次引入到生物芯片中時(shí)，就可以快速研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。可以相當(dāng)快的速度建立起來(lái)這種相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)。與功能已知的給定蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)很可能參與相同和相似的細(xì)胞功能(關(guān)聯(lián)作用)。通過(guò)加入或耗盡特定小分子而改變反應(yīng)環(huán)境能令人信服地增加蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用復(fù)雜性的信自在另一技術(shù)方案中，針對(duì)全部蛋白組(例如血漿的)的特異性抗體被培育出來(lái)，并特異地定位在生物芯片微陣列上。另一組針對(duì)蛋白組其他表型的特異性抗體也被培育出來(lái)。然后可以根據(jù)上述竟?fàn)幮越Y(jié)合原理利用生物芯片來(lái)檢測(cè)蛋白組中蛋白質(zhì)的濃度。7、藥物發(fā)現(xiàn)與篩選如果將藥物分子而不是蛋白連接到小珠上，前面的模式也可以用來(lái)研究藥物與蛋白組之間的相互作用。這是因?yàn)榫哂兴幚砘蚨纠砘钚缘乃幬锱c特定蛋白質(zhì)經(jīng)常顯示出物理相互作用或結(jié)合力。藥物在機(jī)體各部分的分布也受與各種蛋白結(jié)合的影響，這種結(jié)合不僅決定藥物分布也決定其藥物動(dòng)力學(xué)。通過(guò)將帶有特異性藥物的小珠依次放到生物芯片微陣列上，可以很方便地鑒定與藥物有親合力的蛋白質(zhì)。能夠快速進(jìn)行藥物的藥理活性和毒性篩選。在圖17中，描繪了與圖16中結(jié)構(gòu)相似的微陣列，而此次是用藥物與蛋白質(zhì)之間相互作用作為藥物篩選的基礎(chǔ)。替代結(jié)合到小珠上的各個(gè)蛋白質(zhì)文庫(kù)的是，用待篩選以確定可能藥理學(xué)數(shù)據(jù)或毒理學(xué)結(jié)論的藥物分子取代蛋白質(zhì)。更多應(yīng)用本發(fā)明還有許多可能應(yīng)用。不可能——列舉。下面再給出幾個(gè)例子。實(shí)施例1結(jié)核傳染的早期診斷結(jié)核分支桿菌(導(dǎo)致人結(jié)核病)的核糖核酸(rRNA)是AMPLIF正D頂結(jié)核分支桿菌直接測(cè)試中的檢測(cè)靶分子(參考文獻(xiàn)9-18)。在上述測(cè)試中需要進(jìn)行擴(kuò)增(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA))，而本發(fā)明僅需破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的簡(jiǎn)單過(guò)程。本發(fā)明可以檢測(cè)少至細(xì)菌rRNA的幾個(gè)拷貝，并且無(wú)需預(yù)先的擴(kuò)增。實(shí)施例2急性心肌梗塞的早期診斷急性心肌梗塞(心梗)及時(shí)的實(shí)驗(yàn)診斷可能拯救生命，這是因?yàn)榭梢蚤_始治療干預(yù)。這些干預(yù)并不是沒有本身危險(xiǎn)性，需要準(zhǔn)確的測(cè)試。到目前為止，測(cè)試既不夠靈敏也不特異。例如，急性心肌梗塞的最早癥狀是血清肌紅蛋白的濃度升高，它在心梗后6小時(shí)才能4企測(cè)到(參考文獻(xiàn)12-15)。然而，肌紅蛋白也存在于骨骼肌中，并且其濃度升高對(duì)于心肌傷害并非特異的，它需要通過(guò)第二個(gè)針對(duì)血清肌鈣蛋白T的檢測(cè)來(lái)證實(shí)2(http:〃www.roche.com/diagnostics/news/1998/981127a.html)。月幾4丐蛋白T為在肌血球素增加之后升高的標(biāo)志物。在急性心肌梗塞的早期進(jìn)行心臟肌鉤蛋白T的微量定量方法既要特異又要靈敏。用本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)這種可能。在這種應(yīng)用中，采用了以上"定量，，中描述的竟?fàn)幮越Y(jié)合原理。分折物是心臟肌4丐蛋白T,而兩個(gè)探針是針對(duì)肌4丐蛋白的抗體。兩個(gè)抗體應(yīng)該與心臟肌釣蛋白T的兩個(gè)不同表位具有結(jié)合親和力，這兩個(gè)表位彼此之間無(wú)相互影響(與兩個(gè)抗體結(jié)合的表位彼此不能太靠近以免干擾結(jié)合)。除了能夠檢測(cè)在急性心肌梗塞的發(fā)作早期(可能在心肌梗塞后6小時(shí)之內(nèi))、以前不能斗全測(cè)的循環(huán)心臟肌4丐蛋白T的數(shù)量，本應(yīng)用還可以對(duì)血清中這種蛋白質(zhì)的水平進(jìn)行定量(通過(guò)對(duì)已知濃度的肌鈣蛋白T進(jìn)行連續(xù)稀釋很容易實(shí)現(xiàn)儀器的校準(zhǔn))。實(shí)施例3病毒載量(load)的測(cè)定許多疾病是由病毒引起的，例如HIV(由人免疫缺陷病毒感染)。雖然該病可以通過(guò)抗病毒劑控制，但費(fèi)用很貴。因?yàn)椴《疽子谧儺悾皇撬谢颊咴诓煌瑫r(shí)期對(duì)相同藥物都敏感。監(jiān)控病毒載量是決定藥物療效和疾病狀況的一種手段。釆用本方法可以高度準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單快速而經(jīng)濟(jì)地確定病毒載量。;險(xiǎn)測(cè)原理如上所述。基因序列已知的任何病毒均可采用本方法。因此，雖然采用優(yōu)選技術(shù)方案對(duì)本發(fā)明的基本特征加入展示、描述和指出，但可以理解的是例舉的設(shè)備和其操作的形式和細(xì)節(jié)的各種遺漏、替代和變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神下就可以進(jìn)行的。例如顯然可以想到，實(shí)際上采取基本相同手段執(zhí)行功能相同獲得相同結(jié)果的所識(shí)到在本發(fā)明(結(jié)合任二公開形式^扭:術(shù)方案:描述和、/或顯示的結(jié)"和/或元件和/或方法步驟都可以以一般的設(shè)計(jì)選擇方式合并在任選其它公開或描述的或建議形式或技術(shù)方案中。因此本發(fā)明的保護(hù)范圍僅由權(quán)利要求的范圍限定。參考文獻(xiàn)I.InuninkKAS(1998).Thecompactdiscstory.Journaloftheaudioengineeringsociety46，458-465.2.ZhangDY,BrandwdnM,HsuihTCH，LiHongbo.Amplificationoftarget-specific,ligation-dependentcircularprobe.Gene211(1998)277-285.3.ZhangDY,BrandweinM，HsuihT,LiHB.Ramificationamplification:anovelisothermalDNAamplificationmethod.MolecularDiagnosis6(2001):141-150.4.ZhangDY，ZhangW，LiX,KonomiY.DetectionofrareDNAtargetsbyisothermalramificationamplification.Gene274(2001)209-216.5.UmekRM，LinSW，VielmetterJ，TerbrueggenRH，IrvineB，YuCJ，KayyemJF，YowantoH,BlackburnGF,FarkasDH，ChenY.Electronicdetectionofnucleicacids:aversatileplatformformoleculardiagnostics,JMolDiagn2002;3:74-84.6.ParkSJ，TatonTA，MirkinCA.Array-basedelectricaldetectionofDNAwithnanoparticleprobes.Science2002Feb22;295(5559):1503-6.7.BaseltDR,LeeGU,NatesanM,MetzgerSW，SheehanPE,ColtonRJ.Abiosensorbasedonmagnetoresistancetechnology.Biosensors&Bioelectr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ié)合的藥物復(fù)合物的溶液與支持物結(jié)合的蛋白質(zhì)接觸。為支持物提供旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；在旋轉(zhuǎn)支持物上的預(yù)定區(qū)域檢測(cè)小珠的存在情況，其中小珠的檢測(cè)結(jié)果代表藥物和蛋白質(zhì)之間的相互作用。7、一種檢測(cè)多種蛋白質(zhì)和多種藥物之間相互作用的方法，包括將多種蛋白質(zhì)中的每一種與小珠連接，以形成小珠結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物；將多種藥物中的每一種連接在支持物預(yù)定區(qū)域，以形成支持物結(jié)合的藥物；使含有小珠結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物的溶液與支持物結(jié)合的藥物接觸。為支持物提供旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；在旋轉(zhuǎn)支持物上的預(yù)定區(qū)域檢測(cè)d、珠的存在情況，其中小珠的檢測(cè)結(jié)果代表多種藥物和多種蛋白質(zhì)之間的相互作用。全文摘要一種利用靶分子、小珠結(jié)合探針以及支持物結(jié)合探針之間的分子間相互作用來(lái)檢測(cè)或定量樣品中靶分子的方法。在相互作用后可采用激光或磁傳感器檢測(cè)小珠。小珠的檢出結(jié)果代表樣品中靶分子的存在。文檔編號(hào)G01N33/543GK101538616SQ20091013813公開日2009年9月23日申請(qǐng)日期2003年4月9日優(yōu)先權(quán)日2002年4月9日發(fā)明者唐舜榮申請(qǐng)人:唐舜榮