專利名稱：測定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑。
背景技術(shù)：
N-乙酰-P -D-氨基葡萄糖苷酶(英文名N-acteyl- P -D-glucosaminidase ;英 文縮寫NAG;EC 3.2.1.30)是細胞內(nèi)溶酶體水解酶之一，分子量140， 000，血中的NAG不能 通過腎小球濾膜，NAG在腎單位中含量較高，尤其是在近曲小管上皮細胞中。
研究表明，NAG在糖尿病、高血壓腎小管早期損傷、藥物腎毒性以及感染、休克、腎 移植排異反應(yīng)等造成的急性腎小管損害時具有重要的檢測價值，也是環(huán)境腎毒性物質(zhì)對人 群影響的簡便篩查手段。尿酶有多種，其中NAG測定是目前應(yīng)用率最高的尿液酶學(xué)診斷項 目。它對腎小管損傷的反應(yīng)很靈敏。此外，用尿作標(biāo)本，又是一種無創(chuàng)傷性檢查，符合當(dāng)代 醫(yī)學(xué)檢驗方法的潮流，適合于日常檢驗和連續(xù)動態(tài)分析，也便于人群篩查的應(yīng)用。
目前，NAG在臨床應(yīng)用中的測定方法主要包括放免分析法、熒光分析法和可見分 光光度法等。放免分析法和熒光分析法都需要昂貴的儀器，且對底物溶液配制的要求較高 而不適于臨床的自動化分析。分光光度法從一開始就以合成色原底物為方法學(xué)主流。國內(nèi) 目前應(yīng)用最廣的是以對硝基苯-N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷(PNP-NAG)為底物做終點法 測定或以氯硝基苯-乙酰氨基葡萄糖苷(CNP-NAG)為底物做速率法測定。前者底物溶解度 和穩(wěn)定性較差，并且以其為底物測定NAG活性時，底物的分解產(chǎn)物對硝基酚在堿性條件下 的顯色與尿液的顏色非常接近，檢測時必須扣除尿液本身在405nm的吸光度，否則將導(dǎo)致 較大測量誤差，難以滿足臨床檢驗要求。后者檢測靈敏度僅為前者的1/3，通常以干粉形式 試劑盒提供臨床使用，需要將底物和緩沖液的混合物在6(TC保溫6h以上才能溶解，且混合 物fC只能穩(wěn)定7d，臨床實際使用十分不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種底物溶解度大，試劑穩(wěn)定性強，檢測 靈敏度高，臨床檢測方便、檢測成本低，且對NAG的測定結(jié)果受外界干擾小的測定N-乙 酰-P -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑。 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄 糖苷酶的液體試劑，該液體試劑由A(或稱為Rl) 、B(或稱為R2)兩個組份組成
A組份(Rl):
緩沖液 50 - 表面活性劑 0. 1
防腐劑 0. 1 B組份(R2): 5-[4-(3-甲氧基_苯甲烯)_繞丹寧]_3-乙酸銨-N-乙酰氨基_|3 _D_葡萄糖苷
0. 1 10,1/L
一 500mmol/L 100g/L 100g/L，
穩(wěn)定劑 1 100mmol/L 表面活性劑 0. l 100g/L
防腐劑 0. 1 100g/L。 上述的緩沖液為檸檬酸_檸檬酸三鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液、G00D'S 緩沖液或醋酸_醋酸鈉緩沖液等； 上述的表面活性劑為吐溫-20 (Tween-20)、吐溫-80 (Tween-80)、聚氧乙烯十二烷 醚(Brij 35)或聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)等非離子表面活性劑；
上述的穩(wěn)定劑為多元醇(如甘油、乙二醇等)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、牛 血清白蛋白(BSA) 、 13 -環(huán)糊精或甘露醇等； 上述的防腐劑為疊氮鈉(NaN3)或PC防腐劑(如4_氯_3， 5_ 二甲基苯酚)等。 利用上述測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑測定體液(尿液、血
液)樣本中的NAG:采用行業(yè)內(nèi)常規(guī)的固定時間兩點法(或稱為兩點終點法)測定，溫度為
37°C， Rl :樣本R2(體積比)為300 : 20 : IOO，測定波長為485 505nm。 本發(fā)明上述的5- [4- (3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨
基-P-D-葡萄糖苷，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
<formula>formula see original document page 4</formula> 該化合物的外觀為淡黃色到黃色結(jié)晶型粉末，分子式為C21H27N301QS2 *H20。熔點為
165 173°C (熔融時分解)，比旋度[a]D = +18° 。元素分析實驗結(jié)果為C， 44. 65% ;H，
5. 33% ;N，7. 28%。理論計算為C21H27N3010S2 H20 :C，44. 75% ;H，5. 19% ;N，7. 4%。 本發(fā)明上述5- [4- (3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨
基_ 13 -D-葡萄糖苷的合成方法，合成路線如下<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula> 本發(fā)明突出的實質(zhì)性特點及顯著進步主要表現(xiàn)在 1)采用本發(fā)明的測定N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，利用固定時 間兩點測定法測定N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶，測定波長為505nm，較目前臨床所用 405nm波長紅移，因此，色原干擾小，能夠滿足臨床檢驗要求。 2)本發(fā)明液體試劑以5-[4_(3-甲氧基_苯甲烯)_繞丹寧]_3-乙酸銨_N_乙酰 氨基-P -D-葡萄糖苷作為底物溶解度好，在2(TC水中的溶解度可達到lOmmol，因此解決了 目前臨床應(yīng)用中因底物溶解度差帶來的使用不便。 3)以5- [4- (3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨_N_乙酰氨基_ P _D_葡萄 糖苷為底物，結(jié)合本發(fā)明中使用的防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖液和表面活性劑配制成的本發(fā)明的 測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，在2 『C至少可穩(wěn)定12個月，穩(wěn)定性 好，以本發(fā)明液體穩(wěn)定劑測定NAG方法和試劑可以應(yīng)用于目前廣泛使用的臨床生化自動分 析儀，從而達到大規(guī)模測定樣本的要求。 4)采用本發(fā)明的測定N-乙酰-P-D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，能夠直接用于 體液樣品中N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的測定，無需復(fù)溶，因此，檢測方法簡便、易操 作，可快速得到檢測結(jié)果，不需要特殊或額外的儀器，便于行業(yè)內(nèi)推廣應(yīng)用，檢測成本低。
<formula>formula see original document page 6</formula>具體實施方式

實施例 實施例1為5-[4_(3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]_3-乙酸銨-N-乙酰氨
基-P-D-葡萄糖苷的合成。 實施例1 (1)將3. llg N-乙酰氨基葡萄糖(購自廣州偉伯化工有限公司)溶于10ml乙酸 酐中，加入高氯酸0. lml， 3(TC攪拌2h，冷卻至8°C以下，加入紅磷0. 5g，緩緩滴入2. 25g溴， 10°C反應(yīng)3h，再加入冰水5ml，然后過濾去除紅磷，所得濾液用5ml 二氯甲烷萃取2次，合并 有機相，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌一次，再用水洗一次得到含化合物C的二氯甲烷溶液
(2)向步驟(1)所得的含化合物C的二氯甲烷溶液中加入四丁基溴化銨O. 45g，將 1. 07g香草醛和2g碳酸鈉合10ml水混合成溶液，攪拌條件下將上述含香草醛D的溶液加 入到含化合物C和四丁基溴化銨的上述反應(yīng)體系中，加熱至40°C，反應(yīng)6h，反應(yīng)完成后，靜 置、分層，分出有機相(有機層)，所得水相(水層)用二氯甲烷萃取2次，合并萃取液(即 含有二氯甲烷的萃取層)，減壓濃縮除去萃取液中的二氯甲烷，所得濃縮物即化合物E ;
(3)將步驟(2)所得化合物E加入到15ml甲醇中，加熱到4(TC溶解，然后再加入 7ml醋酸，lg鋅粉，然后在4(TC下反應(yīng)4h，趁熱過濾去除鋅粉，所得濾液冷卻、析晶，然后過 濾、干燥，所得晶體即4-醛基-2-苯甲氧基-2-乙酰氨基-2-脫氧-e-D-葡萄糖糖苷(11);
(4)將步驟(3)所得的4-醛基-2-苯甲氧基-2-乙酰氨基-2-脫氧-!3-D-葡萄 糖糖苷溶在200ml 75X的乙醇中，然后再依次加入氯化銨2.25g，繞丹寧-3-乙酸(I)(購 自日本TCI) 2. 69g，然后在50°C下不斷攪拌反應(yīng)2h，過濾，所得濾渣用熱的甲醇清洗，然后 干燥，得5-[4- (3-甲氧基_苯甲烯)_繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨基-13 -D-葡萄糖苷 (111)，產(chǎn)率68%。
上述合成步驟中提到的化合物A、化合物c、化合物E、1和n、ni等均見

發(fā)明內(nèi)容
中的合成路線中所對應(yīng)的化合物。 實施例2-4為利用上述合成的5-[4-(3_甲氧基-苯甲烯)_繞丹寧]_3_乙酸
銨-N-乙酰氨基-13 -D-葡萄糖苷為底物配制本發(fā)明的測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷
酶的液體試劑，及利用本發(fā)明的液體試劑測定NAG的方法 實施例2表面活性劑選用Tween-20，穩(wěn)定劑選用BSA。 A組份(Rl) :pH 5. 0的檸檬酸_檸檬酸三鈉緩沖液 200mmol/L Tween-20 2g/L NaN3 lg/L， B組份(R2): 5- [4- (3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨_N_乙酰氨基_ P _D_葡萄糖苷 液 3,1/L
BSA 10,1/L
Tween-20 2g/L
NaN3 lg/L。
300 :
校準(zhǔn)品
150
基卡
基卡
測定樣本時，采用固定時間兩點法，溫度為37 °C， Rl :樣本R2 = 20 : 100(體積比)，測定波長為505nm， Rl加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本(定標(biāo)時加標(biāo)準(zhǔn)品或 ，檢測樣本時加樣本)后，孵育300s后讀取第一點吸光度，然后再加入R2繼續(xù)孵育 300s后讀取第二點吸光度。
實施例3表面活性劑選用Brij 35，穩(wěn)定劑選用e-環(huán)糊精。
A組份(Rl) :pH 5. 0甘氨酸緩沖液 50mmol/L
Brij 35 0.5g/L
NaN3 lg/L，
B組份(R2) :5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨 -D-葡萄糖苷液
4mmol/L P-環(huán)糊精 lOOmmol/L Brij 35 0.5g/L
NaN3 lg/L。
實施例3的測定方法與實施例2相同。
實施例4 :表面活性劑選用Tween-80，穩(wěn)定劑選用甘油。
A組份(Rl) :pH 5.0Tris lOOmmol/L
甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨
Tween-80 lg/L NaN3 lg/L， B組份(R2) :5-[4-(3--D-葡萄糖
苷液 10,1/L 甘油 100,1/L Tween-80 lg/L NaN3 lg/L。
實施例4的測定方法與實施例2相同。
以上實施例是對本發(fā)明的說明和進一步解釋，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明
的精神和權(quán)力保護范圍內(nèi)所做的任何修改，都落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種測定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征在于該液體試劑由A、B兩個組份組成A組份緩沖液50～500mmol/L表面活性劑0.1～100g/L防腐劑0.1～100g/L，B組份5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷 0.1～10mmol/L穩(wěn)定劑1～100mmol/L表面活性劑0.1～100g/L防腐劑0.1～100g/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征 在于上述A組份中的緩沖液為檸檬酸_檸檬酸三鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、Tris緩沖液、 GOOD' S緩沖液或醋酸_醋酸鈉緩沖液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征在 于上述A組份或B組份中的表面活性劑為吐溫-20、吐溫-80、聚氧乙烯十二烷醚或聚乙二 醇辛基苯基醚。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征在 于上述B組份中的穩(wěn)定劑為多元醇、乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白、!3-環(huán)糊精或甘露醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征在 于所述的多元醇為甘油或乙二醇。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定N-乙酰-13 -D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征在 于上述A組份或B組份中的防腐劑為疊氮鈉或PC防腐劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求e所述的測定N-乙酰-e-D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，其特征在于所述的PC防腐劑為4-氯-3， 5- 二甲基苯酚。A組份緩沖液表面活性劑防腐劑B組份穩(wěn)定劑表面活性劑防腐劑
全文摘要
本發(fā)明公開一種測定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液體試劑，該試劑以5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯)-繞丹寧]-3-乙酸銨-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷為底物，加上合適的緩沖液、表面活性劑、防腐劑和穩(wěn)定劑等配制而成，本發(fā)明提供的液體試劑具有底物溶解度大，試劑穩(wěn)定性強，檢測靈敏度高，臨床檢測方便、檢測成本低，且對N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的測定結(jié)果受外界干擾小的優(yōu)點。
文檔編號G01N21/31GK101738379SQ20091015596
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月31日
發(fā)明者沃燕波, 胡治寶, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技有限公司