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      人骨唾液酸蛋白elisa檢測試劑盒的制作方法

      文檔序號:5859972閱讀:212來源:國知局
      專利名稱:人骨唾液酸蛋白elisa檢測試劑盒的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本實用新型涉及人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,是一種人血清中骨重吸收相 關(guān)標(biāo)志物骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)的檢測試劑盒。
      背景技術(shù)
      骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein, BSP)是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種酸性糖蛋白,其 組織分布相對局限,主要分布在礦化組織(如骨、牙齒)和鈣化的軟骨與骨的交界區(qū),其含 量約占骨細(xì)胞外基質(zhì)中非膠原蛋白質(zhì)的15%。近年研究發(fā)現(xiàn)BSP的表達(dá)水平與骨質(zhì)疏松癥 和腫瘤骨轉(zhuǎn)移等疾病關(guān)系較為密切,血清BSP含量有望作為骨質(zhì)疏松癥和乳腺癌、肺癌、腎 癌、前列腺癌、甲狀腺癌等腫瘤骨轉(zhuǎn)移預(yù)測的標(biāo)志物之一。目前,檢測血清BSP含量方法包括放射免疫分析法和ELISA法二種。其中,放射 免疫分析法不僅需要特定的儀器、操作較為復(fù)雜,而且工作人員在操作時存在受到放射性 損害的風(fēng)險,環(huán)境存在受到放射性污染的可能,因此安全性較差;而現(xiàn)有技術(shù)的ELISA檢測 法需要依賴進(jìn)口試劑盒,由于這種進(jìn)口試劑盒結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價格昂貴,因此其應(yīng)用受到一定限 制,不適宜推廣應(yīng)用。

      實用新型內(nèi)容本實用新型目的,是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的ELISA檢測法存在進(jìn)口試劑盒結(jié)構(gòu)復(fù) 雜、價格昂貴的缺點,提供一種廉價、簡便的人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,并具有操 作簡單、檢測快速、準(zhǔn)確,靈敏度高、成本低和穩(wěn)定好的特點。本實用新型的目的主要通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔酶標(biāo)板、一張蓋 板膜、13瓶試劑和放置試劑瓶的模具,其結(jié)構(gòu)特點在于96孔酶標(biāo)板是在微孔條上預(yù)包被 鼠抗人BSP單抗(一抗)制成的檢測板;13瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn) 品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液(二抗),1瓶羊抗兔IgG-HRP濃縮液(酶標(biāo)三抗),1瓶 顯色液,1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液;所述模具包括13個下凹瓶位,其與 13瓶試劑一一對應(yīng)。本實用新型的目的還可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)本實用新型的一種實施方式是盒體是硬紙盒;96孔酶標(biāo)板由96孔聚苯乙烯酶標(biāo) 板構(gòu)成、放于真空鋁箔袋內(nèi);蓋板膜是透明硬塑料貼膜;6個濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn) 品溶液分別用自然色透明聚丙烯微量離心管裝載,兔抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙 烯微量離心管裝載,羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃色透明聚丙烯微量離心管裝載,濃縮洗滌 液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶裝載,樣本緩沖液用藍(lán)色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載, 顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶裝載,終止液用綠色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載; 下凹瓶位用塑料泡沫制成。本實用新型的一種實施方式是96孔酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆裝
      3式12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成,每個可拆裝式微孔條有8個反應(yīng)孔,每個反應(yīng)孔預(yù)包被鼠抗 人BSP單抗;蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致;標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶、Iml/瓶,濃度分別為 2,8,16,32,64,128ng/ml ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶、Iml/瓶;兔抗人BSP多抗?jié)饪s液1瓶, 200 μ 1/瓶;羊抗兔IgG-HRP濃縮液1瓶,200 μ 1/瓶;顯色液1瓶、15ml/瓶,終止液1瓶、 15ml/瓶;濃縮洗滌液1瓶、IOOml/瓶;樣本緩沖液1瓶、15ml/瓶。本實用新型的一種實施方式是盒內(nèi)還設(shè)有一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢 報告書。本實用新型具有的有益效果如下1、本實用新型具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉,以及快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測血清BSP含 量的特點。2、實驗表明本實用新型試劑盒具有很高的靈敏度血清的最低檢測限為1. 5ng/ ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為2-lOOng/ml,回收率為80. 5 % 士 11. 2 %,相對于放射免疫分析 法和進(jìn)口的同類ELISA試劑盒,本試劑盒無放射性污染,更安全,成本低,靈敏度高。

      圖1為本實用新型中模具的結(jié)構(gòu)俯視圖。
      具體實施例具體實施例圖1構(gòu)成具體實施例的模具。本實施例公開一種人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,包括盒體和盒內(nèi)的一塊96 孔酶標(biāo)板、一張蓋板膜、13瓶試劑和放置試劑瓶的模具,96孔酶標(biāo)板是在微孔條上預(yù)包被 鼠抗人BSP單抗(一抗)制成的檢測板;13瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn) 品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液(二抗),1瓶羊抗兔IgG-HRP濃縮液(酶標(biāo)三抗),1瓶 顯色液,1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液;所述模具包括13個下凹瓶位,其與 13瓶試劑一一對應(yīng)。盒內(nèi)還設(shè)有一個自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報告書。如圖1所示,泡沫塑料模具1有13個下凹瓶位,與13瓶試劑一一對應(yīng),其對應(yīng)位 置依次為50ml濃縮洗滌液位于下凹瓶位2,200 μ 1 二抗?jié)饪s液位于下凹瓶位3,200 μ 1酶 標(biāo)三抗?jié)饪s液位于下凹瓶位4,15ml樣本緩沖液位于下凹瓶位5,15ml顯色液位于下凹瓶位 6,15ml終止液位于下凹瓶位7,6種濃度Iml/瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液及Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液位于 下凹瓶位8。本實施例中96孔酶標(biāo)板由96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板構(gòu)成、放于真空鋁箔袋內(nèi);蓋板膜是透明硬塑 料貼膜;6個濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用自然色透明聚丙烯微量離心管裝 載,兔抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙烯微量離心管裝載,羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃 色透明聚丙烯微量離心管裝載,濃縮洗滌液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶裝載,樣本緩 沖液用藍(lán)色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載,顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶裝載,終 止液用綠色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載;下凹瓶位用塑料泡沫制成。96孔酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆裝式12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成,每
      4個可拆裝式微孔條有8個反應(yīng)孔,每個反應(yīng)孔預(yù)包被鼠抗人BSP單抗;蓋板膜大小與酶標(biāo)板 橫切面大小一致;標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶、Iml/瓶,濃度分別為2,8,16,32,64,128ng/ml ;高濃度 標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶、Iml/瓶;兔抗人BSP多抗?jié)饪s液1瓶,200 μ 1/瓶;羊抗兔IgG-HRP濃縮 液1瓶,200 μ 1/瓶;顯色液1瓶、15ml/瓶,終止液1瓶、15ml/瓶;濃縮洗滌液1瓶、IOOml/ 瓶;樣本緩沖液1瓶、15ml/瓶。本實施例的制作方法如下采用預(yù)包被鼠抗人BSP單抗的96孔酶標(biāo)反應(yīng)微孔條 制成檢測板,放入真空鋁箔袋中,以塑料硬貼膜為蓋板膜,將50ml濃縮洗滌液,15ml樣本緩 沖液,Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液,不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶,Iml/瓶,200 μ 1兔抗人BSP多抗 濃縮液,200 μ 1羊抗兔IgG-HRP濃縮液等試劑用不同大小和顏色的塑料瓶和微量離心管盛 裝,并按照圖1所示位置分別固定于泡沫塑料模具1中,與試劑板、蓋板膜一同封裝于紙盒 內(nèi)。其中,6個濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用自然色透明聚丙烯微量離心管,兔 抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙烯微量離心管,羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃色透明聚 丙烯微量離心管,濃縮洗滌液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶,樣本緩沖液用藍(lán)色帽的白 色聚乙烯塑料瓶,顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶,終止液用綠色帽的白色聚乙烯 塑料瓶;每一個試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔),既可一次同時檢 測多個樣品,也可拆開微孔條進(jìn)行多次檢測。檢測時,樣本中BSP將被酶標(biāo)板上預(yù)包被的一 抗捕獲,加入二抗后,二抗被BSP捕獲,然后加入酶標(biāo)三抗,被捕獲于板上的二抗與酶標(biāo)三 抗結(jié)合,最后用TMB顯色。樣本吸光度值與樣本中的BSP含量呈正相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較, 再乘以稀釋倍數(shù)10,即可得出血清樣品中BSP含量,其操作簡便易行。將本實用新型試劑盒用于血清BSP含量的檢測的具體步驟如下一、樣本準(zhǔn)備將人血清按照1 10體積比進(jìn)行稀釋(1份血清+9份樣本緩沖 液),存于-20°C待測。二、試劑準(zhǔn)備洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按照1 20體積比進(jìn)行稀釋(或按 需要量稀釋),(1份IOX濃縮洗滌液+19份去離子水),稀釋后將工作液存放于密封瓶中, 在2-8°C可保存1個月,用于酶標(biāo)板的洗滌和抗體的稀釋。三、試劑盒的操作步驟1、從4°C冷藏環(huán)境取出所需試劑,置室溫(20-25°C )平衡30min以上。2、取出框架和所需數(shù)量的微孔條,將不用的微孔條放回自封袋,保存于2_8°C。3、編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的微孔按序編號,每個標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并 記錄各孔的位置。4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本100 μ 1/孔到各自的微孔中,用蓋板膜蓋板 后,避光,37°C孵育2hr??瞻卓字患訕颖揪彌_液。5、洗板小心揭開蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,加入洗滌工作液,250 μ 1/孔,洗5次; 最后一次甩出孔內(nèi)液體后,將微孔條反扣于吸水紙上拍干。6、二抗稀釋將二抗?jié)饪s液用洗滌工作液按1 100體積比進(jìn)行稀釋(1份抗體濃 縮液+99份洗滌工作液)。7、加二抗加入二抗工作液100μ 1/孔,37°C孵育lhr,重復(fù)洗板步驟6。8、稀釋酶標(biāo)三抗將酶標(biāo)三抗?jié)饪s液用洗滌工作液按1 100體積比進(jìn)行稀釋(1
      5份抗體濃縮液+99份洗滌工作液)。9、加酶標(biāo)三抗加入酶標(biāo)三抗工作液100μ 1/孔,37°C孵育lhr,重復(fù)洗板步驟6。10、顯色加入底物液100μ 1/孔,用蓋板膜蓋板后,37°C避光,顯色5-15min。11、測定吸光度值加入終止液50 μ 1/孔,輕輕振蕩均勻,在酶標(biāo)儀450nm處測每 孔的OD值,參考波長620nm(20min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))。12、計算結(jié)果12. 1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為縱坐標(biāo),以BSP標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的對數(shù) 為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。12. 2計算將樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出對應(yīng)的濃度,乘以稀 釋倍數(shù)10,即為樣品中BSP含量。注意事項1、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥情況,則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性、重復(fù)性不 好的現(xiàn)象,所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。2、每加一種試劑前需將其搖勻。3、反應(yīng)終止液為IM硫酸,應(yīng)避免接觸皮膚。4、不要使用過了有效日期的試劑盒,也不要使用過期試劑盒中的任何試劑,否則 可能引起靈敏度降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。5、儲存條件本試劑盒存于2_8°C,不可冷凍;將不用的微孔條放進(jìn)自封袋重新密 封;顯色劑對光敏感,因此要避免直接暴露于光線下。6、顯色劑使用前應(yīng)無色,有任何顏色均表明已經(jīng)變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。7、加入底物液后,一般顯色時間為5-15min。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時間到 20min或更長,但不要超過30min.反之,則減短反應(yīng)時間。8、本試劑盒中試劑含疊氮鈉作為殺菌劑,該物質(zhì)有毒。酶顯色反應(yīng)底物TMB也有 毒性,且有致癌性,避免接觸皮膚和粘膜。
      權(quán)利要求人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,包括盒體和盒內(nèi)的96孔酶標(biāo)板、蓋板膜、13瓶試劑和放置試劑瓶的模具(1),其特征是96孔酶標(biāo)板是在微孔條上預(yù)包被鼠抗人BSP單抗制成的檢測板;13瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液,1瓶羊抗兔IgG HRP濃縮液,1瓶顯色液,1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液;模具(1)包括13個下凹瓶位,其與13瓶試劑的對應(yīng)關(guān)系分別是濃縮洗滌液位于下凹瓶位(2)、兔抗人BSP多抗?jié)饪s液位于下凹瓶位(3)、羊抗兔IgG HRP濃縮液位于下凹瓶位(4)、樣本緩沖液位于下凹瓶位(5)、顯色液位于下凹瓶位(6)、終止液位于下凹瓶位(7)、6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液和1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液位于下凹瓶位(8)。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,其特征是盒體是硬紙 盒;96孔酶標(biāo)板由96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板構(gòu)成、放于真空鋁箔袋內(nèi);蓋板膜是透明硬塑料貼 膜;6個濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用自然色透明聚丙烯微量離心管裝載, 兔抗人BSP多抗?jié)饪s液用紅色透明聚丙烯微量離心管裝載,羊抗兔IgG-HRP濃縮液用黃色 透明聚丙烯微量離心管裝載,濃縮洗滌液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶裝載,樣本緩沖 液用藍(lán)色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載,顯色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶裝載,終止 液用綠色帽的白色聚乙烯塑料瓶裝載;下凹瓶位用塑料泡沫制成。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,其特征是96孔酶標(biāo)板 由外框支撐架及放置其上的可拆裝式12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成,每個可拆裝式微孔條有8 個反應(yīng)孔,每個反應(yīng)孔預(yù)包被鼠抗人BSP單抗;蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致;標(biāo)準(zhǔn) 品溶液6瓶、Iml/瓶,濃度分別為2,8,16,32,64,128ng/ml ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液1瓶、Im/瓶; 兔抗人BSP多抗?jié)饪s液1瓶,200 μ 1/瓶;羊抗兔IgG-HRP濃縮液1瓶,200 μ 1/瓶;顯色液 1瓶、15ml/瓶,終止液1瓶、15ml/瓶;濃縮洗滌液1瓶、IOOml/瓶;樣本緩沖液1瓶、15ml/ 瓶。
      專利摘要本實用新型涉及人骨唾液酸蛋白ELISA檢測試劑盒,包括盒體和96孔酶標(biāo)板、蓋板膜、13瓶試劑和模具(1),其特征是酶標(biāo)板是在微孔條上預(yù)包被鼠抗人BSP單抗制成的檢測板;13瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗?jié)饪s液,1瓶羊抗兔IgG-HRP濃縮液,1瓶顯色液,1瓶終止液、1瓶濃縮洗滌液和1瓶樣本緩沖液;模具(1)包括13個下凹瓶位,對應(yīng)關(guān)系分別是濃縮洗滌液位于下凹瓶位(2)、兔抗人BSP多抗?jié)饪s液位于下凹瓶位(3)、羊抗兔IgG-HRP濃縮液位于下凹瓶位(4)、樣本緩沖液位于下凹瓶位(5)、顯色液位于下凹瓶位(6)、終止液位于下凹瓶位(7)、標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液位于下凹瓶位(8)。本實用新型具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉,以及快速、簡便、準(zhǔn)確地檢測血清BSP含量的特點。
      文檔編號G01N33/68GK201666897SQ20092026358
      公開日2010年12月8日 申請日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
      發(fā)明者夏冰, 王捷 申請人:廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院
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