專利名稱：用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品前處理方法，尤其是涉及一種用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法。
背景技術：
合成性激素是一類由動物性腺分泌或者人工合成的低分子量、強親脂性、具有生物活性的類固醇類物質。由于合成性激素具有增強食欲、抑制發(fā)情、增加體重等作用，并且極少量就能產生極大的促生效果。因而，動物源食品的生產者為了追求動物養(yǎng)殖的高經(jīng)濟效益，從20世紀50年代起，人工合成性激素常常被用于畜牧業(yè)生產中。
合成性激素的穩(wěn)定性較高，殘留于動物源食品中，正常的烹調、加工均不能將其破壞，這些合成性激素通過食物鏈進入人體，在人體內積累，當其含量超過人體正常水平時，就會破壞機體的正常生理平衡，從而產生不良反應。近年來的研究結果認為，兒童性早熟、男性女性化、婦女子宮癌、乳腺癌等病例發(fā)病率逐年升高與動物性食品中殘留的合成性激素有關。由此可見，合成性激素殘留對食品安全性帶來的問題不容忽視，巳引起公眾廣泛關注。世界各國都相繼出臺了禁藥令，嚴禁將合成性激素作為促生劑使用。我國發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》及農業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局第176號公告——《禁止在詞料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》即將巳烯雌酚、玉米赤霉醇、去甲雄三烯醇酮、醋酸甲孕酮、丙酸睪酮等19類合成性激素及具有合成性激素作用的獸藥列為違禁藥物，嚴禁在食品源動物飼養(yǎng)中使用。
為了保障食品安全，保護消費者的利益，準確檢測動物源食品中殘留的合成性激素具有十分重要的意義。當前，動物源食品中合成性激素的測定方法主要是氣相色譜-質譜(GC-MS)法和液相色譜-質譜(LC-MS)法。由于動物性食品中合成性激素的殘留量很低，常常在pg/kg水平，甚至ng/kg的水平；同時，復雜的食品基質樣品中的雜質會產生基質效應，從而干擾痕量合成性激素的確證和定量測定。因此，通過有效的樣品前處理方法包括提取、富集、凈化，使用于檢測分析的樣品液中目標合成性激素含量高，雜質少，有利于動物源食品中合成性激素的確證和定量測定，使分析結果更加準確。
當前，動物性食品中合成性激素殘留檢測的樣品前處理方法往往采用圖l所示步驟，在圖l所示的樣品前處理過程中，去脂是實驗成敗的關鍵技術之一，因為去脂效果不好會造成固相萃取柱的堵塞、基質效應較大，圖中指出的常用去脂方法存在如下缺陷(1)正己烷去脂因許多合成性激素的極性并不是很強而導致目標合成性激素的損失；(2)冷凍去脂需要花費較長的處理時間和較為苛刻的設備條件，并且該法僅僅對肌肉組織有用，而對于像魚肉等水產品及禽蛋等蛋制品仍然存在固相萃取柱堵塞的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的前處理過程中去脂效果好，目標合成性激素回收率高，基質效應有效消除的去脂方法。
本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為(l)結合態(tài)合成性激素殘留的酶解釋放向裝有動物源食品的離心管中加入酶解液，進行酶解反應；(2)合成性激素殘留的提取酶解反應完成后加入有機溶劑，渦旋振蕩混勻后，超聲提取，然后離心分離，取上清液，向固體殘渣中加入有機溶劑，重復上述步驟，合并兩次所得上清液；(3)脂類的去除向上清液中添加二價金屬鹽酸鹽，待沉淀析出，離心分離，取上清液；(4)目標合成性激素提取液的制備將去脂后的上清液轉移至雞心瓶中，在40-50'C下旋轉蒸發(fā)至近干，加入有機溶劑溶解，再加水稀釋，得目標合成性激素提取液；(5)固相萃取柱凈化將上述步驟所得目標合成性激素提取液載入活化好的固相萃取柱，淋洗液淋洗后，用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，加入有機溶劑，漩渦混勻，超聲溶解，濾膜過濾后，得到可直接上機用于檢測分析的樣品液。
所述二價金屬鹽酸鹽包括ZnCl2、 CaCl2、 MgCl2、 FeCl2 、 CdCl2, 二價金屬鹽在總提取液中的質量體積濃度為0.25-125 g/L。
所述固相萃取柱凈化的步驟包括，向LC-d8固相萃取柱中載入5mL甲醇、5mL水活化平衡后，將所得合成性激素提取液載入LC-d8固相萃取柱，并以5mL體積比為10%的甲醇水溶液或水洗滌雞心瓶上殘留的溶液，作為淋洗液淋洗LC-d8固相萃取柱，抽至近干，下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脫后，將LC-C18固相萃取柱去掉，再以2mL甲醇洗脫LC-NH2固相萃取柱，收集洗脫液于45-55
4'C下氮氣吹干，加入lmL體積比為50n/。的甲醇水溶液，超聲溶解，漩渦混勻，過0.2pm濾膜，得到可直接上機用于檢測分析的樣品液。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于首先二價金屬鹽酸鹽的去脂效率較高、操作
簡單，能夠在較短的時間內簡單的去除脂類物質，從而避免了固相萃取柱的堵塞現(xiàn)象；
其次二價金屬鹽酸鹽去脂能夠避免合成性激素的損失，從而可獲得較好的回收率。實驗
結果如表l所示，冷凍去脂效率低，且易堵塞固相萃取柱；正己烷去脂雖去脂效率高，但合成性激素回收率低；而本發(fā)明采用的二價金屬鹽酸鹽去脂克服了現(xiàn)有技術中正己垸去脂與冷凍去脂的缺點，不僅去脂效率高，并且合成性激素回收率也遠遠高于現(xiàn)有去脂技術，因此具有很好的推廣應用價值。
表l不同去脂方法的去脂效率和回收率分析結果
去脂方法去脂效率(％)樣品中添加4pg/kg合成性激素回 收率范圍(％)魚肉樣品蛋制品
正己烷去脂93±543-7340-77
冷凍去脂65±5堵塞固相柱堵塞固相柱
本發(fā)明去脂93±570-11875-11

圖1為當前合成性激素殘留檢測的樣品前處理流程。
具體實施例方式
以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
實施例1:魚肉樣品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法1、所用試劑及標準物質水超純水甲醇色譜純甲酸優(yōu)級純
標準物質甲基炔諾酮(Norgestrel)、甲基睪酮(Methyltestosterone)、丙酸睪酮
5(Testosterone propionate)、醋酸甲羥孕酮(Medroxyprogesteroue Acetate)、醋酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、醋酸氯地孕酮(Chlormadinone acetate)、諾龍(Nandrolone);炔雌醇(Ethinylestradiol); 17 a -雌二醇(l7a - Estadiol); 17 P -雌二醇(17P - Estadiol); a -玉米赤酶醇(a -Zeranol);雌酮(Estrone);雙烯雌酚(Dienestrol);己烷雌酚(Hexestrol);雌三醇(Estriol);雌二醇-"G(Estadiol-13C2);己稀雌酚-d8((Diethylstilbestrol)等標準品購自Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量均》98%;己稀雌酚(Diethylstilbestrol)購自Sigma-Aldrich,氖代諾龍(Nandrolone-d3)購自Toronto Research Chemicals Inc，含量98%; e -葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶。
2、 主要儀器及材料
液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)、離心機、固相萃取裝置、超聲儀、旋渦混合器、旋轉蒸發(fā)儀、氮吹儀、LC-ds固相萃取柱，LC-NH2固相萃取柱。
3、 樣品前處理過程
稱取5.0g已打碎魚制品樣品，準確至0.1g，置于50mL具塞塑料離心管中，若為加標樣品加入一定量的標準溶液及內標物(內標物濃度氘代諾龍-d3, 2pg/kg;雌二醇-"C2叫g/kg;己稀雌酚-d8，叫g/kg)，然后加入0.2mol/LpH-5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液10mL，再加入e-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶的酶解液5(HiL,于37'C水浴震蕩器中震蕩酶解12h，取出冷卻至室溫，加入15mL甲醇，渦旋振蕩混勻后，超聲提取15min, 10000r/min離心10min，上清液轉入另一潔凈離心管中，殘渣再以15mL甲醇重復提取一次，10000r/min離心10min,合并兩次所得上清液。向上清液中加入lgZnCl2固體，攪拌至ZnCl2完全溶解，此時有沉淀析出，10000r/min離心10min，上清液轉入100mL雞心瓶中，加入5mL正丙醇溶液，于45'C旋轉蒸發(fā)至近干，加入lmL甲醇超聲溶解后，再加入10mL水稀釋，得目標合成性激素提取液，留待固相萃取柱凈化。
LC-d8固相萃取柱以5mL甲醇、5mL水活化平衡后，將所得目標合成性激素提取液載入LC-d8固相萃取柱，并以5mL體積比為10%的甲醇水溶液或水洗滌雞心瓶上殘留的溶液，作為淋洗液淋洗LC-Q8固相萃取柱后抽至近干。下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脫后，將LC-C18固相萃取柱去掉，再以2mL甲醇洗脫LC-NH2固相萃取柱，收集全部甲醇洗脫液，于50'C下氮氣吹干，加入lmL體積比為50%的甲醇水溶液，漩渦混勻30s，超聲溶解30s，過0.2拜濾膜后上機測試。
分析結果顯示，正離子模式采用氖代諾龍-d3為內標物進行定量，添加水平為4pg/kg時，樣品中合成性激素平均回收率為70% 109%，相對標準偏差為6.2% 8.1%，；負離子模式中，雌三醇、炔雌醇、17 a -雌二醇、17 e -雌二醇、a -玉米赤酶醇以雌二醇-13C2為內標物進行定量，添加水平為4嗎/kg時，樣品中合成性激素平均回收率為86% 118%，相對標準偏差為4.5% 8.4%，雌酮、雙烯雌酚、己烷雌酚、己稀雌酚以己稀雌酚-ds為內標物進行定量，添加水平為4嗎/kg時，樣品中合成性激素平均回收率為79% 111%,相對標準偏差為5.2% 10.2%，符合國內外獸藥殘留檢測對方法的要求。
實施例2:蛋制品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法
1、 所用試劑及標準物質同實施例1。
2、 主要儀器及材料同實施例1。
3、 樣品前處理過程
稱取5.0g已打碎咸蛋樣品，準確至0.1g，置于50mL具塞塑料離心管中，若為加標樣品加入一定量的標準溶液及內標物(內標物濃度気代諾龍-d3, 2pg/kg;雌二醇-13C24Ug/kg;己稀雌酚-ds,年g/kg)，然后加入0.2mol/LpH-5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液10mL,再加入e-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶的酶解液50pL，于37'C水浴震蕩器中震蕩酶解12h，取出冷卻至室溫，加入15mL甲醇，渦旋振蕩混勻后，超聲提取15min, 10000r/min離心10min，上清液轉入另一潔凈離心管中，殘渣再以15mL甲醇重復提取一次，10000r/min離心10min，合并2次所得上清液。向上清液中加入lg的ZnCl2固體，攪拌至ZnCl2完全溶解，此時有沉淀析出，10000r/min離心10min，上清液轉入100mL雞心瓶中，加入5mL正丙醇溶液，于45'C旋轉蒸發(fā)至近干，加入lmL甲醇超聲溶解后，再加入10mL水稀釋，得目標合成性激素提取液，留待固相萃取柱凈化。
LC-ds固相萃取柱以5mL甲醇、5mL水活化平衡后，將所得目標合成性激素提取液載入LC-C18固相萃取柱，并以5mL體積比為10%的甲醇水溶液或水洗滌雞心瓶上殘留的溶液，作為淋洗液淋洗LC-d8固相萃取柱后抽至近干。下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脫后，將LC-C18固相萃取柱柱去掉，再以2mL甲醇洗脫LC-NH2固相萃取柱柱，收集全部甲醇洗脫液，于50'C下氮氣吹干，加入lmL體積比為50%的甲醇水溶液，漩渦混勻30s，超聲溶解30s,過0.2拜濾膜后上機測試。
分析結果顯示，正離子模式采用氘代諾龍-(13為內標物進行定量，添加水平為4jig負離子模式中，雌三醇、炔雌醇、17ci -雌二醇、170 -雌二醇、a -玉米赤酶醇以 雌二醇-"C2為內標物進行定量，添加水平為4嗎/kg時，樣品中合成性激素平均回收率 為90% 114%，相對標準偏差為3.5% 7.4%，雌酮、雙烯雌酚、己烷雌酚、己稀雌酚 以己稀雌酚-4為內標物進行定量，添加水平為4嗎/kg時，樣品中合成性激素平均回收 率為81% 110%，相對標準偏差為4.6% 9.1%，符合國內外獸藥殘留檢測對方法的要 求。
權利要求
1、一種用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法，其特征在于包括以下步驟(1)結合態(tài)合成性激素殘留的酶解釋放向裝有動物源食品的離心管中加入酶解液，進行酶解反應；(2)合成性激素殘留的提取酶解反應完成后加入有機溶劑，渦旋振蕩混勻后，超聲提取，然后離心分離，取上清液，向固體殘渣中加入有機溶劑，重復上述步驟，合并兩次所得上清液；(3)脂類的去除向上清液中添加二價金屬鹽酸鹽，待沉淀析出，離心分離，取上清液；(4)目標合成性激素提取液的制備將去脂后的上清液轉移至雞心瓶中，在40-50℃下旋轉蒸發(fā)至近干，加入有機溶劑溶解，再加水稀釋，得目標合成性激素提取液；(5)固相萃取柱凈化將上述步驟所得目標合成性激素提取液載入活化好的固相萃取柱，淋洗液淋洗后，用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，加入有機溶劑，漩渦混勻，超聲溶解，濾膜過濾后，得到可直接上機用于檢測分析的樣品液。
2、 根據(jù)權利要求1所述的用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法，其特征在于所述二價金屬鹽酸鹽包括ZnCl2、 CaCl2、 MgCl2、 FeCl2 、 CdCl2， 二價金屬鹽在總提取液中的質量體積濃度為0.25-125 g/L。
3、 根據(jù)權利要求1所述的用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法，其特征在于所述固相萃取柱凈化的步驟包括，向LC-d8固相萃取柱中載入5mL甲醇、5mL水活化平衡后，將所得合成性激素提取液載入LC-d8固相萃取柱，并以5mL體積比為10%的甲醇水溶液或水洗滌雞心瓶上殘留的溶液，作為淋洗液淋洗LC-ds固相萃取柱，抽至近干，下端接上已用5mL甲醇活化的LC-NH2固相萃取柱，以6mL的甲醇洗脫后，將LC-d8固相萃取柱去掉，再以2mL甲醇洗脫LC-NH2固相萃取柱，收集洗脫液于45-55'C下氮氣吹干，加入lmL體積比為50。/。的甲醇水溶液，超聲溶解，漩渦混勻，過0.2pm濾膜，得到可直接上機用于檢測分析的樣品液。
全文摘要
一種用于動物源食品中合成性激素殘留檢測的樣品去脂方法，其特征在于包括以下步驟(1)結合態(tài)合成性激素殘留的酶解釋放；(2)合成性激素殘留的提取酶解反應完成后加入有機溶劑提取，取上清液；(3)脂類的去除向上清液中添加二價金屬鹽酸鹽，待沉淀析出離心分離，取上清液；(4)目標合成性激素提取液的制備將去脂后的上清液蒸發(fā)近干加入有機溶劑與水，得目標合成性激素提取液；(5)固相萃取柱凈化將目標合成性激素提取液載入固相萃取柱，收集洗脫液，氮氣吹干加入有機溶劑溶解，濾膜過濾后上機測試。本發(fā)明的優(yōu)點在于去脂效率較高、操作簡單，并且能避免固相萃取柱的堵塞與目標合成性激素的損失，從而獲得較好的回收率。
文檔編號G01N30/00GK101655482SQ200910153118
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月16日 優(yōu)先權日2009年9月16日
發(fā)明者孫建強, 張愛芝, 堅 沈, 王全林 申請人:寧波市產品質量監(jiān)督檢驗研究院