C2orf18作為癌癥治療和診斷的靶基因的制作方法

文檔序號：5864057閱讀：642來源：國知局

專利名稱：C2orf18作為癌癥治療和診斷的靶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和診斷癌癥(特別是胰腺癌)的存在或者發(fā)生癌癥的傾向 (predisposition)的方法。本發(fā)明還涉及治療和預防癌癥(特別是胰腺癌)的方法。特別地，本發(fā)明涉及C2orfl8，一種在癌癥中被特異上調(diào)的基因，以及其作為癌癥治療靶標和診斷標志的用途。
背景技術(shù)：
癌癥是主要的死亡原因，全世界每年有數(shù)百萬人死于癌癥。特別地，胰腺癌是惡性腫瘤中致死率最高的癌癥之一，患者的5年存活率為4%。每年有大約28000名患者被診斷患有胰腺癌，并且?guī)缀跛谢颊呔虿∷劳?Greenlee，R.T.，etal.，(2001)CA Cancer J Clin, 51: 15-36)。這種惡性腫瘤的不良預后是由于其難以早期診斷和對現(xiàn)在的治療方法響應差所導致的(Greenlee，R.T.，et al. (2001) CA Cancer J Clin, Ji: 15-36， Klinkenbijl, J.H., et al. (1999) Ann Surg，230 776-82; discussion 782-4.)。胰腺導管腺癌(PDAC)是西方國家中位列第四的癌癥致死原因，也是普通惡性腫瘤中具有最高致死率的癌癥之一，患者的5年存活率僅為5% (DiMagno EP，et al.Gastroenterology. 1999 Dec ； 117(6) 1464-84.1, WrayCJ, etal.Gastroenterology.2005 May； 128(6) 1626-41.2)。2007年，美國預計有大約37,170名新患者被診斷患有胰腺癌，并且接近 33,370 名將死于胰腺癌(JemalA，et al.CA Cancer J Clin.2007 Jan-Feb ； 57(1) : 43-66.3)。目前，PDAC唯一可治愈的方法是手術(shù)切除。然而，因為大多數(shù)PDAC是在很晚期的階段才被診斷出來，所有在診斷出時只有15% -20%的患者可進行手術(shù)切除。在接受了有治愈可能的手術(shù)的患者中，大多數(shù)患者最終會復發(fā)并死于該疾病(WrayCJ，et al.Gastroenterology.2005 May ； 128 (6) 1626-41.2)。某些方法結(jié)合手術(shù)和化療(包括吉西他汀或5-FU)，進行或不進行放射，能改善患者的生活質(zhì) 量(DiMagno EP，et al.Gastroenterology.1999 Dec ； 117 (6) 1464-84.1，Wray CJ, etal. Gastroenterology.2005 May ； 128(6) 1626-41.2)。然而，這些治療對 PDAC 患者長期生存的效果非常有限，因為PDAC的侵襲性極高，并且對化療有抵抗性。為了應對這種嚴峻的狀況，通過鑒定分子靶標開發(fā)PDAC的新型分子治療方法是現(xiàn)在亟待解決的問題。前人已經(jīng)使用了基因組范圍的cDNA陣列，結(jié)合使用激光顯微解剖，獲得了用于檢測的純化癌細胞群體，生成了精細的PDAC細胞表達譜(見 Nakamura T，et al.0ncogene.2004 Mar25 ； 23(13) 2385-400，本文引用作為參考)。線粒體對于細胞生物能學至關(guān)重要，在決定細胞凋亡過程中發(fā)揮核心作用 (Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。癌相關(guān)的細胞代謝變化會影響線粒體功能(Warburg effect, Galluzzi L, et al.Oncogene.2006Aug 7 ； 25 (34) 4812-30.)，并可能參與癌的存活能力，特別是在低毒性條件下。而且，細胞凋亡失效已經(jīng)與線粒體外膜透化(permeabilization) (MOMP)被抑制聯(lián)系起來。在理論上，開發(fā)靶定線粒體蛋白的特異治療干預方法是吸引人的(Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。許多實驗性的治療劑能夠直接靶定線粒體，從而誘導細胞凋亡。這些試劑的實例包括被設計成模擬Bcl-2樣蛋白Bcl-2同源域3的試劑(Walensky LD, et al.Science.2004 Sep 3 ； 305(5689) 1466-70.),外周型苯并二氮卓受體配體(Decaudin D, etal.CancerRes.2002 Mar 1 ； 62(5) 1388-93.),和兩性陽離子(Ellerby HM，et al.Nat Med. 1999 Sep ； 5(9) 1032-8.)。這些MOMP誘導劑或促進劑能夠自身誘導細胞凋亡，或者在聯(lián)合治療中促進細胞凋亡的誘發(fā)，從而克服任何針對DNA損傷劑的化療耐受性 (Taniuchi K, et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)一種新的在胰腺癌細胞中特異上調(diào)的基因靶標，C2orfl8(染色體2開放閱讀框18)，解決了本領(lǐng)域?qū)Ω倪M胰腺癌診斷和治療的需求。發(fā)明的公開
發(fā)明概要鑒于前述，本發(fā)明的一個目的是提供用于檢測、診斷、預后評估和/或治療癌癥(特別是胰腺癌)的新方法。在完成本發(fā)明的過程中，通過微陣列分析鑒定了一個新基因C2orfl8，其在胰腺癌細胞(特別地，PDAC細胞)中特異過表達，并且其在癌細胞中的過表達被RT-PCR和免疫組織化學分析所證實。因為C2orfl8在成年正常器官中局限性地表達，所以它可能是具有極小副作用的新型治療方法的合適而有前景的分子靶標。功能上，通過SiRNA敲低胰腺癌細胞系中的內(nèi)源C2orfl8可急劇抑制胰腺癌細胞的生長，表明它在保持胰腺癌細胞生存能力中方面起著至關(guān)重要的作用。免疫細胞化學分析和細胞分級分離(cell fractionation)隨后進行western印跡分析的結(jié)果顯示C2orfl8位于線粒體，提示C2orfl8在癌細胞中可能參與細胞凋亡或能量內(nèi)穩(wěn)平衡。因此，本發(fā)明的一個目的是通過確定受試者來源生物樣品(例如活組織檢查)中 C2orfl8的表達水平來提供檢測或診斷對象體內(nèi)癌癥、確定發(fā)生癌癥的傾向、和/或監(jiān)視癌癥(特別是胰腺癌)的治療過程的方法。C2orfl8的表達水平與正常對照水平相比增力口，表明對象罹患或者具有發(fā)生癌癥(特別是PDAC)的危險。在本發(fā)明的方法中，可以利用合適的探針檢測C2orfl8基因，或者可以利用抗_C2orfl8抗體檢測C2orfl8蛋白。本發(fā)明進一步提供了鑒定可抑制C2orfl8基因表達或其基因產(chǎn)物活性的作用劑的方法。如在本文中將更詳細討論地，本發(fā)明涉及下述發(fā)現(xiàn)C2orfl8與ANT2之間的相互作用，及該作用參與線粒體膜電位保持以及細胞凋亡。因此，本發(fā)明的一個目的是提供鑒定可抑制C2orfl8與ANT2之間相互作用的作用劑的方法。本發(fā)明的一個進一步的目的是提供鑒定用于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病，例如癌癥如胰腺癌，更特別地是PDAC，的候選作用劑的方法，或者鑒定用于在這些疾病狀態(tài)下抑制細胞生長的候選作用劑的方法。本發(fā)明的方法可以在體外或體內(nèi)實施。C2orfl8基因的表達水平和/或其基因產(chǎn)物的生物活性在存在測試劑時比不存在測試劑時降低，表明該測試劑是C2orfl8的抑制劑，并可能用于抑制過表達C2orfl8的細胞(例如癌細胞如胰腺癌細胞，更特別地是PDAC)的生長?？梢岳煤蜻x作用劑通過抑制癌癥生長來降低胰腺癌，特別是PDAC的癥狀。本發(fā)明的另外一個目的是提供通過施加可抑制C2orfl8基因表達和其基因產(chǎn)物即 C2orfl8蛋白的功能的作用劑來抑制過表達C2orfl8的癌性細胞生長的方法。優(yōu)選地，該作用劑是抑制性核酸(例如反義分子、核酶、雙鏈分子)。該作用劑還可以是用于提供雙鏈分子的核酸分子或載體。通過向靶細胞內(nèi)引入足以抑制C2orfl8基因表達的量的雙鏈分子可以抑制該基因的表達。本發(fā)明還提供了用于抑制受試者體內(nèi)過表達C2orfl8的癌性細胞生長的方法，以及用于罹患癌癥(特別是胰腺癌)的受試者的治療或預防方法。在另一個方面中，本發(fā)明涉及用于治療或預防癌癥(特別是胰腺癌)的藥物組合物，其包括作為活性成分的雙鏈分子或編碼該雙鏈分子的載體，以及合適的可藥用載體。本發(fā)明的雙鏈分子在引入細胞內(nèi)時可抑制C2orfl8基因的表達，并抑制過表達C2orfl8的癌性細胞的生長。例如，這些分子可以被設計成靶定與SEQIDNO 11的核苷酸殘基196-214 或核苷酸殘基574-592部分相應的序列。本發(fā)明的雙鏈分子包括有義鏈和反義鏈，其中有義鏈包括含有靶序列的序列，并且其中反義鏈包括與有義鏈互補的序列。分子的有義鏈和反義鏈彼此雜交形成本發(fā)明的雙鏈分子。本發(fā)明進一步的目的是提供針對C2orfl8的抗體。該抗體用具有氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)和 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)的多肽作為抗原產(chǎn)生。這些抗體可用于診斷癌癥(特別是胰腺癌)的免疫染色測定。在另一個方面中，本發(fā)明提供了用于檢測、診斷或預后癌癥(特別是胰腺癌)的檢測試劑或試劑盒，其包括抗_C2orfl8抗體。在本發(fā)明中，具有氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)的肽特別適用于制備抗-C2orfl8抗體。因此，本發(fā)明的一個目的是提供這些肽以及制備抗_C20rfl8抗體的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，本發(fā)明的一個或多個方面可以滿足某些目的，而其它一個或多個方面可以滿足某些其它的目的。每一個目的可能不在全部方面均同等地適用于本發(fā)明的每一個方面。例如，前述的各個目的可以擇一地適用于本發(fā)明的每個方面。在聯(lián)系附圖和實施例閱讀下面的詳細說明時，本發(fā)明的這些和其它的目的和特征將變得更加顯而易見。然而，應當理解，前面的本發(fā)明概要和后面的詳細說明僅僅提出了優(yōu)選的實施方案，并不對本發(fā)明或者本發(fā)明的可替換實施方案構(gòu)成限制。特別地，盡管本文中通過參考多個具體實施方案描述了本發(fā)明的，但是應當意識到，這些描述是本發(fā)明的舉例說明，不應認為對本發(fā)明具有限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以進行各種修改和應用，而不背離如附加權(quán)利要求所述的本發(fā)明的精神和范圍。類似地，本發(fā)明的其它目的、特征、益處和優(yōu)點可以從本概要和下面所述的某些實施方案變得顯而易見，并且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言也更容易顯見。通過上文并聯(lián)系附加實施例、數(shù)據(jù)、附圖和由其獲得的所有合理推論，或者同時考慮本文引用的參考文獻，這些目的、特征、益處和優(yōu)點將變得顯而易見。

在考慮下文的附圖簡述和本發(fā)明的詳細說明及其優(yōu)選實施方案時，技術(shù)人員將對本發(fā)明的各個方面和應用顯而易見[圖1]“C2orfl8在PDAC細胞中的過表達”部分(A)顯示了在顯微解剖的PDAC 細胞(1-9)中C2orfl8和TUBA的mRNA表達的RT-PCR結(jié)果，并與同樣被顯微解剖的正常胰腺導管上皮細胞(NPD)和成人生命器官(vitalorgans)相比較。Pane 正常胰腺， BM骨髓。部分(B)顯示了 Northern印跡分析的結(jié)果，其顯示C2orfl8在前列腺、甲狀腺、腎上腺組織中微弱表達，在幾乎所有胰腺癌細胞系中高表達，但在生命器官中的表達非常有限。部分(C)顯示了 Western印跡分析的結(jié)果，其使用從兩只家兔血清純化出的抗_C2orfl8抗體(批號192和批號193)檢測PDAC細胞系中的內(nèi)源C2orfl8。PDAC 細胞系中PAPM的表達高于正常細胞系(NIH3T3，HEK-293,和C0S7)。beta-肌動蛋白作為上樣對照。部分(D)顯示了使用抗-C2orfl8抗體的免疫組織化學研究結(jié)果，其中在PDAC細胞中觀察到了強烈染色(Clx200，C2x400, C3x400)。在PDAC細胞的細胞質(zhì)內(nèi)觀察到了 C2orfl8的強陽性染色。在正常胰腺組織中，腺泡細胞和正常導管上皮細胞沒有顯示染色(N，x400)。[圖2]“ C2orfl8-siRNA對PDAC細胞生長的影響”部分(A)顯示了 siRNA 對PDAC細胞系MIA_PaCa2 (左)禾Π Panc-I (右)內(nèi)C2orfl8的敲低效果。對用每種針對C2orfl8的siRNA-表達載體(#196，#574，和#3254)和作為陰性對照載體的siEGFP 進行半定量RT-PCR，結(jié)果#196和#574確認了敲低效果，而siEGFP和#3254則沒有。 beta2-MG用于定量RNA。部分(B)顯示了分別用標示的針對C2orfl8的siRNA-表達載體(#196，#574，和#3254)和陰性對照載體(siEGFP)轉(zhuǎn)染的MIA-PaCa2 (左)和 Panc-I (右)細胞的集落形成測定。細胞與遺傳霉素溫育14天然后用0.1%結(jié)晶紫染色以顯現(xiàn)。部分(C)顯示了分別用標示的針對C2orfl8的siRNA-表達載體(#196，#574，和 #3254)和陰性對照載體(siEGFP)轉(zhuǎn)染的MIA_PaCa2 (左)禾Π Panc-I (右)細胞的MTT 測定結(jié)果。與遺傳霉素溫育14天后，將每個平均值與指示SD (標準偏差)的誤差線一起繪圖。Y軸上的ABS表示490nm的吸光度，630nm吸光度作為參比，吸光度用酶標儀 (microplate reader)測量。這些實驗重復實施三次。**表示P值< 0.01 (Students' t_檢驗)。[圖3]“C2orfl8在PDAC細胞內(nèi)的定位”部分(A)顯示了使用抗_C2orfl8的免疫細胞化學分析的結(jié)果，其中陽性信號(綠色)在PDAC細胞細胞質(zhì)中呈囊泡模式(vesicular pattern)(左上圖)被檢測到。這些抗_C2orfl8抗體信號(綠色)與MitoTracker信號(紅色右上圖)部分重合。這些抗-C2orfl8抗體信號在用siRNA敲低C2orfl8后消失(右下圖)，而它們在用對照siRNA(siEGFP)處理的細胞質(zhì)內(nèi)仍保持呈囊泡模式(左下圖)。部分(B)顯示了用抗-C2orfl8抗體的Western印跡分析結(jié)果，其證明C2orfl8定位于細胞質(zhì)，并且僅存在于線粒體組分中。使用抗線粒體內(nèi)膜蛋白(mitofilin)抗體檢測線粒體組分。部分(C)顯示了免疫沉淀測定及隨后的質(zhì)譜結(jié)果，其中ANT2被鑒定為與C2orfl8 相互作用的蛋白的候選物。用C2orfl8-HA表達載體和/或ANT2-Flag表達載體共轉(zhuǎn)染 COS7細胞。含有C2orfl8-HA或ANT2_Flag的蛋白復合體分別被抗-HA抗體(左圖) 或抗-Flag抗體(右圖)從細胞提取物中免疫沉淀下來。使用抗-Flag抗體進行Western 印跡表明，當兩種表達載體共轉(zhuǎn)染時，ANT2-Flag與C2orfl8-HA免疫共沉淀(左圖箭頭所示)。使用抗-HA抗體的Western印跡表明，當兩種表達載體共轉(zhuǎn)染時，C2orfl8_HA與ANT2-Flag免疫共沉淀(右圖箭頭所示)。[圖4]“C2orfl8/ANT2BP參與線粒體膜電位(Apsim)和細胞凋亡”部分(A) 顯示了轉(zhuǎn)染研究的結(jié)果，其中PDAC細胞KLM-I用ANT2 siRNA、C2orfl8/ANT2BP siRNA、或siEGFP (作為對照)轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染48h后收集。使用抗_C2orfl8/ANT2BP 抗體的Western印跡分析確認了 C2orfl8/ANT2BPsiRNA對KLM-1細胞的敲低效果。部分 (B)顯示了熒光測定的結(jié)果，其中細胞用若丹明123和PI溫育，通過FACS分析測量熒光。X-軸上的若丹明123 (Rhl23)強度反映了 Apsi m，X軸上的PI (碘化丙錠)滲透性反映了死細胞細胞膜的破壞。低水平的RM23強度和陰性PI滲透性指示早期凋亡細胞，其中線粒體Apsim降低但細胞凋亡沒有完全完成，而低水平的Rhl23強度和陽性PI滲透性指示死細胞。與對照相比(siEGFP，19% ),當ANTBP2 (25 % )或ANT2 (26 % )被敲低時，低Apsim和陰性PI滲透性的細胞數(shù)目顯示增加。部分(C)顯示了 TUNEL測定的結(jié)果，證明與siEGFP轉(zhuǎn)染的細胞相比，敲低Panc-I細胞中的C2orfl8可增加凋亡細胞的數(shù)目(TUNEL陽性細胞用綠色指示)。制備用DNase I處理的透化細胞作為TUNEL 測定的陽性對照。圖(D)顯示了通過流式細胞儀計數(shù)的TUNEL陽性細胞的數(shù)目。在柱狀圖中，X-軸反映了 TUNEL-陽性細胞的綠色信號的強度。在柱狀圖上向右偏移表明與SiRGFP轉(zhuǎn)染的細胞相比，敲低C2orfl8可增加TUNEL陽性細胞的數(shù)目。發(fā)明的公開盡管與這里所介紹的相似或等價的方法和材料也可用于實施或檢測本發(fā)明的實施方案，但是現(xiàn)在介紹的是優(yōu)選的方法和材料。然而，應當理解，本發(fā)明并不僅限于這里所介紹的特定的方法學和實驗方案，因為這些可以根據(jù)常規(guī)的實驗和優(yōu)化加以改變。還應當理解，說明書中使用的術(shù)語只是出于介紹特定的版本或?qū)嵤┓桨傅哪康?，并不?圖限制本發(fā)明的范圍。除非特別定義，否則這里使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共同理解的相同的意思。然而，在出現(xiàn)矛盾時，以本說明書包括定義為準。因此，在本發(fā)明的內(nèi)容中，適用如下的定義。其他的定義視情況散在于下文中。^X除非特別指出，否則這里使用的詞語“一”、“一個”和“該”的意思是“至少一個”。如這里所使用的，術(shù)語“生物體”是指任何由至少一個細胞構(gòu)成的活的實體。活的生物體可以簡單到例如單個真核細胞，或者復雜到哺乳動物，例如人類。如這里所使用的，術(shù)語“生物樣品”是指整個生物體或其組織、細胞或組成部分(例如體液，包括但不僅限于，血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血(amniotic cord blood)、尿液、陰道分泌物和精液)的子集(subset)。術(shù)語“生物樣品”進一步指從整個生物體或其細胞、組織或組成部分的子集制備的勻漿、裂解物、提取物、細胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或其級分或部分。最后，“生物樣品”指含有細胞組分(例如蛋白質(zhì)或多核苷酸)的介質(zhì)，例如生物體已在其中繁殖的營養(yǎng)湯或凝膠。在本發(fā)明的內(nèi)容中，受試者來源的樣品可以是從測試受試者，例如已知或懷疑患有癌癥(更具體地說，胰腺癌)的受試者獲得的任何組織。更具體地，組織可以是來自胰腺癌或PDAC的上皮細胞。
術(shù)語“分離的”和“ 純化的”在本文中關(guān)于某種物質(zhì)(例如多肽、抗體、多核苷酸等)使用時，是指該物質(zhì)基本上不含至少一種在其天然來源中本來會有的物質(zhì)。因此，“分離的”或“純化的”抗體是指這樣的抗體，其基本上不含(freeof)來自該蛋白質(zhì)(抗體)所來源的細胞或組織的細胞材料，例如碳水化合物、脂質(zhì)或其它污染蛋白質(zhì)，或者當其為化學合成時，基本上不含化學前體或其它化學劑。術(shù)語“基本上不含細胞材料”包括這樣的多肽制備物，其中該多肽是從細胞分離或在細胞中重組產(chǎn)生的，而與該細胞的其它細胞組分是分開的。因此，基本上不含細胞材料的多肽包括如下的多肽制備物，其具有少于大約30%，20%, 10%, 5%, 2%或(重量比)的異源蛋白質(zhì)(在這里也稱作“污染蛋白質(zhì)”)。當多肽為重組產(chǎn)生時，還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)介質(zhì)，其包括如下的多肽制備物，其含有的培養(yǎng)介質(zhì)少于蛋白制備物體積的大約20%，10%或5%。當多肽為化學合成產(chǎn)生時，優(yōu)選其基本上不含化學前體或其它化學劑，包括這樣的多肽制備物其具有的參與該蛋白質(zhì)合成的化學前體或其它化學劑少于蛋白質(zhì)制備物量的大約30%，20%, 10%, 5%, 2%或(干重)。特定蛋白制備物含有分離或純化多肽可以例如這樣來證明對該蛋白制備物進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳并對凝膠進行考馬斯亮藍染色等后顯示單條條帶。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是分離的或純化的?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子，例如CDNA分子，可以是基本上不含其它細胞材料的，或者當其為通過重組技術(shù)產(chǎn)生時，基本上不含培養(yǎng)介質(zhì)，或者當其為化學合成時，基本上不含化學前體或其它化學劑。在優(yōu)選實施方案中，編碼本發(fā)明抗體的核酸分子是分離的或純化的。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在這里可以互換使用，用于指示氨基酸殘基的聚合體。該術(shù)語適用于如下氨基酸聚合體，其中一個或多個氨基酸殘基是被修飾的殘基，或者非天然存在的殘基，例如相應的天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸聚合體的人工化學模擬物。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及與天然存在的氨基酸具有相似功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼子編碼的氨基酸，以及在細胞內(nèi)翻譯后被修飾的氨基酸(例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和ο-磷酸絲氨酸)。詞組“氨基酸類似物”是指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結(jié)構(gòu)(α 碳與一個氫、一個羧基、一個氨基和一個R基團連接)，但具有經(jīng)過修飾的R基團或經(jīng)過修飾的骨架的化合物(例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍)。詞組“氨基酸模擬物”是指這樣的化合物，其具有與一般氨基酸不同的結(jié)構(gòu)，但發(fā)揮與一般氨基酸相似的功能。在這里，氨基酸可以用它們公知的三字母符號表示，或者用IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦的單字母符號表示。在本發(fā)明的內(nèi)容中，術(shù)語“數(shù)個”，例如用于氨基酸添加、刪除和/或替換時，意思是3-7個、優(yōu)選地3-5個，更優(yōu)選地3-4個，甚至更優(yōu)選地3個氨基酸殘基。除非另外具體指出，術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸” 和“核酸分子”可以互換使用，并且與氨基酸相似，可以用它們普遍接受的單字母編碼表示。與氨基酸相似，它們涵蓋天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸或核酸分子可以由DNA、RNA或其組合構(gòu)成。在本發(fā)明的內(nèi)容中，詞組“對照水平”是指在對照樣品中檢測到的基因或蛋白質(zhì)表達水平，并且可以包括(a)正常對照水平或(b)癌癥特異性對照水平，更具體地說，胰腺癌特異性對照水平。對照水平可以是來自單個參考群體的單一表達模式，或者由多個表達模式構(gòu)成。詞組“正常對照水平”是指在正常、健康個體中或者在已知沒有罹患癌癥(例如胰腺癌如PDAC)的個體群體中檢測到的基因表達水平。正常個體是沒有癌癥(例如胰腺癌如PDAC)的臨床癥狀的個體。另一方面，“胰腺癌(PC)對照水平”或
“PDAC對照水平”分別是指在罹患胰腺癌(PC)和胰腺導管腺癌(PDAC)的群體中發(fā)現(xiàn) 的基因表達水平。測試樣品與PC或PDAC對照之間C2orfl8表達水平相似分別表示對象(獲得測試樣品的對象)罹患或者具有發(fā)生PC或PDAC的危險。根據(jù)本發(fā)明，當基因的表達水平比對照水平增加到至少1.1倍，優(yōu)選地超過1.5倍，優(yōu)選地超過2.0倍，優(yōu)選地超過5.0 倍，優(yōu)選地超過10.0倍或者更多倍時，認為特定基因的表達水平“增加”。類似地，當基因的表達水平比對照水平降低至少1.1倍，優(yōu)選地超過1.5倍，優(yōu)選地超過2.0倍，優(yōu) 選地超過5.0倍，優(yōu)選地超過10.0倍或者更多倍時，認為特定基因的表達水平“降低”。 C2orfl8基因表達可以通過例如RT-PCR或Northern印跡分析確定受試者組織樣品的 C2orfl8 mRNA,或者通過例如對受試者組織樣品進行免疫組織化學分析檢測由C2orfl8 編碼的蛋白質(zhì)，來加以確定。C2orfl8 基因和 C2orfl8 蛋白本發(fā)明部分地基于如下的發(fā)現(xiàn)，即與非癌組織相比，編碼C2orfl8的基因在 PDAC中過表達。C2orfl8在這里還被稱作PAMP(胰腺癌線粒體蛋白)。本發(fā)明涉及 C2orfl8基因和由其編碼的C2orfl8蛋白，以及它們在胰腺癌診斷和治療中的用途。鑒定的C2orfl8的cDNA長度為3912個核苷酸。C2orfl8的核酸和多肽序列分別如SEQ ID NO: 11和12所示。這些序列數(shù)據(jù)還可以通過如下的登錄號獲得。C20RF18/ C2orfl8/ANT2BP ΝΜ_017877在本發(fā)明的內(nèi)容中，功能等價物也被看作是“C2orfl8多肽”。這里，蛋白的“功能等價物”是指具有與蛋白相同生物活性的多肽。也就是，任何保留C2orfl8 蛋白生物能力的多肽在本發(fā)明中均可用作這種功能等價物。在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選地，C2orfl8功能等價物所保留的生物能力是與天然C2orfl8蛋白相關(guān)的促進細胞增殖活性。生物樣品的促細胞增殖活性可以通過檢測增殖速度或者通過測量細胞周期或集落形成能力來加以確定。這些活性可以用傳統(tǒng)技術(shù)和標準測定方法常規(guī)地進行測定，例如可以使用能夠從ATCC (Manassas，VA)獲得的MTT細胞增殖測定或來自 Lonza(BaselSwitzerland)的 ViaLight Assay。同樣感興趣的是天然 C2orfl8 蛋白結(jié)合 ANT2的能力。功能等價物的實例包括在天然存在的C2orfl8蛋白氨基酸序列中替換、刪除、添加或插入了一個或多個氨基酸的多肽?；蛘?，所述多肽可以包括如下的氨基酸序列，其與各自蛋白的序列具有至少大約80%同源性(也稱作序列同一性)，更優(yōu)選地至少大約 90%-95%同源性，甚至更優(yōu)選地99%同源性。在其它實施方案中，多肽可以由這樣的多核苷酸編碼，其在嚴格條件下可以和天然存在的C2orfl8基因核苷酸序列雜交。
本發(fā)明的多肽可以在氨基酸序列、分子量、等電點、是否存在糖鏈、或者形式上有差異，這取決于用于產(chǎn)生它的細胞或宿主或者所用的純化方法。然而，只要它與本發(fā)明的人類C2orfl8蛋白具有等價的功能，它就處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。詞組“嚴格(雜交)條件”是指如下的條件，在該條件下核酸分子與其靶序列雜交，典型地在復雜的核酸混合物中，但不會與其它序列發(fā)生可檢測的雜交。嚴格條件是序列依賴的，在不同的環(huán)境下會不同。較長的序列在更高的溫度下特異雜交。在 Tijssen, Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Probes, " Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)中有關(guān)于核酸雜交的詳盡指導。一般地，嚴格條件選擇為在限定的離子強度pH下，比特定序列的熔點(Tm)低大約5-10°C。Tm是在平衡狀態(tài)下有50%的與靶標互補的探針與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度)(因為靶序列過量存在，所以在Tm下，平衡時有50%的探針占據(jù))。嚴格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺加以實現(xiàn)。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號至少是背景的2倍，優(yōu)選地是背景雜交的10倍。嚴格雜交條件的實例包括如下50%甲酰胺，5xSSC，和1%SDS，在42攝氏度溫育，或者5xSSC，1% SDS,在65攝氏度溫育，用0.& SSC和0.1 % SDS 在50攝氏度清洗。在本發(fā)明的內(nèi)容中，用于分離編碼與人類C2orfl8蛋白功能等價的多肽的DNA 的雜交條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地進行選擇。例如，雜交可以如下地實施，使用“Rapid-hyb緩沖液“(Amersham LIFE SCIENCE)在68°C實施預雜交30分鐘或者更長，添加標記探針，并在68°C溫育1小時或者更長時間。隨后的清洗步驟可以在例如低嚴格條件下實施。低嚴格條件的實例可以包括42攝氏度，&SSC，0.1% SDS,優(yōu)選地 50攝氏度，&SSC，0.1% SDS0高嚴格條件經(jīng)常被優(yōu)選地使用。高嚴格條件的實例可以包括在室溫下用2x SSC，0.01% SDS清洗三次，每次20分鐘，然后在37攝氏度用Ix SSC, 0.1% SDS清洗三次，每次20分鐘，在50攝氏度用Ix SSC，0.1% SDS清洗兩次，每次20分鐘。然而，多種因素，例如溫度和鹽濃度，會影響雜交的嚴格性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠適當?shù)剡x擇這些因素以獲得所需的嚴格度。一般地，已知修飾蛋白質(zhì)中的一個或多個氨基酸不會影響蛋白的功能。實際上，突變的或經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)，具有通過對某氨基酸序列進行替換、刪除、插入和/或添加一個或多個氨基酸殘基而進行修飾的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，已知可以保留原始的生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81 5662-6 (1984) ； Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 6487-500 (1982) ； Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79 6409-13(1982))。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到，對氨基酸序列進行的改變單個氨基酸或少量氨基酸的單獨添加、刪除、插入或替換，或那些被視為“保守修飾”的修飾(其中蛋白質(zhì)改變所產(chǎn)生的蛋白具有相似的功能)，是本發(fā)明內(nèi)容可以接受的。只要蛋白質(zhì)保持該活性，則氨基酸突變的數(shù)目沒有特定限制。然而，一般優(yōu)選地改變氨基酸序列的5%或者更少。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，在這樣的突變體中被突變的氨基酸的數(shù)目一般是30個氨基酸或者更少，優(yōu)選地20個氨基酸或者更少，更優(yōu)選地10個氨基酸或者更少，更優(yōu)選地6個氨基酸或者更少，甚至更優(yōu)選地3個氨基酸或者更少被突變的氨基酸殘基優(yōu)選地被突變成不同的氨基酸，但氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)保守 (這個過程稱作保守氨基酸替換)。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的實例是疏水氨基酸(A，I，L， M，F(xiàn)，P, W，Y，V),親水氨基酸(R，D，N，C，E，Q, G，H, K，S，T)，和共同具有如下官能團或性質(zhì)的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S， T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿基側(cè)鏈(R， K，H)；和含芳香族側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)。提供功能相似氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，下面的8組，每一個所含的氨基酸彼此是保守替換的1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸⑴，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見例如 Creighton，Proteins 1984)。這些保守修飾的多肽包含在在本發(fā)明的內(nèi)容中，只要它們保留天然C2orfl8蛋白的生物活性，就把它們視為“C2orfl8多肽”。然而，本發(fā)明并不僅限于此，C2orfl8多肽可以包括非保守修飾，只要保留C2orfl8蛋白的至少一種生物活性即可(例如促進細胞增殖)。而且，被修飾的蛋白質(zhì)不排除多態(tài)性變異體、種間同源物和由這些蛋白的等位基因編碼的蛋白。而且，本發(fā)明的C2orfl8基因包括如下的多核苷酸，其編碼C2orfl8蛋白的功能等價物。除了雜交之外，基因擴增方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)方法，也可用于分離編碼與C2orfl8蛋白功能等價的多肽，其使用根據(jù)蛋白編碼DNA (SEQ ID NO: 11)的序列信息合成的引物。分別與人類C2orfl8基因和蛋白功能等價的多核苷酸和多肽通常與原始的核苷酸或其氨基酸序列具有高同源性?！案咄葱浴钡湫偷厥侵竿葱詾?0% 或者更高，優(yōu)選地60%或者更高，更優(yōu)選地80%或者更高，甚至更優(yōu)選地90%-95% 或者更高。特定多核苷酸或多肽的同源性可以通過如下的算法加以確定“Wilbur andLipman, Proc Natl Acad Sci USA 80 726-30 (1983)“。^^ 本發(fā)明還提供了針對C2orfl8的抗體，或這些抗體的免疫活性片段。這些抗體可用于檢測C2orfl8的特異表達。在本發(fā)明的內(nèi)容中，使用特異針對C2orfl8的多克隆抗體進行免疫組織化學分析確證了其在胰腺癌細胞內(nèi)的過表達，而在正常成人生命器官 (心臟、肺、腎臟、肝臟和腦)中則沒有或者僅有非常有限的表達。因此，本發(fā)明的抗體可用于檢測來自受試者的組織活檢中的C2orfl8蛋白，診斷C2orfl8相關(guān)疾病，例如胰腺癌如PDAC，和治療這些疾病。而且，本發(fā)明的抗體可用作對C2orfl8進行功能分析的有用的工具。本發(fā)明的抗體可以通過使用具有在CRAAGQSDSSVDPQQPF(SEQID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)中提出的氨基酸序列的C2orfl8片段加以制備。因此，本發(fā)明包括如下的抗體，其可識別由氨基酸序列CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)和 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID
NO 6)構(gòu)成的表位。更具體地，在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體可識別或結(jié)合包含氨基酸序列SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6的多肽。這里使用的術(shù)語“抗體”涵蓋天然存在的抗體以及非天然存在的抗體，包括例如單鏈抗體、嵌合、雙功能和人源化抗體，及其抗原結(jié)合片段(例如Fab'，F(xiàn)(ab' )2， Fab, Fv 和 rlgG)。另見 Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (PierceChemical Co., Rockford, IL)。另見例如 Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H.Freeman & Co., NewY0rk(1998)。這些非天然存在抗體可以用固相肽合成法構(gòu)建，可以重組產(chǎn)生或者可以通過例如篩選由可變重鏈和可變輕鏈構(gòu)成的重組庫加以獲得，如Huse et al.，Science 246 1275-81(1989)所述，本文引用其內(nèi)容作為參考。這些和其它制作例如嵌合、人源化、CDR-移植(grafted)、單鏈和雙功能抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(Winter and Harris, Immunol.Today 14 243-6(1993) ； Wardetal., Nature 341 544-6(1989)； Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988 ； Hilyard et al.， Protein Engineering A practical approach (IRL Press 1992)； Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995),本文弓 I用上述每一篇文獻的內(nèi)容作為參考。術(shù)語“抗體”同時包括多克隆和單克隆抗體。該術(shù)語還包括遺傳工程化的形式，例如嵌合抗體(例如人源化鼠抗體)和異源綴合物(heteroconjugate)抗體(例如雙特異性抗體)。該術(shù)語還指示重組單鏈Fv片段(scFv)。術(shù)語抗體還包括雙價或雙特異性分子、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)和四抗體(tetrabodies)。雙價和雙特異性分子在例如下列文獻中有公開Kostelny et al.(1992)J Immunol 148 1547，Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31 1579，Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA.90 6444，Graber et al.( 1994) JImmunol : 5368，Zhu et al. (1997) Protein Sci 6 : 781，Huet al. (1997) Cancer Res.56 3055，Adams et al. (1993) Cancer Res.53 4026，和 McCartney, et al. (1995) Protein Eng.8 : 301。典型地，抗體具有重鏈和輕鏈。每個重鏈和輕鏈包含一個恒定區(qū)和一個可變區(qū) (這些區(qū)域也稱作“結(jié)構(gòu)域”)。輕鏈和重鏈可變區(qū)含有4個“框架”區(qū)，這四個區(qū)之間被三個超變區(qū)隔斷，這些超變區(qū)也稱作“互補決定區(qū)”或“CDR”?？蚣軈^(qū)和CDR的范圍已被鑒定。不同輕鏈或重鏈框架區(qū)的序列在同一物種內(nèi)相對保守?？贵w的框架區(qū)，即構(gòu)成輕鏈和重鏈的各框架區(qū)的集合，幫助CDR在三維空間中定位和對齊。CDR主要負責對抗原的表位的結(jié)合。每條鏈的CDR典型地稱作CDRl，CDR2 和CDR3(從N端開始依次編號)，通常還用特定CDR所在的鏈來標識。因此，VH CDR3 位于其所在的抗體的重鏈的可變域中，而VL CDRl是來自其所在的抗體的輕鏈可變域的 CDRl。所謂“VH”是指抗體免疫球蛋白重鏈(包括Fv，scFv或Fab的重鏈)的可變區(qū)。所謂“VL”是指免疫球蛋白輕鏈(包括Fv，scFv, dsFv或Fab的輕鏈)的可變區(qū)，。詞組“單鏈Fv”或“scFv”是指如下的抗體，其中傳統(tǒng)雙鏈抗體的重鏈和輕鏈的可變域被連接形成一條鏈。典型地，在兩條鏈之間插入接頭肽，以便允許適當?shù)卣郫B和產(chǎn)生活性結(jié)合位點?！扒逗峡贵w”是這樣的免疫球蛋白分子，其中(a)恒定區(qū)或其一部分被改變、替換或交換，從而使抗原結(jié)合位點(可變區(qū))與不同的或改變的類型、效應器功能和/或物種的恒定區(qū)連接，或者與可為嵌合抗體提供新的性質(zhì)的完全不同的分子例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等連接；或(b)可變區(qū)或其一部分被改變、替換或交換，使得可變區(qū)具有不同的或改變的抗原特異性。“人源化抗體”是這樣的免疫球蛋白分子，其含有極少的來自非人類免疫球蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區(qū) (CDR)的殘基被來自非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠或家兔的具有期望特異性、親和性和能力的CDR的殘基替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非人類殘基替換。人源化抗體也可以包括在受體抗體和引入的CDR或框架序列中均不存在的殘基。一般地，人源化抗體包括基本上全部的至少一個，典型地兩個，可變域，其中全部或基本上全部的相應于非類人免疫球蛋白的CDR區(qū)以及全部或者基本上全部的框架(FR)區(qū)是人類免疫球蛋白的共有序列。人源化抗體優(yōu)選地還包括至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地是人免疫球蛋白(Jones etal.，Nature321 522-5(1986) ； Riechmann et al.，Nature 332 323-7(1988)；和 Presta，Curr.Op.Struct. Biol.2 593-6(1992))。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法實施(Jones et al., Nature 321 522-5(1986) ； Riechmann et al.，Nature332 323-7(1988) ； Verhoeyen etal., Science 239 1534-6(1988))，用嚙齒動物的一個或多個CDR序列替換人抗體的相應序列。因此，這些人源化抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567)，其中完整人類可變域的很少一部分被來自非人類物種的相應序列替換。術(shù)語“表位”、“抗原性”和“決定簇”是指抗原上抗體所結(jié)合的位點。表位可以由毗鄰的氨基酸形成，也可以由非毗鄰的氨基酸通過蛋白質(zhì)的三級折疊并列在一起而形成。由連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性劑時被保留，而由三級折疊形成的表位通常在用變性劑處理時喪失。表位典型地包括至少3個，更通常地，至少5個或 8-10個處于獨特的空間構(gòu)型的氨基酸。確定表位空間構(gòu)型的方法包括例如X-射線晶體學禾口 2 維核磁共振。見例如 Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, Glenn E.Morris, Ed(1996)。術(shù)語“非抗體結(jié)合蛋白”或“非抗體配體”或“抗原結(jié)合蛋白”可互換使用，用于表示使用免疫球蛋白骨架的抗體模擬物，包括adnectin、avimer,單鏈多肽結(jié)合分子和抗體樣結(jié)合肽模擬物，如下文中將更詳細討論的。已經(jīng)開發(fā)出了其它的以和抗體相似的方式靶定和結(jié)合靶標的化合物。這些“抗體模擬物”中的一些使用非免疫球蛋白骨架作為抗體可變區(qū)的替代性蛋白框架。例如，Ladner等(美國專利No.5,260,203)介紹了單多肽鏈結(jié)合分子，其具有與聚集的而在分子水平上分離的抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)相似的結(jié)合特異性。單鏈結(jié) 合分子同時包含抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的抗原結(jié)合位點，二者由肽接頭連接，并折疊成與包含兩個肽的抗體相似的結(jié)構(gòu)。單鏈結(jié)合分子與傳統(tǒng)的抗體相比具有多種優(yōu)勢，包括尺寸更小、穩(wěn)定性更高和更容易修飾。Ku 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 (14) 6552-6556(1995))公開了一種基于色素b562的抗體替代物。Ku等(1995)生成了一個文庫，其中細胞色素b562的兩個環(huán)被隨機化，并被選擇結(jié)合牛血清白蛋白。單獨的突變體被發(fā)現(xiàn)可以和抗BSA抗體相似地選擇性結(jié)合BSAoLipovsek等(美國專利Nos.6,818,418和7,115,396)公開了一種抗體模擬物，其
特征是纖連蛋白或纖連蛋白樣蛋白骨架和至少一個可變環(huán)。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物名為Adnectin，顯示許多與天然或工程化抗體相同的特性，包括對任何靶定配體的高親和性和特異性。任何用于發(fā)展新的或改良的結(jié)合蛋白質(zhì)的技術(shù)均可用于這些抗體模擬物。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)域IgG重鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)相似。因此，這些模擬物顯示的抗原結(jié)合性質(zhì)在本質(zhì)和親和力方面與天然抗體相似。而且，這些基于纖連蛋白的抗體模擬物與抗體或抗體片段相比顯示某些優(yōu)點。例如，這些抗體模擬物的天然折疊穩(wěn)定性不依賴于二硫鍵，因此它們在通常會破壞抗體的條件下保持穩(wěn)定。此夕卜，因為這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結(jié)構(gòu)域IgG重鏈相似，所以環(huán)隨機化和改組 (shuffling)的過程可以在體外進行，這與抗體的體內(nèi)親和力成熟過程相似。Beste 等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 (5) 1898-1903(1999))公開了一種基于脂籠蛋白骨架的抗體模擬物(Anticalin )。脂籠蛋白由一個β _折疊桶構(gòu)成，蛋白質(zhì)末端具有四個超變環(huán)。BeSte(1999)對環(huán)進行隨機突變并選擇其對例如熒光素的結(jié)合。這些變異體對熒光素顯示特異的結(jié)合，一個變異體與熒光素的結(jié)合顯示與抗-熒光素抗體相似。進一步的分析顯示，所有的隨機位置均可變，表明Anticalin 適合于用作抗體的替代物。Anticalins 是小的單鏈肽，典型地為160-180個殘基，與抗體相比具有多種優(yōu)
勢，包括生產(chǎn)成本更低、保存穩(wěn)定性更高和免疫反應更小。Hamilton等(美國專利No.5,770,380)公開了一種合成抗體模擬物，其使用剛性的杯芳烴(calixarene)非肽有機骨架，與用作結(jié)合位點的多個可變肽環(huán)連接。所有肽環(huán) 相對于彼此均從杯芳烴的同一幾何側(cè)面伸出。由于這種幾何構(gòu)型，這有的環(huán)均可用于結(jié) 合，從而增加了與配體的結(jié)合親和性。然而，與其它抗體模擬物相比，基于杯芳烴的抗體模擬物并不完全由肽構(gòu)成，因此它更不容易被蛋白酶攻擊。骨架也不是完全由肽、 DNA或RNA構(gòu)成，意味著這種抗體模擬物在極端環(huán)境條件下相對穩(wěn)定，并具有長的生命期。而且，因為基于杯芳烴的抗體模擬物相對小，因此產(chǎn)生免疫響應的可能性降低。Murali 等(Cell.Mol.Biol.49 (2) 209-216(2003))討論了一種用于將抗體減小成更小的肽模擬物(peptidomimetics)的方法，他們稱作“抗體樣結(jié)合肽模擬物”(ABiP)，其也可以作為抗體的替代物。Silverman 等(Nat.Biotechnol. (2005)，23: 1556-1561)討論了由具有多個結(jié)構(gòu)域
的單鏈多肽構(gòu)成的融合蛋白質(zhì)，稱作"avimers"。avimer是通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人類細胞外受體結(jié)構(gòu)域發(fā)展而來的一類結(jié)合蛋白，其對靶分子的親和性和特異性與抗體在一定程度上相似。所得的多結(jié)構(gòu)域蛋白可以包括多個獨立的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與單表位結(jié)合蛋白相比，可表現(xiàn)出提高的親和性(在某些情況下達到亞納摩爾)和特異性。其它關(guān)于構(gòu)建和使用avimer的方法的細節(jié)在例如如下美國專利申請公開中有公開 Nos.20040175756, 20050048512， 20050053973， 20050089932 和 20050221384。
出了非免疫球蛋白蛋白框架之外，還已經(jīng)用如下化合物模擬了抗體性質(zhì)，包括 RNA分子和非天然寡聚體(例如蛋白酶抑制劑、苯二氮雜卓、嘌呤衍生物和β-轉(zhuǎn)角模擬物)，所有這些均適用于本發(fā)明。雙鏈分子本發(fā)明還涉及令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即抑制C2orfl8的表達可有效抑制癌細胞(包括胰腺癌所涉及的癌細胞)的細胞生長。本申請書中描述的本發(fā)明即部分地基于本發(fā)現(xiàn)。如這里所使用的，術(shù)語“雙鏈分子”是指可抑制靶基因表達的核酸分子，包括例如短干擾RNA(siRNA ；例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發(fā)夾RNA(shRNA))和短干擾DNA/RNA (siD/R-NA ；例如雙鏈DNA和RNA嵌合體(dsD/R-NA)或小發(fā)夾DNA禾口 RNA嵌合體(shD/R-NA))。如這里所使用的，術(shù)語“dsRNA”是指兩個彼此具有互補序列的RNA分子的構(gòu)建體，它們通過互補序列退火形成雙鏈RNA分子。雙鏈的核苷酸序列可以不僅包括從靶基因序列蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義” RNA，還可以包括具有從靶基因非編碼區(qū)選出的核苷酸序列的RNA分子。如這里所使用的，術(shù)語“shRNA”是指具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的siRNA，其具有彼此互補第一和第二區(qū)域，即有義鏈和反義鏈。第一和第二區(qū)互補程度和取向足以使得兩個區(qū) 域之間發(fā)生堿基配對，第一和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，所述環(huán)是由于環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺乏堿基配對而形成的。ShRNA的環(huán)區(qū)是有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，可以稱作“間插單鏈”。如這里所使用的，術(shù)語“siD/R-NA”是指由RNA和DNA 二者構(gòu)成的雙鏈多核苷酸分子，包括RNA和DNA的雜交體和嵌合體，可阻止靶mRNA的翻譯。這里，雜交體是指如下的分子，其中由DNA構(gòu)成的多核苷酸和由RNA構(gòu)成的多核苷酸彼此雜交形成雙鏈分子；而嵌合體是指構(gòu)成該雙鏈分子的一條或兩條鏈可以包含RNA和DNA。使用將siD/R-NA引入到細胞內(nèi)的標準技術(shù)。siD/R-NA包括有義核酸序列(也稱作“有義鏈”)、反義核酸序列(也稱作“反義鏈”)或兩者。siD/R-NA可以被構(gòu)建成使得單個轉(zhuǎn)錄本同時具有來自靶基因有義和互補的反義核酸序列，例如發(fā)夾。siD/R-NA可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。如這里所使用的，術(shù)語“dsD/R-NA”是指彼此具有互補序列的兩個分子的構(gòu) 建體，它們通過互補序列退火在一起形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸序列可以不僅包括從靶基因序列的蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義”核苷酸序列，還包括具有從靶基因非編碼區(qū)域選出的核苷酸序列的多核苷酸。構(gòu)成dsD/R-NA的兩個分子中的一個或兩個由RNA和DNA 二者構(gòu)成(嵌合分子)，或者，一個分子由RNA構(gòu)成，另一個由DNA構(gòu)成(雜合雙鏈)。如這里所使用的，術(shù)語“shD/R-NA”是指具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的siD/R-NA，其具有彼此互補的第一區(qū)和第二區(qū)，即有義鏈和反義鏈。第一和第二區(qū)互補和定位的程度充分，從而在區(qū)域之間發(fā)生堿基配對，第一和第二區(qū)通過環(huán)區(qū)連接，環(huán)得自于于環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺乏堿基配對。shD/R-NA的環(huán)區(qū)是有義鏈和反義鏈之間的單鏈區(qū)，可以稱作“間插單鏈”。本發(fā)明的雙鏈分子可以含有一個或多個經(jīng)過修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯連接。本領(lǐng)域眾所周知的化學修飾均能夠增加雙鏈分子的穩(wěn)定性、可用性和/或細胞攝取。技術(shù)人員知道可引入到本發(fā)明分子的其他類型的化學修飾(W003/070744 ； W02005/045037)。在一個實施方案中，修飾可用于提供更高的對降解的耐受力或更高的吸收。這些修飾的實例包括硫代磷酸酯連接、2’ -O-甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分子的有義鏈上)、2’ -脫氧-氟核糖核苷酸、2’ _脫氧核糖核苷酸、“通用堿基”(universal base)核苷酸、5' -C-甲基核苷酸和倒置脫氧堿基摻入 (US20060122137)。在另一個實施方案中，可以使用修飾提高雙鏈分子的穩(wěn)定性或增加靶定效率。修飾包括雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學交聯(lián)、雙鏈分子3’或5’端的化學修飾、糖修飾、核堿基修飾和/或骨架修飾、2-氟修飾的核糖核苷酸和2’ -脫氧核糖核苷酸 (W02004/029212)。在另一個實施方案中，可以使用修飾來增加或降低對靶mRNA和/ 或互補雙鏈分子鏈中互補核苷酸的親和性(W02005/044976)。例如，未修飾的嘧啶核苷酸可以被2-硫、5-炔基、5-炔基或5-丙炔基嘧啶代替。此外，未修飾的嘌呤可以被 7-脫氮(deza)、7-烷基或7-烯基嘌呤代替。在另一個實施方案中，當雙鏈分子是具有 3’ _突出端(overhang)的雙鏈分子時，3’ -端突出端核苷酸可以被脫氧核糖核苷酸代替 (Elbashir SM et al.，Genes Dev 2001 Jan 15，15 (2) 188-200)。關(guān)于進一步的細節(jié)，可見出版文獻例如US20060234970。本發(fā)明并不僅限于這些實施例，任何已知的化學修飾均可用于本發(fā)明的雙鏈分子，只要所得的分子保留抑制靶基因表達的能力即可。而且，本發(fā)明的雙鏈分子可以同時包括DNA和RNA，例如dsD/R_NA或shD/ R-NA。具體地，由DNA鏈和RNA鏈形成的雜合多核苷酸或DNA-RNA嵌合體多核苷酸顯示更高的穩(wěn)定性?？梢孕纬蒁NA和RNA的混合，即由DNA鏈(多核苷酸)和RNA 鏈(多核苷酸)構(gòu)成的雜合型雙鏈分子、在任何一條或兩條單鏈(多核苷酸)上同時具有 DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子、或類似物，以提高雙鏈分子的穩(wěn)定性。由DNA鏈和 RNA鏈形成的雜合體可以是有義鏈為DNA而反義鏈為RNA的雜合體，或者相反，只要它在引入到表達靶基因的細胞內(nèi)時具有抑制靶基因表達的活性即可。優(yōu)選地，有義鏈多核苷酸是DNA，反義鏈多核苷酸是RNA。此外，嵌合型雙鏈分子也可以是兩條有義和反義鏈均由DNA和RNA構(gòu)成，或者有義鏈和反義鏈的任何一個由DNA和RNA構(gòu)成，只要它在引入到表達靶基因的細胞內(nèi)時具有抑制靶基因表達的活性即可。為了提高雙鏈分子的穩(wěn)定性，分子優(yōu)選地含有盡可能多的DNA，而為了誘導靶基因表達的抑制，分子需要在一定范圍內(nèi)是RNA，以誘導充分的表達抑制。作為嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實例，雙鏈分子的上游部分區(qū)域(即有義或反義鏈內(nèi)位于靶序列或其互補序列側(cè)翼的區(qū)域)是RNA。優(yōu)選地，上游部分區(qū)域是指有義鏈的5’側(cè)(5’端)和反義鏈的3’側(cè)(3’端)。也就是說，在優(yōu)選實施方案中，反義鏈3’端側(cè)翼的區(qū)域，或者有義鏈5’端側(cè)翼的區(qū)域和反義鏈3，端側(cè)翼的區(qū)域均由RNA構(gòu)成。例如，本發(fā)明嵌合型或雜合型雙鏈分子包括如下組合。5, -[—DNA—]-3,3' -(RNA)-[DNA]-5'反義鏈，有義鏈5'- (RNA)-[DNA]-3'3' -(RNA)-[DNA]-5'反義鏈，禾口有義鏈5'- (RNA)-[DNA]-3'
3' -(---RNA---)-5'反義鏈.上游部分區(qū)域優(yōu)選地是由9-13個核苷酸構(gòu)成的域，從雙鏈分子有義鏈或反義鏈內(nèi)的靶序列或與之互補序列的末端開始計數(shù)。而且，這些嵌合型雙鏈分子的優(yōu)選實例包括這樣的雙鏈分子具有長度為19-21個核苷酸的有義鏈，其中多核苷酸的至少上游半?yún)^(qū)(有義鏈的5’側(cè)區(qū)和反義鏈的3’側(cè)區(qū))是RNA，另一個半?yún)^(qū)是DNA。在這種嵌合型雙鏈分子中，當整個反義鏈都是RNA時，抑制靶基因表達的效果會大大提高 (US20050004064)。在本發(fā)明中，雙鏈分子可以形成發(fā)夾，例如短發(fā)夾RNA(ShRNA)和由DNA和 RNA構(gòu)成的短發(fā)夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R_NA是一段RNA序列或RNA和DNA 的混合物，形成緊固的發(fā)夾轉(zhuǎn)角，可通過RNA干擾沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA 包括位于單條鏈上的有義靶序列和反義靶序列，其中二者被環(huán)序列分開。一般地，發(fā)夾結(jié)構(gòu)被細胞機構(gòu)切割成dsRNA或dsD/R-NA，dsRNA或dsD/R-NA隨后與RNA誘導的沉默復合體(RISC)結(jié)合。該復合體結(jié)合并切割與dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的 mRNAo針對C2orfl8基因的雙鏈分子(例如"C2orfl8 siRNA")可用于降低該基因的表達水平。這里，術(shù)語“siRNA”是指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。在本發(fā)明的內(nèi)容中，雙鏈分子由針對C2orfl8基因的有義核酸序列和反義核酸序列構(gòu)成。該雙鏈分子被構(gòu)建成同時包含靶序列的有義和互補反義序列。雙鏈分子可以是dsRNA，shRNA, dsD/RNA 或 shD/RNA。針對C2orfl8基因的雙鏈分子與mRNA的靶區(qū)域雜交，即與通常為單鏈mRNA 轉(zhuǎn)錄本在相應于靶序列的區(qū)域結(jié)合，藉此干擾mRNA的翻譯，最終降低或抑制由基因編碼的多肽的產(chǎn)生(表達)。因此，本發(fā)明的雙鏈分子可以按照其在嚴格條件下與C2orfl8 基因mRNA特異雜交的能力加以定義。在本發(fā)明的內(nèi)容中，雙鏈分子的長度優(yōu)選地小于500個，200個， 100個，50個，或25個核苷酸。更優(yōu)選地，雙鏈分子的長度為19-25個核苷酸。C2orfl8雙鏈分子的靶核酸序列的實例包括相應于C2orfl8靶序列的寡核苷酸序列，例如 5 ‘ -GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3 ‘ (SEQ ID NO 7)或 5' -GCACGACAGTCAGCACAAG-3‘ (SEQ ID NO 8)。因此，舉例而言，本發(fā)明提供了具有由SEQ ID NO 7或8構(gòu)成的寡核苷酸序列的雙鏈分子。在雙鏈分子的RNA區(qū) 域，靶序列中的核苷酸"t"應當用"U"代替。為了提高雙鏈分子的抑制活性，可以在反義鏈的3’端添加核苷酸〃 u〃。添加的〃 u〃的數(shù)目至少為2個，一般為2-10個，優(yōu)選地為2-5個。所添加的”U"在雙鏈分子反義鏈的3’端形成單鏈。由任意核苷酸序列構(gòu)成的環(huán)序列可以位于有義和反義序列之間，以便形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明還提供了具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'的雙鏈分子，其中[A] 是這樣的寡核苷酸序列，其對應于與C2orfl8基因的mRNA或cDNA的靶序列特異性雜交的序列。在優(yōu)選實施方案中，[A]是相應于C2orfl8基因的靶序列的寡核苷酸序列；[B] 是由大約3個到大約23個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，[A']是由[A]的互補序列構(gòu)成的寡核苷酸序列。[A]區(qū)與[A’ ]區(qū)雜交，然后形成由[B]區(qū)構(gòu)成的環(huán)。環(huán)序列的長度優(yōu)選地是3-23個核苷酸。環(huán)序列可以例如從如下序列構(gòu)成的組中選出(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb 506 .html) CCC，CCACC，或 CCACACC JacqueJMetal., Nature 2002， 418 435-8.UUCG LeeNSetal.，Nature Biotechnology 2002，20: 500-5 ； Fruscoloni P etal.，Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4) 1639-44。UUCAAGAGA Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology2003, 4 457-67。' UUCAAGAGA(DNA 中的〃 ttcaagaga")‘是特別合適的環(huán)序列。而且，由23個核苷酸構(gòu)成的環(huán)序列也提供活性siRNA(Jacque J-M et al., Nature 2002， 418 435-8)。適用于本發(fā)明內(nèi)容的發(fā)夾雙鏈分子的實例包括5 ‘ -GGAGCACAGCUUCCAGCAU-[B]-AUGCUGGAAGCUGUGCUCC
-3'(用于SEQ ID NO 7的靶序列)；和5 ‘ -GCACGACAGUCAGCACAAG-[B]-CUUGUGCUGACUGUCGUGC-3 ‘(
用于SEQ ID NO: 8的靶序列)。具體地，下面的雙鏈分子[lh[13]包含在本發(fā)明中[1]包括有義鏈和反義鏈的雙鏈分子，其中有義鏈包含相應于由SEQ ID NO: 7或8構(gòu)成的靶序列的核苷酸序列，并且其中反義鏈包括與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述雙鏈分子在被弓丨入到表達C2orfl8基因的細胞內(nèi)時可抑制該基因的表達。[2][1]的雙鏈分子，其中所述靶序列包括來自由SEQ ID NO: 11構(gòu)成的核苷酸序列的大約19-大約25個連續(xù)的核苷酸。[3][2]的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是包括通過單鏈核苷酸序列連接起來的有義鏈和反義鏈的單核苷酸轉(zhuǎn)錄本。[4][3]的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是包含相應于SEQID NO: 7或8的序列的寡核苷酸的有義鏈，[B]是由大約3個-大約23個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，[A']是包含相應于[A]序列的互補序列的寡核苷酸的反義鏈。[5][3]的雙鏈分子，其具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是相應于由作為靶序列的由SEQIDNO : 7或8構(gòu)成的序列的核糖核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，[A']是由[A]的互補序列構(gòu)成的核糖核苷酸序列。[6][1]_[5]的雙鏈分子，其包含RNA。[7][1]-[5]的雙鏈分子，其包含DNA和RNA。[8][7]的雙鏈分子，其是DNA多核苷酸和RNA多核苷酸的雜合體。[9][8]的雙鏈分子，其中有義鏈和反義鏈分別由DNA和RNA構(gòu)成。[10][7]的雙鏈分子，其是DNA和RNA的嵌合體。[11][10]的雙鏈分子，其中有義鏈中靶序列的5’端區(qū)域，和/或反義鏈中靶序列的互補序列的3’端區(qū)域由RNA構(gòu)成。[12][11]的雙鏈分子，其中RNA區(qū)域由9_13個核苷酸構(gòu)成。[13][1]_[5]的雙鏈分子，其含有3’突出端。本發(fā)明的雙鏈分子在下文中將更加詳細地進行描述。合適的雙鏈分子的寡核苷酸序列可以用從Ambion網(wǎng)址可得的計算機設計程序加以設計(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。該計算機程序根據(jù)如
下方案選擇用于雙鏈分子合成的核苷酸序列。靶位點選擇1.從目標轉(zhuǎn)錄本的AUG起始密碼子開始，向下游掃描AA雙核苷酸序列。記錄每一個AA的出現(xiàn)和其3’毗鄰的19個核苷酸作為潛在靶位點。Tuschl等Genes Cev 1999，13(24) 3191-7不推薦針對5’和3’非翻譯區(qū)(UTRs)和靠近起始密碼子的區(qū) 域(75個核苷酸內(nèi))設計靶序列，因為這里可能富含調(diào)節(jié)性蛋白的結(jié)合位點。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復合體可能干擾內(nèi)切核酸酶復合體的結(jié)合。2.比較潛在靶位點與人類基因組數(shù)據(jù)庫，并排除任何與其它編碼序列具有顯著同源性的靶序列。同源性搜索可以用BLSAST實施(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997，25: 3389-402 ； J Mol Biol 1990，215 403-10.)，其可以在NCBI服務器上找到 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列進行合成。在Ambion，優(yōu)選地可以沿著基因的長度選擇多個靶序列以進行評估?？梢允褂脤㈦p鏈分子引入到細胞內(nèi)的標準技術(shù)。例如，可以將C2orfl8的雙鏈分子以能夠與mRNA轉(zhuǎn)錄本結(jié)合的形式直接引入到細胞內(nèi)。在這些實施方案中，本發(fā)明的雙鏈分子通常如上文所述的反義分子那樣被修飾。其它的修飾也是可能的，例如已顯示膽固醇偶聯(lián)的雙鏈分子可提高藥理性質(zhì)(Songet al.，Nature Med 2003，9 347-51)。可選擇地，編碼雙鏈分子的DNA可以被攜帶在載體(下文也稱作'SiRNA載體')內(nèi)。這些載體可以通過將靶C2orfl8基因序列克隆到具有操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如來自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單位或人類Hl RNA啟動子)的表達載體內(nèi)來制備，調(diào)節(jié)序列以如下的方式位于序列的側(cè)翼，其允許兩條鏈表達(通過DNA 分子的轉(zhuǎn)錄)(Lee NSetal.，NatureBiotechnology 2002, 20:500-5)。例如，與 C2orfl8 基因mRNA反義的RNA分子被第一啟動子(例如被克隆的DNA的3’ 一側(cè)的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄，而C2orfl8基因mRNA有義鏈的RNA分子由第二啟動子(例如被克隆的DNA 的5’ 一側(cè)的啟動子序列)轉(zhuǎn)錄。有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交而產(chǎn)生雙鏈分子構(gòu)建體，用于沉默C2orfl8基因的表達?；蛘撸衫脙蓚€構(gòu)建體產(chǎn)生單鏈構(gòu)建體的有義和反義鏈。在這種情況下，具有二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體作為單個轉(zhuǎn)錄本被產(chǎn)生，該轉(zhuǎn) 錄本同時包括靶基因的有義和互補反義序列。具體地，本發(fā)明提供了載體，其具有含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個或兩個，其中所述有義鏈核酸包括SEQ ID NOs: 7或8的核苷酸序列，并且其中反義鏈包括與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄本彼此雜交，形成所述雙鏈分子，并且其中所述載體在引入到表達C2orfl8基因的細胞內(nèi)時可抑制所述基因的表達。或者，本發(fā)明提供了載體，其具有含有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個，其中所述有義鏈核酸包括SEQ ID NOs: 7或8的核苷酸序列，并且其中反義鏈核酸包括與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄本彼此雜交，形成雙鏈分子，并且其中所述載體在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內(nèi)時可抑制所述基因的表達。優(yōu)選地，多核苷酸是長度為大約19-25個核苷酸的寡核苷酸(例如來自SEQID NO: 11的核苷酸序列的連續(xù)核苷酸)。更優(yōu)選地，多核苷酸的組合包括具有通過單鏈核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈的單核苷酸轉(zhuǎn)錄本。更優(yōu)選地，多核苷酸的組合具有通式5' -[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是具有SEQ IDNO 7或8的核苷酸序列；[B]為由大約3-大約23個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列；[A']包括與[A]互補的核苷酸序列。
為了將雙鏈分子載體引入到細胞內(nèi)，可以使用轉(zhuǎn)染增強劑。FuGENE6(R0Che diagnostics), Lipofectamine 2000 (Invitrogen) , Oligofectamine (Invitrogen), 禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可用作轉(zhuǎn)染增強劑。檢測或診斷胰腺癌的方法在胰腺癌中被活化的數(shù)十個基因中，本發(fā)明著眼于一個新基因 C2orfl8 (GenBank 登錄號No.NM_017877)，其編碼一個多次跨膜蛋白質(zhì)。在本文中它可以和"ANT2BP" (ANT2-結(jié)合蛋白)和"PAMP“(胰腺癌線粒體蛋白)互換使用。 RT-PCR、northern印跡、以及使用特異針對C2orfl8的多克隆抗體的免疫組織化學分析證實，它在胰腺癌細胞中過表達，在正常成人生命器官(心臟、肺、腎臟、肝臟和腦)中不表達或非常有限地表達。因此，本發(fā)明的提供一種檢測、診斷和/或確定受試者體內(nèi)癌癥(例如胰腺癌) 的存在或發(fā)生傾向的方法，該方法確定受試者來源生物樣品(例如組織樣品)中C2orfl8 的表達水平。C2orfl8的表達水平與正常對照水平相比的改變，例如增加，表明受試者罹患或者具有發(fā)生癌癥(例如胰腺癌)的危險。本發(fā)明涉及確定(例如測量)C2orfl8基因的表達水平。使用由GenBank 數(shù)據(jù) 庫中已知序列記錄所提供的信息，可以用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)檢測和測量C2orfl8基因。例如，序列數(shù)據(jù)庫記錄內(nèi)相應于C2orfl8基因的序列可用于構(gòu)建探針，用來檢測C2orfl8基因的相應RNA序列，例如在Northern印跡雜交分析中。探針典型地包含C2orfl8序列的至少10個、至少20個、至少50個、至少100個或者至少200個核苷酸。作為另一個實例，可使用序列構(gòu)建引物來特異擴增C2orfl8核酸，例如在基于擴增的檢測方法(如基于反轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈式反應)中。作為另一個實例，針對C2orfl8的抗體，例如抗_C20rfl8多克隆抗體或抗-C2orfl8單克隆抗體可用來進行免疫測定，例如免疫組織化學分析、western印跡分析或ELISA等。而且，C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過基于擴增的檢測方法(例如RT-PCR)用引物進行定量。這些引物還可以根據(jù)基因的可得序列信息加以制備。例如，在實施例中使用的引物(SEQ ID NOs: 3和4)可用于通過RT-PCR進行檢測，但本發(fā)明并不僅限于此?；蛘?，可以檢測翻譯產(chǎn)物用于本發(fā)明的診斷。例如，可以確定C2orfl8蛋白的量。用于確定作為翻譯產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的量的方法包括使用特異識別該蛋白質(zhì)的抗體或抗體模擬物的免疫測定方法?？贵w可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體，scFv，F(xiàn)ab, F(ab' )2，F(xiàn)v等)均可用于檢測，只要該片段保留與 C2orfl8蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型抗體用于檢測蛋白的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且本發(fā)明可以采用任何方法制備這些抗體和其等價物。作為另一種基于其翻譯產(chǎn)物檢測C2orfl8基因表達水平的方法，可以用針對C2orfl8蛋白的抗體或抗體模擬物通過免疫組織化學分析觀察染色的強度。也就是，觀察到強染色表明蛋白的存在量增加，同時C2orfl8基因的表達水平高。而且，翻譯產(chǎn)物可以根據(jù)其生物學活性加以檢測。具體地說，在本文中， C2orfl8蛋白被證實參與癌細胞的增殖。因此，C2orfl8蛋白的細胞增殖活性可用作生物樣品中存在C2orfl8蛋白的指征。然后，將C2orfl8基因在測試細胞群體(例如來自受試者的組織樣品)中的表達水平與參考細胞群體中該基因的表達水平進行比較。參考細胞群體包括一個或多個所比較的參數(shù)已知的細胞，例如胰腺癌細胞，正常的胰腺細胞或正常的胰腺導管上皮細胞。測試細胞群體與參考細胞群體相比的基因表達水平是否指示癌癥(例如胰腺癌) 或者其傾向，取決于參考細胞群體的組成。例如，如果參考細胞群體由正常細胞(非癌癥)構(gòu)成，則測試細胞群體和參考細胞群體的基因表達水平的相似性表示測試細胞群體不是癌癥或者沒有其危險。相反，如果參考細胞群體是由癌細胞構(gòu)成的，則測試細胞群體與參考細胞群體之間基因表達的相似性表示測試細胞群體含有癌細胞。如果C2orfl8基因在測試細胞群體中的表達水平與參考細胞群體中C2orfl8基因的表達水平相比偏離超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍或更多倍，則C2orfl8基因在測試細胞群體中的表達水平被認為“改變”或“不同”。測試細胞群體和參考細胞群體之間的差異基因表達可以相對于對照核酸(例如管家基因)加以標準化。例如，對照核酸是已知不會因細胞的癌癥或非癌癥狀態(tài)而改變的核酸?？衫脤φ蘸怂岬谋磉_水平來將測試和對照細胞群體內(nèi)的信號水平標準化。對照基因的實例包括，但不僅限于，例如β-肌動蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和核糖體蛋白Ρ1。測試細胞群體可以和多個參考細胞群體進行比較。多個參考細胞群體中的各個群體的已知參數(shù)可以是不同的。因此，測試細胞群體可以和已知含有例如胰腺癌細胞的第一參考細胞群體比較，以及和已知為正常細胞(例如不含胰腺癌細胞)的第二參考細胞群體比較。測試細胞群體可以包括來自已知含有或者疑似含有癌細胞的受試者的組織或細胞樣品。測試細胞群體可以從組織活檢獲得，例如身體組織或體液，例如生物液(例如血液、痰、唾液)。例如，測試細胞群體可以是從疑似患有癌癥(例如胰腺癌)的受試者獲得的胰腺組織純化的。優(yōu)選地，測試細胞群體包括上皮細胞。上皮細胞優(yōu)選地來自已知是或疑似是癌(例如胰腺癌)的組織。參考細胞群體中的細胞優(yōu)選地來自和測試細胞群體相似的組織類型。任選地，參考細胞群體是細胞系，例如胰腺癌細胞系或PDAC細胞系(即陽性對照)或正常非癌細胞系(即陰性對照)?；蛘?，對照細胞群體可以來自被測試的參數(shù)或條件已知的細胞的分子信息數(shù)據(jù)庫。被診斷的受試者優(yōu)選地是哺乳動物。哺乳動物實例包括，但不僅限于，人類、非人靈長動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明，可以提供用于檢查受試者狀況的中間結(jié)果。這些中間結(jié)果可以和額外的信息組合，以幫助醫(yī)生、護士或其它從業(yè)人員確定受試者是否罹患癌癥、例如胰腺癌。
或者，本發(fā)明還可用于檢測受試者來源組織中的癌性細胞，為醫(yī)生提供有用的信息，以確定受試者是否罹患癌癥，例如胰腺癌。因此，本發(fā)明涉及確定(例如測量) 受試者來源樣品(例如胰腺組織樣品)中C2orfl8的水平。在本發(fā)明中，用于診斷癌癥 (例如胰腺癌)的方法也包括用于測試或檢測癌癥(例如胰腺癌)的方法?；蛘?，在本發(fā) 明中，診斷癌癥還代表顯示受試者中癌癥的疑似、危險或可能性。監(jiān)視和評估癌癥治療的效力C2orfl8基因在正常和癌性細胞之間差異表達，因此允許對癌癥治療的過程進行監(jiān)視，其中上述用于診斷癌癥的方法可適用于監(jiān)視和評估治療對癌癥(例如胰腺癌)的效力。具體地，治療對癌癥的效力可以通過確定來自接受治療的受試者的細胞中C2orfl8基因的表達水平進行評估。如果期望，在不同的時間點，治療前、治療中和/或治療后，從受試者獲得測試細胞群體。C2orfl8基因的表達水平可以例如按照上述的方法加以確定。在本發(fā)明的內(nèi)容中，優(yōu)選地使用沒有暴露于目標治療的細胞內(nèi)的C2orfl8基因表達作為對照水平，與檢測到的表達水平相比較。如果C2orfl8基因的表達水平與從正常細胞或含有非癌細胞(例如非胰腺癌細胞)的細胞群體確定的對照水平進行比較，則表達水平相似表明目標治療是有效的，表達水平不同表明治療的臨床結(jié)果或預后不利。另一方面，如果比較是針對從癌細胞或含有癌細胞(例如胰腺癌細胞)的細胞群體確定的對照水平，則表達水平不同表明是有效的治療，而表達水平相似表明臨床結(jié)果或預后不利。而且，可以根據(jù)本發(fā)明的方法比較C2orfl8基因在治療之前和之后的表達水平，以評估治療的效力。具體地，將治療后來自受試者的生物樣品中檢測到的表達水平(即治療后水平)與來自同一受試者的在治療開始前獲得的生物樣品中檢測到的表達水平(即治療前水平)進行比較。治療后水平與治療前水平相比降低，表明目標治療是有效的，而治療后水平與治療前水平相比增加或相似則表明臨床結(jié)果或預后不利。如這里所使用的，術(shù)語“有效”是指治療導致受試者體內(nèi)被病理上調(diào)基因的表達降低，被病理下調(diào)基因的表達增加或者癌的大小、普遍性或轉(zhuǎn)移潛力降低。當預防性地應用感興趣的治療時，“有效”是指治療可延緩或防止腫瘤的形成，或者延緩、防止或減輕該疾病的至少一種臨床癥狀。受試者體內(nèi)腫瘤狀況的評估可以用標準臨床規(guī)程實施。此外，治療的有效性可以聯(lián)合任何已知的用于診斷癌癥的方法加以確定。癌癥可以通過例如鑒定癥狀性異常，例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲不振、惡心、嘔吐和全身性不適、虛弱和黃疸，來加以診斷。用于檢測、診斷或確定胰腺癌的試劑盒和試劑劑本發(fā)明提供了用于檢測、診斷或確定癌癥的試劑盒。優(yōu)選地，所述癌癥是胰腺癌，更優(yōu)選地是PDAC。具體地，試劑盒包括至少一種用于檢測受試者來源生物樣品中 C2orfl8的表達水平的試劑，該試劑可以從下組中選出(a)用于檢測C2orfl8 mRNA的試劑；(b)用于檢測C2orfl8蛋白的試劑；和(c)用于檢測C2orfl8生物活性的試劑。用于檢測C2orfl8 mRNA的合適試劑包括特異結(jié)合或鑒定C2orfl8mRNA的核酸，例如具有C20rfl8mRNA的一部分的互補序列的寡核苷酸。這些類型的寡核苷酸的實例是對C2orfl8 mRNA特異的引物和探針。這些類型的寡核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法加以制備。如果需要，用于檢測C2orfl8 mRNA的試劑可以固定在固體基質(zhì)上。另一方面，用于檢測C2orfl8蛋白的合適試劑包括針對C2orfl8蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或修飾(例如嵌合抗體，scFv， Fab, F(ab' )2，F(xiàn)v等)均可用作所述試劑，只要該片段保留與C2orfl8蛋白的結(jié)合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白質(zhì)的抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，本發(fā)明可以采用任何方法制備這些抗體或其等價物。而且，可以通過直接連接或間接標記技術(shù)用信號發(fā)生分子對抗體進行標記。用于標記抗體和檢測抗體與其靶標的結(jié)合的標記和方法是本領(lǐng)域眾所周知的，本發(fā)明可以采用任何標記和方法。而且，生物活性可以通過例如測量由于在生物樣品內(nèi)表達的C2orfl8蛋白所導致的促細胞增殖活性(cell proliferating activity)加以確定。例如，將細胞在受試者來源生物
樣品的存在下培養(yǎng)，然后通過檢測增殖速度或者通過測量細胞周期或集落形成能力，可以確定生物樣品的促細胞增殖活性。而且，試劑盒可以包含用于結(jié)合針對C2orfl8基因的探針或針對C2orfl8蛋白的抗體的固體基質(zhì)和試劑，用于培養(yǎng)細胞的介質(zhì)和容器，陽性和陰性對照試劑，和用于檢測針對C2orfl8蛋白的抗體的第二抗體。例如，從具有良好預后和不良預后的受試者獲得的組織樣品可以用作有用的對照試劑。本發(fā)明的試劑盒可以進一步包括其它在商業(yè) 和用戶角度看理想的材料，包括緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、針筒和帶有使用說明的藥品說明書(package insert)(例如文字、磁帶、CD-ROM等)。這些試劑等可以保存在具有標簽的容器內(nèi)。合適的容器包括瓶子、小瓶和試管。容器可以用多種材料制成，例如玻璃或塑料。作為本發(fā)明的一個實施方案，當試劑是針對C2orfl8mRNA的探針時，試劑可以固定在固體基質(zhì)(例如多孔條帶(porous strip))上，形成至少一個檢測位點。多孔條帶的測量或檢測區(qū)可包括多個位點，每一個位點含有一種核酸(探針)。測試條帶還可以含有陰性和/或陽性對照的位點?；蛘撸瑢φ瘴稽c可以位于與測試條帶不同的條帶上。任選地，不同檢測位點可以含有不同量的固定核酸，即，在第一檢測位點有較高的量，在隨后的位點有較少的量。在添加測試樣品時，顯示可檢測信號的位點的數(shù)目可提供樣品中存在的C2orfl8 mRNA量的定量指示。檢測位點可以配置成任何適合的可檢測的形狀，典型地呈橫跨測試條帶的橫條(bar)或點(dot)狀。或者，本發(fā)明提供了上述用于檢測、診斷或確定胰腺癌存在或發(fā)生傾向的試劑。篩選方法通過siRNA敲低過表達C2orfl8的細胞內(nèi)的內(nèi)源C2orfl8可顯著抑制細胞生長，提示C2orfl8在保持細胞活力中的至關(guān)重要作用。而且，進行免疫細胞化學分析和細胞分級分離隨后進行Western印跡分析的結(jié)果提示C2orfl8定位于線粒體，表明C2orfl8可能參與細胞凋亡或細胞內(nèi)的能量內(nèi)穩(wěn)平衡。這些關(guān)于C2orfl8功能和亞細胞定位的發(fā)現(xiàn) 提示，C2orfl8可能是用于胰腺癌治療的有前途的分子靶點。
因此，本發(fā)明提供了篩選用于抑制過表達C2orfl8的細胞的增殖的候選劑和化合物的方法。細胞可以是癌細胞，具體地是胰腺癌細胞，更具體地是PDAC細胞。使用C2orfl8基因、由該基因編碼的多肽或其片段、或基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，有可能篩選可抑制該基因表達或由該基因編碼的多肽的生物活性的作用劑或化合物。在本發(fā)明的內(nèi) 容中，所述生物活性可以是細胞增殖活性。這些作用劑或化合物可以作為治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病(例如癌癥，如胰腺癌)的藥物的候選作用劑或化合物。因此，本發(fā)明進一步提供了使用C2orfl8基因、由該基因編碼的多肽或其片段、或該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū) 域來鑒定用于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病(例如癌癥，具體地胰腺癌，更具體地PDAC) 的候選作用劑或化合物的方法。通過本發(fā)明篩選方法鑒定的作用劑或化合物是可以抑制C2orfl8基因表達或基因的翻譯產(chǎn)物的活性的作用劑或化合物，并且是預期可有效治療C2orfl8相關(guān)疾病(例如癌癥，具體地胰腺癌，更具體地PDAC)的作用劑或化合物。也就是說，通過本發(fā)明鑒定的作用劑或化合物預期具有臨床利益，并可進一步在動物模型或測試受試者中測試其阻止過表達C2orfl8的細胞生長的能力。在本發(fā)明的內(nèi)容中，待通過本篩選方法鑒定的作用劑或化合物可以是任何生物制品、任何化合物或包括數(shù)種化合物的組合物。而且，根據(jù)本發(fā)明篩選方法暴露于細胞或蛋白質(zhì)的測試作用劑或化合物可以是單個化合物或多個化合物的組合。當在本方法中使用多個化合物的組合時，各化合物可以順次或同時被接觸。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何測試作用劑或化合物，例如細胞提取物、細胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵微生物產(chǎn)品、海洋生物提取物、植物提取物、純化的或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸構(gòu)建體，例如反義RNA、雙鏈分子、 siRNA,核酶等)和天然化合物。本發(fā)明的測試作用劑或化合物也可以用本領(lǐng)域已知的組合庫方法中的多種方法中的任一種獲得，包括但不僅限于(1)生物文庫，(2)空間可尋址的平行固相或溶液相文庫，(3)需要去卷積的合成文庫方法，(4)“ 一珠子一化合物(one-bead one-compound)“文庫方法和(5)使用親和色譜選擇的合成文庫方法。生物文庫方法僅限于肽文庫，而其它四種方法可用于肽、非肽寡聚體或化合物小分子文庫(Lam，Anticancer Drag Des 1997, 12:145-67)。用于合成分子庫的方法的實例可以在本領(lǐng)域技術(shù)中找到(DeWitt et al.，Proc Natl AcadSci USA 1993，90 6909-13 ； Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994，91 11422-6 ； Zuckermann et al., J Med Chem 37 2678-85，1994 ； Cho et al., Sciencel993, 261 1303-5; Carell et al.， Angew Chem Int Ed Engl 1994，33 2059 ； Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 2061 ； Gallop et al., J MedChem 1994，37 1233-51)?；衔飵炜梢栽谌芤褐写?在(見Houghten，Bio/Techniques 1992，13:412-21)，或在珠子(Lam，Nature 1991， 354 82-4)、芯片(Fodor，Nature 1993，364 555-6)、細菌(美國專利 5,223,409)、孢子(美國專禾U 5,571,698 ； 5,403,484,和 5,223,409)、質(zhì)粒(Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA1992, 89 1865-9)或噬菌體(Scott and Smith, Science 1990，249 386-90 ；Devlin, Science 1990，249 404-6 ； Cwirla et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1990，87 6378-82 ； Felici, J Mol Biol 1991，222 301-10;美國專利申請 2002103360)上存在。
通過任何本發(fā)明篩選方法鑒定的化合物結(jié)構(gòu)的一部分通過添加、刪除和/或置換加以改變而得到的化合物，均包含在通過本發(fā)明篩選方法獲得的作用劑或化合物中。
而且，當被篩選的測試作用劑或化合物是蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的DNA時，可以確定蛋白質(zhì)的全氨基酸序列從而推導編碼該蛋白質(zhì)的核酸序列，或者可以分析所得蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列，以便根據(jù)該序列制備作為探針的寡聚DNA，并用該探針篩選 cDNA文庫以獲得編碼該蛋白質(zhì)的DNA。所得的DNA可用于制備測試作用劑或化合物，作為治療或預防癌癥的候選物。
I.計算機模擬(In silico)篩選方法
可以利用具有所尋求性質(zhì)的已知化合物的分子結(jié)構(gòu)的信息，和/或被抑制的靶分子(即C2orfl8)的分子結(jié)構(gòu)的信息，來幫助構(gòu)建測試化合物文庫。的初步篩選適合于進一步評估的測試化合物的方法之一，是對測試化合物與其靶標之間的相互作用進行計算機建模。在本發(fā)明中，對測試化合物與C2orfl8之間相互作用的建?？商峁υ撓嗷?作用本身的細節(jié)的深入認識，并提示破壞該相互作用的可能策略，包括潛在的相互作用分子抑制劑。
計算機建模技術(shù)為針對選定分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化以及會與該分子相互作用的新化合物的合理設計提供了可能。三維構(gòu)建典型地依賴于從選定分子的χ-射線晶體分析或NMR成像而來的數(shù)據(jù)。分子動力學需要力場數(shù)據(jù)。計算機圖形系統(tǒng)為預測新化合物如何連接靶分子，以及實驗操作化合物和靶分子的結(jié)構(gòu)以優(yōu)化結(jié)合特異性提供了可能。為了預測當分子和化合物之一或二者發(fā)生細小改變時分子-化合物相互作用是什么樣的，需要分子力學軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯(lián)著分子設計程序和用戶之間的用戶友好的、菜單驅(qū)動的界面。
上文一般性描述的分子建模系統(tǒng)的一個實例由CHARMm和QUANTA程序， Polygen Corporation, Waltham, Mass組成。CHARMm實施能量最小化和分子動力學功能。QUANTA實施構(gòu)建、圖形建模和分子結(jié)構(gòu)分析。利用QUANTA可進行分子相互行為的互動性構(gòu)建、修飾、和可視化分析。
大量文獻回顧了與特定蛋白相互作用的藥物的計算建模，例如Rotivinen，et al.Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166 (1988) ； Ripka, NewScientist 54—57 (Jun. 16, 1988) ； McKinlayandRossmann, Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29, 111-122(1989)； Perry and Davies, Prog Clin BiolRes.291 189-93 (1989) ； Lewis and Dean，Proc.R.Soc. Lond B Biol Sci.236，125-40 and 141-62(1989)；關(guān)于核酸組分模型受體的有 Askew，et al., J.Am.Chem.Soc.lll, 1082-90(1989)。
其它篩選和圖形描述化合物的計算機程序可以從例如BioDesign，Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga，Ontario, Canada,禾口 Hypercube，Inc., Cambridge, Ontario。見例如 DesJarlais et al. (1988) J.Med.Chem.31 722-9 ； Meng et al. (1992) J.Computer Chem.13 505-24; Meng et al. (1993) Proteinsl7 266-78; Shoichet et al. (1993) Science 259 1445-50 等公司獲得。
一旦鑒定了 C2orfl8的假定抑制劑，便可采用組合化學技術(shù)，根據(jù)已鑒定假定抑制劑的化學結(jié)構(gòu)構(gòu)建任意數(shù)目的變異體。所得的假定抑制劑、或“測試作用劑”或“測試化合物”文庫可以用本發(fā)明的方法進行篩選，以鑒定可抑制C2orfl8的生物活性的測試作用劑或化合物。
II.基于蛋白質(zhì)的篩詵方法
根據(jù)本發(fā)明，C2orfl8基因的表達被提示對于過表達該基因的細胞(例如癌細胞，具體地說胰腺癌細胞，更具體地說PDAC細胞)的生長和/或生存至關(guān)重要。因此，我們考慮可抑制由該基因編碼的多肽的表達或功能的作用劑或化合物可抑制該細胞的生長和/或生存，從而可用于抑制細胞生長和治療或預防癌癥。因此，本發(fā)明提供了使用C2orfl8多肽鑒定用于抑制細胞生長的候選作用劑或化合物，或者用于治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的方法。在本發(fā)明中，待抑制生長的細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，具體地說是胰腺導管腺細胞。C2orfl8 相關(guān)疾病的特征是C2orfl8過表達，例如癌癥，如胰腺癌，具體地說是PDAC。
除了 C2orfl8多肽之外，多肽的片段也可用在本發(fā)明的內(nèi)容中，只要其保留天然存在的C2orfl8多肽的至少一種生物學活性即可。
多肽或其片段可以進一步與其它物質(zhì)連接，只要所得的多肽或片段保留原始肽的至少一種生物活性即可?？捎玫奈镔|(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；⑻烊缓秃?成聚合物等。這些種類的修飾可以用于提供額外的功能或使多肽和片段穩(wěn)定。
用于本方法的多肽或片段可以通過傳統(tǒng)的純化方法作為天然存在的蛋白質(zhì)從自然界中獲得，或者通過根據(jù)所選氨基酸序列化學合成獲得。例如，可適用于合成的傳統(tǒng) 肽合成方法包括
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
2) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
3) Peptide Synthesis (in Japanese), Marazen Co., 1975 ；
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)，Marazen Co.，1985 ；
5) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese)， Vol.14 (peptide synthesis), Hirokawa，1991 ；
6)W099/67288 ；和
7) Barany G & Merrifield R.B.，Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis"， Academic Press, New York, 1980，100-118.
或者，蛋白質(zhì)可以利用任何已知用于產(chǎn)生多肽的遺傳工程方法獲得(例如 Morrison J., J Bacteriology 1977, 132 349—51 ； Clark-Curtiss & Curtiss， Methods in Enzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101 347-62) 例如，首先，制備多核苷酸，其以可表達的形式編碼目標蛋白(例如在調(diào)節(jié)序列包括啟動子的下游)，將其轉(zhuǎn)化進入合適的宿主細胞，然后培養(yǎng)宿主細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。更具體地，通過將基因插入到用于表達表達外來基因的載體內(nèi)，例如pSV2neo，pcDNA I，pcDNA3.1, pCAGGS或pCD8，在宿主(例如動物)細胞中表達編碼C2orfl8多肽的基因。表達可使用啟動子。任何通用的啟動子均可采用，包括例如 SV40 早期啟動子(Rigby in Williamson(ed.)，Geneticengineering, vol.3.Academic Press, London, 1982, 83-141), the EF- α 啟動子(Kim et al., Gene 1990，91 217-23)，CAG 啟動子(Niwa et al., Gene 1991，108 193)，RSV LTR 啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 684-704), Sralpha 啟動子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 1988，8 466)，CMV 中早期啟動子(Seed et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1987，84: 3365-9)，SV40 晚期啟動子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982, 1 385-94)，腺病毒晚期啟動子(Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989，9 946)，HSV TK 啟動子等?？梢愿鶕?jù)任何方法將載體引入宿主細胞內(nèi)表達C2orfl8基因，例如電穿孔方法 (Chu et al., Nucleic Acids Res 1987，15 1311-26)、磷酸鈣方法(Chen et al., Mol Cell Bioll987, 7 2745-52)、DEAE 葡聚糖方法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 1984，12: 5707-17 ； Sussman et al., Mol Cell Biol 1984，4 1641-3)、脂轉(zhuǎn)染方法(Derijard B，Cell 1994，7 1025-37) ； Lamb et al., Nature Genetics 1993，5 22—30 ； Rabindran et al., Science 1993，259 230-4)等。
C2orfl8蛋白還可以在體外采用體外翻譯系統(tǒng)加以產(chǎn)生。
待與測試作用劑或化合物接觸的C2orfl8多肽可以是例如純化的多肽、可溶蛋白或與其它多肽融合的融合蛋白。
II-1.鑒定與C2orfl8多flt結(jié)合的作用劑或化合物
與蛋白結(jié)合的作用劑或化合物很可能改變編碼該蛋白的基因的表達或蛋白的生物活性。因此，在一個方面中，本發(fā)明提供了篩選可抑制細胞生長和治療或預防C2orfl8 相關(guān)疾病的作用劑或化合物的方法，其包括如下步驟
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；
b)檢測多肽(或片段)與測試作用劑或化合物的結(jié)合；和
c)選擇與多肽(或片段)結(jié)合的測試作用劑或化合物。
根據(jù)本發(fā)明，可以評估測試作用劑或化合物抑制細胞生長和治療或預防C2orfl8 相關(guān)疾病的測試作用劑或化合物的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了篩選用于抑制細胞生長和治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的作用劑或化合物的方法，包括如下步驟
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；
b)檢測多肽(或片段)與測試作用劑或化合物的結(jié)合；和
c)將b)的結(jié)合與測試作用劑或化合物的治療效果相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明中，可以將治療效果和測試作用劑或化合物的結(jié)合性質(zhì)相關(guān)聯(lián)。例如，當測試作用劑或化合物與多肽(或片段)結(jié)合時，該測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治療效果的候選作用劑或化合物?；蛘撸敎y試作用劑或化合物不與多肽(或片段)結(jié)合時，測試作用劑或化合物可以被鑒定為沒有顯著治療效果的作用劑或化合物。測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽的結(jié)合可以例如通過使用針對多肽的抗體進行免疫沉淀加以檢測。因此，為了進行這種檢測，優(yōu)選地，用于篩選的C2orfl8多肽或其功能片段含有抗體識別位點。用于篩選的抗體可以是識別本發(fā)明C2orfl8多肽的抗原性區(qū)域(例如表位)的抗體，其制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且任何方法均可在本發(fā) 明中用于制備這類抗體或其等價物。
或者，C2orfl8多肽或其功能片段可以被表達成融合蛋白，融合蛋白包括位于其 N或C端的具有特異性已經(jīng)揭示的針對多肽N或C端的單克隆抗體的識別位點(表位)。可以使用商業(yè)上可獲得的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine 1995，13 85-90)。商品化的載體能夠通過利用其多克隆位點表達與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白，這樣的載體可用于本發(fā) 明。而且，本領(lǐng)域還已知這樣的融合蛋白，它們含有小得多的表位，可以通過這對該表位的抗體進行免疫沉淀而檢測到(ExperimentalMedicine 1995，13: 85-90)。這些表位由數(shù)十個氨基酸構(gòu)成，從而不改變C2orfl8多肽或其片段性質(zhì)，它們也可用于本發(fā)明。實例包括，但不限于，多聚組氨酸(His標簽)、流感凝集物HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7標簽)、人類單純皰疹病毒糖蛋白 (HSV-標簽)、E-標簽(單克隆噬菌體上的表位)等。
谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)也是眾所周知的可以通過免疫沉淀檢測的融合蛋白的配對物(counterpart)。當使用GST作為與C2orfl8多肽或其片段融合形成融合蛋白的蛋白質(zhì)時，融合蛋白可以用針對GST的抗體或特異結(jié)合GST的物質(zhì)，即例如谷胱甘肽(例如谷胱甘肽-Sepharose 4B)加以檢測。
在免疫沉淀中，通過向C2orfl8多肽和測試作用劑或化合物的反應混合物添加抗體(識別C2orfl8多肽或其自身的功能片段，或多肽或片段標記的表位)而形成免疫復合物。如果測試作用劑或化合物具有結(jié)合多肽的能力，那么所形成的免疫復合物將由 C2orfl8多肽、測試作用劑或化合物和抗體構(gòu)成。相反，如果測試作用劑或化合物沒有這種能力，那么所形成的免疫復合物僅包括C2orfl8多肽和抗體。因此，測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽的結(jié)合能力可以通過例如測量所形成免疫復合物的大小來檢查。任何用于檢測物質(zhì)大小的方法均可使用，包括色譜、電泳等。例如，當使用小鼠^G抗體進行檢測時，可以使用蛋白A或蛋白G sepharose定量所形成的免疫復合物。
關(guān)于免疫沉淀的更多細節(jié)，見例如Harlow etal.，Antibodies, Cold SpringHa rbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52。
而且，用于篩選可與之結(jié)合的測試作用劑或化合物的C2orfl8多肽或其功能片段可以和載體結(jié)合。可用于結(jié)合多肽的載體實例包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；以及合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、葡聚糖和硅膠；優(yōu)選地，可以使用由上述材料制備的商業(yè)可獲得的珠子和平板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當使用珠子時，可以將它們填充到柱子內(nèi)。或者，在本領(lǐng)域還已知磁珠的使用，使用磁珠能夠通過磁性容易地分離結(jié)合在珠子上的多肽和測試作用劑或化合物。
多肽與載體的結(jié)合可以根據(jù)常規(guī)的方法進行，例如化學鍵合和物理吸附?；?者，多肽可以通過特異識別蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合于載體上。而且，多肽與載體還可以借助相互作用的分子(例如親和素和生物素的組合)來結(jié)合。
使用這些結(jié)合于載體的C2orfl8多肽或其功能片段的篩選方法包括例如如下步驟使測試作用劑或化合物與載體結(jié)合的多肽接觸，孵育混合物，清洗載體，和檢測和 /或測量與載體結(jié)合的作用劑或化合物。結(jié)合可以在緩沖液中進行，緩沖液例如但不限于磷酸緩沖液和Tris緩沖液，只要緩沖液不抑制結(jié)合即可。
使用這些載體結(jié)合的C2orfl8多肽或其功能片段的篩選方法的實例包括親和色譜。例如，C2orfl8多肽可以被固定在親和柱的載體上，將含有至少一種測試作用劑或化合物的溶液施加給柱子。在加載測試作用劑或化合物之后，清洗柱子，然后用合適的緩沖液洗脫與多肽結(jié)合的測試作用劑或化合物。
使用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可以用作檢測或定量本發(fā)明結(jié)合作用劑或化合物的手段。當使用這種生物傳感器時，C2orfl8多肽與測試作用劑或化合物的相互作用可以作為表面等離子體共振信號實時得到觀察，只需使用極少量的多肽，且無需標記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能用生物傳感器例如BIAcore評估多肽與測試作用劑之間的結(jié)合。
通過使分子暴露于固定在載體上的特定蛋白，從合成化合物中篩選或在天然物質(zhì)文庫或隨機噬菌體肽展示庫中篩選與特定蛋白結(jié)合的分子的方法，或者基于組合化學技術(shù)的高通量篩選方法(Wrighton et al.，Science 1996，273 458-64 ； Verdine, Nature 1996，384 11-3)來分離蛋白質(zhì)以及化合物的方法，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公所周知的。這些方法也可以用于篩選與C2orfl8蛋白或其片段結(jié)合的作用劑或化合物(包括激動劑和拮抗劑)。
當測試作用劑或化合物是蛋白質(zhì)時，本發(fā)明的方法可以使用例如West-Western 印跡分析Mkolnik etal.，Cell 1991，65:83-90)。具體地，與C2orfl8蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過下述方式獲得從預期表達至少一種與C2orfl8多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細胞、組織、器官或培養(yǎng)細胞(例如胰腺癌細胞)制備第一 cDNA文庫，用噬菌體載體(例如 ZAP)在LB-瓊脂糖上表達由cDNA文庫的載體所編碼的蛋白質(zhì)，將表達的載體固定在濾膜上，使純化并標記的C2orfl8多肽與上述濾膜反應，然后根據(jù)C2orfl8多肽的標記檢測表達C2orfl8多肽所結(jié)合的蛋白的噬菌斑。
標記物質(zhì)，例如放射性同位素(例如4，14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 131I) >酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β -半乳糖苷酶、α -葡萄糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如熒光素異硫氰酸酯(FITC)、若丹明)和生物素/親和素，可用于標記本發(fā)明方法中的 C2orfl8多肽。當?shù)鞍踪|(zhì)用放射性同位素標記時，檢測或測量可以通過液體閃爍進行?；?者，當?shù)鞍踪|(zhì)用酶標記時，可以通過添加酶的底物用吸收光度計檢測底物的酶學變化，例如顏色產(chǎn)生，來檢測或測量。此外，當使用熒光物質(zhì)作為標記時，結(jié)合蛋白可以用熒光光度計進行檢測或測量。
而且，與蛋白結(jié)合的C2orfl8多肽可以通過利用特異結(jié)合C2orfl8多肽，或者特異結(jié)合與C2orfl8多肽融合的蛋白或多肽(例如GST)的抗體進行檢測和測量。在本發(fā)明篩選中使用抗體的情況下，抗體優(yōu)選地用上述的標記物質(zhì)之一進行標記，并基于該標記物質(zhì)進行檢測和測量?；蛘?，可以使用針對C2orfl8多肽的抗體作為第一抗體，用標記有標的底物的第二抗體進行檢測。而且，在本篩選中與C2orfl8多肽結(jié)合的抗體可以用蛋白G或蛋白A柱加以檢測或測量。
或者，在本發(fā)明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(〃 MATCHMAKER Two-Hybrid system “， “ MammalianMATCHMAKER Two-HybridAssayKit"， “ MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ； “ Hybri ZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene) ； thereferences“ Dalton et al., Cell 1992, 68: 597-612〃和〃 Fields etal.，Trends Genet 1994，10: 286-92")。在雙雜交系統(tǒng)中， C2orfl8多肽或其片段與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。從預期表達至少一種與C2orfl8多肽結(jié)合的蛋白質(zhì)的細胞制備cDNA文庫，從而使該文庫在表達時與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。然后，將cDNA文庫引入到上述酵母細胞中，從檢測到的陽性克隆分離文庫來源的cDNA(當與C2orfl8多肽結(jié)合的蛋白在酵母細胞內(nèi)表達時，兩者的結(jié)合會激活報告基因，使陽性克隆可以被檢測到)。由CDNA編碼的蛋白質(zhì)可以通過將所上面分離到的CDNA引入到大腸桿菌中并表達該蛋白加以制備。
作為報告基因，除了 HB3基因之外，可以使用例如Ade2基因、IacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。
由本篩選鑒定的作用劑或化合物是C2orfl8多肽激動劑或拮抗劑的候選物。術(shù)語 “激動劑”是指可通過與多肽結(jié)合激活多肽功能的分子。而術(shù)語“拮抗劑”是指可以通過與多肽結(jié)合抑制多肽功能的分子。而且，通過本篩選作為拮抗劑分離的作用劑或化合物是可以在體內(nèi)抑制C2orfl8多肽與分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白質(zhì))之間相互作用的候選物。
II-2. iSi寸徹丨丨C2orfl8碰刪編牛糊乍膽丨·勁勿
根據(jù)本發(fā)明，證明了 C2orfl8基因的表達對過表達C2orfl8的細胞，例如癌細胞，具體地胰腺癌細胞，更具體地PDAC細胞，的生長和/或生存至關(guān)重要。因此，可阻礙或抑制C2orfl8基因翻譯產(chǎn)物的表達或生物功能的作用劑或化合物被認為可用作抑制細胞生長的候選作用劑或化合物，或者用于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物。因此，本發(fā)明還提供了使用C2orfl8多肽或其片段來篩選用于抑制細胞生長的候選作用劑或化合物或者用于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的方法，其包括如下步驟
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；和
b)檢測步驟a)中多肽或片段的生物活性。
根據(jù)本發(fā)明，可以對抑制細胞生長的測試作用劑或化合物或者用于治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的治療效果進行評估。因此，本發(fā)明還提供了使用C2orfl8多肽或其片段篩選可抑制細胞生長的候選作用劑或化合物或者用于治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的方法，其包括如下步驟
a)使測試作用劑或化合物與C2orfl8多肽或其功能片段接觸；和
b)檢測步驟a)中多肽或片段的生物活性；和
c)將b)的生物活性與測試作用劑或化合物的治療效果相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明中，治療效果可以和C2orfl8多肽或其功能片段的生物活性相關(guān)聯(lián)。例如，當與不存在該測試作用利或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物阻礙或抑制C2orfl8多肽或其功能片段的生物功能時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇為具有治療效果的候選作用劑或化合物。或者，當測試作用劑或化合物不妨礙或抑制 C2orfl8多肽或其功能片段的生物活性時，測試作用劑或化合物可以被鑒定為沒有顯著治療效果的作用劑或化合物。
任何多肽均可用于篩選，只要它具有C2orfl8多肽的一種生物學功能，可以用作本發(fā)明篩選方法的指標即可。因為C2orfl8多肽具有促進癌細胞之細胞增殖的能力，所以可以用作篩選指標的C2orfl8多肽的生物學活性包括人類C2orfl8多肽的這種細胞增殖活性。例如，可以使用人類C2orfl8多肽，也可以使用與其功能等價的多肽，包括其功能片段。這些多肽可以被內(nèi)源表達，或者由合適的細胞外源表達。
當待在本發(fā)明檢測的生物活性是細胞增殖活性或抗細胞凋亡活性時，可以通過例如如下方法進行檢測制備表達C2orfl8多肽或其功能片段的細胞，在測試作用劑或化合物的存在下培養(yǎng)細胞，和確定細胞增殖的速度，測量細胞周期等，以及通過檢測傷口愈合活性，進行基質(zhì)膠(Matrigel)侵襲測定和測量集落形成活性。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，篩選在上面的步驟(b)之后進一步包括步驟C)選擇與不存在該測試作用劑或化合物時檢測到的生物活性相比，抑制多肽生物活性的測試作用劑或化合物。
而且，通過與對不表達C2orfl8細胞的效果相比較，可以確認候選作用劑或化合物對C2orfl8的特異性。如果候選作用劑或化合物能夠在表達C2orfl8的細胞中起效，而在不表達C2orfl8的細胞中不起效，則候選作用劑或化合物對C2orfl8具有特異性。通過本篩選分離的作用劑或化合物是C2orfl8多肽拮抗劑的候選作用劑或化合物，因此是抑制多肽與分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白質(zhì))之間的體內(nèi)相互作用的候選作用劑或化合物。
除了細胞增殖活性或抗細胞凋亡活性之外，C2orfl8蛋白還具有對ANT2蛋白的結(jié)合活性。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制C2orfl8與ANT2之間結(jié)合的作用劑或化合物的方法?？梢种艭2orfl8與ANT2之間結(jié)合的作用劑或化合物預期可以抑制癌細胞的增殖，因此可用于治療或預防癌癥。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防癌癥的候選作用劑或化合物的方法。
更具體地，該方法包括如下步驟
(a)在測試作用劑或化合物的存在下，使C2orfl8蛋白與ANT2蛋白接觸；
(b)檢測C2orfl8與ANT2蛋白之間的結(jié)合水平；
(c)比較C2orfl8和ANT2蛋白之間的結(jié)合水平與不存在該測試作用劑或化合物時檢測到的水平；和
(d)選擇可降低C2orfl8和ANT2蛋白之間結(jié)合水平的測試作用劑或化合物作為可抑制C2orfl8與ANT2蛋白之間結(jié)合的作用劑或化合物，即可用于抑制癌細胞增殖和治療或預防癌癥的候選作用劑或化合物。
根據(jù)本發(fā)明，可以對測試作用劑或化合物對抑制細胞生長的治療效果或者候選作用劑或化合物對治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的治療效果進行評價。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防癌癥的候選作用劑或化合物的方法。更具體地，該方法包括如下步驟
(a)在測試作用劑或化合物的存在下，使C2orfl8蛋白與ANT2蛋白接觸；
(b)檢測C2orfl8與ANT2蛋白之間的結(jié)合水平；
(c)比較C2orfl8和ANT2蛋白之間的結(jié)合水平與不存在該測試作用劑或化合物時檢測到的水平；和
(d)將C)的結(jié)合水平與測試作用劑或化合物的治療效果相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明中，可以將治療效果和C2orfl8與ANT2蛋白的結(jié)合水平相關(guān)聯(lián)。例如，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物降低 C2orfl8與ANT2蛋白的結(jié)合水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治療效果的候選作用劑或化合物。或者，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物沒有降低C2orfl8與ANT2蛋白的結(jié)合水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為沒有顯著治療效果的候選作用劑或化合物。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，兩個蛋白的“結(jié)合的抑制”是指至少降低蛋白質(zhì)之間的結(jié) 合。因此，在一些情況下，樣品中結(jié)合對的百分比與合適(例如沒有用測試作用劑處理的)的對照樣品相比將會降低。結(jié)合蛋白的量可以是對照樣品中結(jié)合蛋白的量的例如 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 25%, 10%, 5%, 1 %或者更少(例如 0% )。
這里，C2orfl8蛋白和ANT2蛋白可以包括如上所述的這些蛋白的功能等價物。用于篩選的C2orfl8或ANT2蛋白或其功能等價物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法作為重組蛋白或天然蛋白加以制備。蛋白質(zhì)可以通過任何已知的用于產(chǎn)生肽的遺傳工程方法獲得(例如 Morrison J.，JBacteriology 1977，132 349-51 ； Clark-Curtiss & Curtiss, Methods inEnzymology (eds.Wu et al.) 1983, 101 347-62)。例如，重組蛋白可以通過如下方法加以制備將編碼該蛋白的DNA (例如具有SEQ ID NO: 11 (用于C2orfl8) 或25(用于ANT2)的核苷酸序列的DNA)插入到合適的表達載體內(nèi)，將載體引入到合適的宿主細胞，在合適的培養(yǎng)介質(zhì)中溫育宿主細胞，獲得宿主細胞的提取物，然后對提取物進行色譜分離，例如離子交換色譜、反相色譜、凝膠過濾或利用固定有針對該蛋白質(zhì) 的抗體柱的親和色譜，或者通過多個上述柱子的組合，純化出蛋白質(zhì)。
另外，當可用于本發(fā)明內(nèi)容的蛋白質(zhì)在宿主細胞內(nèi)(例如動物細胞和大腸桿菌)作為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白的融合蛋白或者作為附加了多個組氨酸的重組蛋白表達時，所表達的重組蛋白可以用谷胱甘肽柱或鎳柱純化。在純化融合蛋白之后，如果需要，還可能通過用凝血酶或因子-Xa切割除去除目標蛋白之外的區(qū)域。
天然蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以分離，例如通過使親和柱與表達該蛋白質(zhì)的組織或細胞提取物接觸，其中在親和柱中結(jié)合有與如上所述的C2orfl8或 ANT2蛋白結(jié)合的抗體?？贵w可以是多克隆抗體、單克隆抗體或任何修飾抗體，只要它結(jié)合C2orfl8或ANT2蛋白即可。
C2orfl8或ANT2蛋白或其功能等價物也可以利用體外翻譯系統(tǒng)在體外產(chǎn)生。
進一步，C2orfl8或ANT2蛋白的部分肽也可以用于本發(fā)明，只要它們保留彼此之間的結(jié)合活性即可。這些部分肽可以通過遺傳工程方法、已知的肽合成方法、或者用合適的肽酶消化天然C2orfl8或ANT2蛋白來產(chǎn)生。對于肽合成，可以使用例如固相合成或液相合成。可用于合成的傳統(tǒng)肽合成方法包括
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966 ；
2) The Proteins, Vol.2, Academic Press, New York, 1976 ；
3) Peptide Synthesis (日文)，Marazen Co.，1975 ；
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese)，Marazen Co.，1985 ；
5) Development of Pharmaceuticals (second volume)(曰文)， Vol.14 (peptidesynthesis), Hirokawa, 1991 ；
6)W099/67288 ；和
7) Barany G.& Merrifield R.B., Peptides Vol.2, “ Solid Phase Peptide Synthesis"，Academic Press, New York, 1980，100-118.
多肽或其片段可以進一步與其它物質(zhì)相連，只要該多肽或片段保留其原來的彼此之間結(jié)合的能力即可。可用的物質(zhì)包括肽、脂質(zhì)、糖和糖鏈、乙?；⑻烊缓秃铣删酆衔锏?。可以實施這些類型的修飾以賦予多肽額外的功能或使和片段穩(wěn)定。
在測試作用劑或化合物存在下進行接觸的C2orfl8和ANT2多肽或其功能等價物可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白或與其它多肽融合的融合蛋白。
本發(fā)明的篩選方法提供了高效而快速的鑒定方法，可以鑒定很可能干擾C2orfl8 與其結(jié)合配偶ANT2之間的結(jié)合的測試作用劑或化合物。一般地，任何可以確定測試作用劑或化合物干擾這種結(jié)合的能力的方法均適用于本發(fā)明。例如，可以采用ELISA形式的競爭和非競爭性抑制測定。應當進行對照實驗以確定系統(tǒng)的最大結(jié)合能力(例如使 C2orfl8與ANT2接觸，并確定與C2orfl8結(jié)合的ANT2的量)。
作為鑒定可抑制蛋白間結(jié)合的作用劑或化合物的方法，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的許多方法。這些鑒定可以作為體外測定系統(tǒng)實施，例如在細胞系統(tǒng)中實施。更具體地，首先，C2orfl8或其配偶體ANT2與支持物結(jié)合，然后使另一蛋白與測試作用劑或化合物一起與之接觸。接著，溫育混合物，清洗，并檢測和/或測量與支持物結(jié)合的另一蛋白。
可用于結(jié)合蛋白質(zhì)的支持物的實例包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；和合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡膠(silicon)；優(yōu)選地可以使用由上述材料制成的商業(yè)可獲得的珠子和平板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當使用珠子時，可以將它們填充到柱子內(nèi)。或者，磁珠的使用也是本領(lǐng)域已知的，使用磁珠能夠容易地通過磁力分離結(jié)合在珠子上的蛋白質(zhì)。
蛋白與支持物的結(jié)合可以根據(jù)常規(guī)的方法進行，例如化學鍵合和物理吸附?；?者，可以通過特異識別該蛋白的抗體使蛋白與支持物結(jié)合。此外，還可以借助相互作用的分子，例如親和素與生物素的組合，來實現(xiàn)蛋白與支持物的結(jié)合。
蛋白間的結(jié)合在緩沖液中實施，緩沖液例如但不僅限于，磷酸鹽緩沖液和Tris 緩沖液，只要該緩沖液不抑制蛋白間的結(jié)合即可。
在本發(fā)明中，可以使用利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器作為檢測或定量結(jié)合蛋白的裝置。當使用這種生物傳感器時，蛋白之間的相互作用可以作為表面等離子體共振信號實時地得到觀察，僅需使用極少量的多肽并且無需標記(例如BIAcore， Pharmacia)。因此，有可能使用生物傳感器例如BIAcore評估C2orfl8與ANT2之間的結(jié)口 O
或者，可以標記C2orfl8或ANT2，而且結(jié)合蛋白的標記物可以用來檢測或測量結(jié)合蛋白。具體地說，在預標記某種蛋白質(zhì)之后，在測試作用劑或化合物的存在下使被標記的蛋白與其它的蛋白接觸，然后在清洗之后根據(jù)標記物檢測或測量結(jié)合蛋白。
放射性同位素(例如3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 1311)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如熒光素異硫氰酸酯(FITC)、熒光黃、德州紅(Texas red)、綠色熒光蛋白和若丹明)、磁珠(例如 DYNABEADS )、量熱標記(calorimetric label)(例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠(latex)等)球珠)、和生物素/親和素等標記物質(zhì)，可用于在本發(fā)明方法中標記蛋白。如下專利教導了這些標記的使用，包括美國專利3,817,837、 3,850,752、3,939,350、3,996,345, 4,277,437、4,275,149 和 4,366,241。然而，本發(fā)明并不僅限于此，任何可以通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段檢測到的標記均可使用。
當?shù)鞍子梅派湫酝凰貥擞洉r，檢測或測量可以通過液體閃爍實施?；蛘撸?酶標記的蛋白質(zhì)可以通過添加酶的底物用吸收光度計檢測底物的酶學變化，例如顏色產(chǎn) 生，加以檢測或測量。而且，在使用熒光物質(zhì)作為標記的情況下，結(jié)合蛋白可以用熒光光度計加以檢測或測量。
而且，本篩選方法中的結(jié)合還可以用針對C2orfl8或ANT2的抗體加以檢測或測量。例如，在使固定在支持物上的C2orfl8與測試作用劑或化合物和ANT2接觸之后，溫育混合物并清洗，并可以用針對ANT2的抗體進行檢測或測量?；蛘?，可以將ANT2 固定在支持物上，并可以使用針對C2orfl8的抗體作為檢測抗體。
當在本篩選中使用抗體時，抗體優(yōu)選地用上面提到的一種標記物質(zhì)標記，并根據(jù)該標記物質(zhì)進行檢測或測量?；蛘撸槍2orfl8或ANT2的抗體可以用作第一抗體，然后用標記有標記物質(zhì)的第二抗體檢測第一抗體。而且，在本發(fā)明篩選中與蛋白結(jié)合的抗體可以用蛋白G或蛋白A柱加以檢測或測量。
或者，在本發(fā)明鑒定方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系統(tǒng)(〃 MATCHMAKERTwo-Hybridsystem"，“ MammalianMATCHMAKERTwo-Hybrid Assay Kit “， “ MATCHMAKER one-Hybridsystem “ (Clontech) ； “ HybriZAP Two-Hybrid Vector System “ (Stratagene)；參考文獻"Dalton and Treisman, Cell 1992, 68: 597-612〃， “ Fields and Sternglanz, Trends Genet 1994, 10: 286-92〃)。在雙雜交系統(tǒng)中，例如，C2orfl8與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細胞中表達。 ANT2與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，在測試作用劑或化合物的存在下也在酵母細胞中表達。或者，可以將ANT2和SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，而將C2orfl8與VP16 或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。當測試作用劑或化合物不抑制C2orfl8和ANT2間的結(jié)合時，兩者的結(jié)合激活報告基因，使陽性克隆可以被檢測。作為報告基因，除了 HB3基因之外，也可以使用例如Ade2基因、LacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。
這里，C2orfl8與ANT2間的結(jié)合水平還可以作為C2orfl8與ANT2結(jié)合后發(fā)生的任何變化而被測量。具體地，這種篩選可以通過使測試作用劑或化合物與表達C2orfl8 和ANT2的細胞(例如J82或UMUC細胞)接觸來實施。例如，可以檢測對細胞增殖的抑制，以確定測試作用劑或化合物對C2orfl8與ANT2結(jié)合的影響。
1.競爭測定模式
競爭測定可以用于篩選本發(fā)明的測試作用劑或化合物。例如，競爭ELISA形式可以包括與固體支持物結(jié)合的C2orfl8 (或ANT2)。結(jié)合的C2orfl8 (或ANT2)與 ANT2(或C2orfl8)和測試作用劑或化合物溫育。經(jīng)過足夠長時間以允許測試作用劑或化合物和/或ANT2 (或C2orfl8)與C2orfl8 (或ANT2)結(jié)合之后，對底物進行清洗，除去未結(jié)合的材料。然后確定與C2orfl8結(jié)合的ANT2的量。這可以用多種本領(lǐng)域已知的方法中的任何一種實現(xiàn)，例如通過使用標記有可檢測標簽的ANT2(或C2orfl8)物質(zhì)，或者通過使經(jīng)過清洗的底物與針對ANT2 (或C2orfW)的被標記抗體接觸。與C2orfl8 (或 ANT2)結(jié)合的ANT2 (或C2orfl8)的量與測試作用劑或化合物干擾C2orfl8與ANT2結(jié)合的能力成反比。Harlow & Lane，Antibodies, ALaboratory Manual (1988)中介紹了包括抗體和標簽在內(nèi)的標準方法。
在一種變化形式中，用親和標簽標記C2orfl8(或ANT》。然后將被標記的 C2orfl8 (或ANT2)與測試作用劑或化合物和ANT2 (或C2orfl8) —起溫育，然后免疫沉淀。然后用針對ANT2 (或C2orfl8)的抗體對免疫沉淀物進行Western印跡。與前面的競爭試驗形式相同，被檢測與C2orfl8 (或ANT2)結(jié)合的ANT2 (或C2orfl8)的量與測試作用劑或化合物干擾C2orfl8與ANT2結(jié)合的能力成反比。
2.非競爭測定樽式
對于構(gòu)建為不易用例如在本文中描述的競爭性測定進行篩選的形式的測試作用劑或化合物文庫，非競爭結(jié)合測定也可以用于初始篩選。這種文庫的一個實例是噬菌體展示文庫(見例如 Barrett etal.，Anal Biochem 1992，204 357-64)。
使用噬菌體庫是因為能夠快速產(chǎn)生工作量的多種不同重組肽。噬菌體文庫不適合進行本發(fā)明的競爭測定，但可以有效地以非競爭模式進行篩選，確定哪種重組肽作為與C2orfl8或ANT2結(jié)合的測試作用劑或化合物。對于在非競爭模式中鑒定的測試作用劑或化合物，隨后可以用本領(lǐng)域眾所周知的任何方法來制備，并進一步用競爭測定模式進行篩選。噬菌體和細胞展示文庫的制備和篩選是本領(lǐng)域眾所周知的，在例如下列文獻中有討論Ladner et al.，WO 88/06630 ； Fuchs et al.，Biotechnology 1991，9 1369-72 ； Gowardetal., TIBS 1993，18: 136-40 ； Charbit etal., EMBO J 1986，5 3029-37; Cull etal., PNAS USA 1992, 89: 1865-9; Cwirla etal.，PNAS USA 1990, 87: 6378-82。
非競爭性測定的一個實例遵循與上面關(guān)于競爭測定所說明的相類似的程序，只是不添加其中一種組分(C2orfl8或ANT》。然而，由于非競爭模式確定與C2orfl8或 ANT2結(jié)合的測試作用劑或化合物，需要為每種候選物確定測試作用劑或化合物與同時 C2orfl8和ANT2結(jié)合的能力。因此，例如，可以通過下述方法測定測試作用劑或化合物與固定的C2orfl8的結(jié)合清洗掉未結(jié)合的測試作用劑或化合物；從支持物上洗脫結(jié) 合的測試作用劑或化合物，隨后通過例如質(zhì)譜、蛋白質(zhì)定量(Bradford或Lowry測定或確 S^Onm吸光度)對洗脫物進行分析?；蛘?，可以省略洗脫步驟，測試作用劑或化合物的結(jié)合可以通過監(jiān)視支持物表面上有機層的光譜性質(zhì)來測定。監(jiān)視表面光譜性質(zhì)的方法包括，但不僅限于，吸光度、反射、透射、雙折射、折射系數(shù)、衍射、表面等離子體共振、橢圓光度(ellipsometry)、共振鏡技術(shù)(resonantmirror techniques)、光柵耦合波導技術(shù) (grating coupled waveguide techniques)和多普勒共振光譜，所有這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本測定中也可以使用標記的測試作用劑或化合物，以免除對洗脫步驟的需要。在這種情況下，在清洗掉未結(jié)合的材料后，與支持物結(jié)合的標記物的量與測試作用劑或化合物的結(jié)合成正比。
已經(jīng)開發(fā)了許多眾所周知的機器人系統(tǒng)用于溶液相化學。這些系統(tǒng)包括自動化工作站，例如由Takeda Chemicanndustries，LTD. (Osaka, Japan)開發(fā)的自動化合成裝置和許多利用機器人臂的機器人系統(tǒng)(Zymate II，ZymarkCorporation，Hopkinton, Mass.； Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif.),它們模擬由化學家實施的人工合成操作。上述的任何裝置均適用于本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然能夠想到對這些裝置進行什么性質(zhì)的修改和如何實施這樣的修改(如果有的話)，使它們能夠像本文中描述地那樣運行。此外，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員大量的組合庫本身是可以商業(yè)獲得的(見例如ComGenex， Princeton, N.J.，Asinex, Moscow, Ru，Tripos, Inc., St.Louis, MO, ChemStar, Ltd,Moscow，RU，3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences，Columbia，MD，寸乂 O
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本篩選方法必需的組分可以作為試劑盒提供，用于篩選可抑制C2orfl8和ANT2間結(jié)合的作用劑或化合物，或可抑制胰腺癌細胞增殖的作用劑或化合物，或用于治療或預防胰腺癌的作用劑或化合物。試劑盒可以包含例如C2orfl8多肽或其功能等價物，和/或ANT2多肽或其功能等價物。進一步，試劑盒可以包括對照作用劑(陽性和/或陰性)、可檢測的標簽、反應緩沖液、細胞培養(yǎng)介質(zhì)、篩選所需的容器、用于實施本方法的使用說明(例如文字、磁帶、VCR、CD-ROM等)等。組分和試劑可以包裝在不同的容器內(nèi)。
III.基于核苷酸的篩詵方法
III-I.使用C2orfl8基因的篩選方法
如上面所詳細說明的，通過控制C2orfl8基因的表達水平，可以控制細胞生長或 C2orfl8相關(guān)疾病的發(fā)生和進展。因此，可以使用C2orfl8基因的表達水平作為指標進行篩選，鑒定可用于抑制細胞生長或治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物。在本發(fā)明的內(nèi)容中，這種篩選可以包括例如如下步驟
a)使測試作用劑或化合物與表達C2orfl8基因的細胞接觸；
b)檢測C2orfl8基因的表達水平；和
C)選擇與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比可降低C2orfl8基因的表達水平的測試作用劑或化合物。
根據(jù)本發(fā)明，可以評估測試作用劑或化合物對抑制細胞生長的治療效果或者候選作用劑或化合物對治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的方法。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，這種篩選可以包括例如如下步驟
a)使測試作用劑或化合物與表達C2orfl8基因的細胞接觸；
b)檢測C2orfl8基因的表達水平；和
c)將b)的表達水平與測試作用劑或化合物的治療效果相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明中，可以將治療效果和C2orfl8基因的表達水平相關(guān)聯(lián)。例如，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物可降低C2orfl8基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治療效果的候選作用劑或化合物。或者，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物不降低C2orfl8基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為沒有顯著治療效果的作用劑或化合物。
更具體地，所述表達水平可以通過從下組選出的方法進行檢測
(a)檢測編碼C2orfl8多肽或其功能等價物的mRNA的量；
(b)檢測C2orfl8多肽或其功能等價物的量；和
(c)檢測C2orfl8多肽或其功能等價物的生物活性。
優(yōu)選地，表達C2orfl8多肽的細胞的細胞增殖活性可以作為所述生物活性被檢測。
在本發(fā)明中，細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，胰腺導管腺癌(PDAC)細胞。C2orfl8相關(guān)疾病的特征是過表達C2orfl8，例如癌癥，如胰腺癌，具體地胰腺導管腺癌(PDAC)?？梢酝ㄟ^使表達C2orfl8基因的細胞與測試作用劑或化合物接觸，然后檢測C2orfl8基因的表達水平，來鑒定可抑制C2orfl8基因表達的作用劑或化合物。自然，也可以使用表達該基因的細胞群體代替單個細胞來實施鑒定。與不存在測試作用劑或化合物時的表達水平相比，存在測試作用劑或化合物時檢測到表達水平降低，表明測試作用劑或化合物是C2orfl8基因的抑制劑，提示該測試作用劑或化合物有可能用于抑制癌癥，因此是治療或預防癌癥的候選作用劑或化合物。
基因的表達水平可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法進行估計。C2orfl8基因的表達水平可以用例如在“實施例”中說明的方法來確定。
用于這種鑒定的細胞或細胞群體可以是任何細胞或任何細胞群體，只要它表達 C2orfl8基因即可。例如，細胞或細胞群體可以是或者含有衍生自組織的上皮細胞?；?者，細胞或細胞群體可以是或者含有衍生自癌性細胞的永生細胞，包括來自胰腺癌，例如PDAC，的永生細胞。表達C2orfl8基因的細胞包括例如從癌癥建立的細胞系(例如 MIA_PaCA2)。而且，細胞或細胞群體可以是或者含有被C2orfl8基因轉(zhuǎn)染的細胞。
本方法允許篩選各種作用劑或化合物，并且特別適合于鑒定功能核酸分子，包括反義RNA、siRNA等。
III-2.使用C2orfl8基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的篩選方法
根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了包括如下步驟的方法
a)使測試作用劑或化合物與引入了載體的細胞接觸，其中該載體由C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因構(gòu)成；
b)檢測所述報告基因的表達或活性；和
c)選擇與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，可降低所述報告基因的表達或活性的測試作用劑或化合物。
根據(jù)本發(fā)明，可以評估測試作用劑或化合物對抑制細胞生長的治療效果或者治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的治療效果。因此，本發(fā)明還提供了用于篩選可抑制癌細胞增殖的候選作用劑或化合物的方法，和用于篩選用于治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病的候選作用劑或化合物的方法。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，這種篩選可以包括例如如下步驟
根據(jù)另一個方面，本發(fā)明提供了包括如下步驟的方法
a)使測試作用劑或化合物與引入了載體的細胞接觸，其中該載體由C2orfl8基因的轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)區(qū)和在該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因構(gòu)成；
b)檢測所述報告基因的表達或活性；和
c)將b)的表達水平與測試作用劑或化合物的治療效果相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明中，可以將治療效果和所述報告基因的表達或活性相關(guān)聯(lián)。例如，當與不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物可降低所述報告基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為具有治療效果的候選作用劑或化合物?；蛘撸斉c不存在測試作用劑或化合物時檢測到的水平相比，測試作用劑或化合物不會降低所述報告基因的表達水平時，測試作用劑或化合物可以被鑒定或選擇作為沒有顯著治療效果的作用劑或化合物。
合適的報告基因和宿主細胞是本領(lǐng)域眾所周知的。篩選所需的報告構(gòu)建體可以用C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域制備，可以根據(jù)基因的核苷酸序列信息從基因組文庫獲得含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的核苷酸節(jié)段，作為上述C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域可以是例如C2orfl8基因的啟動子序列。篩選所需的報告構(gòu)建體可以通過將報告基因序列連接于C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域來制備。這里的C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域是如下的區(qū)域，從起始密碼子到上游至少500bp，優(yōu)選地上游lOOObp，更優(yōu)選地上游5000或lOOOObp。含有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的核苷酸節(jié)段可以從基因組文庫中分離或者可以通過PCR擴增。鑒定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的方法以及測定規(guī)程是眾所周知的 (Molecular Cloningthird edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。用含有所述報告構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，并通過本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測報告基因的表達水平或活性(例如使用光度計、吸收光度計、流式細胞儀等)。這里所定義的 “降低表達水平或活性”優(yōu)選為比不存在化合物時使報告基因的表達水平或活性降低至少10%，更優(yōu)選地降低至少25%，50%或75%，最優(yōu)選地降低至少95%。
當使用與C2orfl8基因的調(diào)節(jié)序列(例如啟動子序列)可操作連接的報告基因轉(zhuǎn) 化細胞時，通過鑒定報告基因產(chǎn)物的表達水平可以鑒定測試作用劑或化合物是抑制還是提高C2orfl8基因的表達。
作為報告基因，可以使用例如本領(lǐng)域眾所周知的例如Ade2基因、IacZ基因、 CAT基因、螢光素酶基因、HIS3基因等。檢測這些基因表達的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
III-3.選擇適合于特定個體的治療劑或化合物
不同個體的遺傳構(gòu)成上的差異會導致他們代謝各種藥物的相對能力不同。對于在受試者體內(nèi)被代謝后發(fā)揮抗腫瘤作用劑或化合物功能的作用劑或化合物，它們可以通過誘導受試者細胞中的基因表達模式的變化，使癌癥狀態(tài)的特征向非癌癥狀態(tài)的基因表達模式特征改變，從而顯示自身的存在。因此，利用C2orfl8基因，本文中公開了它在癌性和非癌性細胞間具有差異表達，可以在來自所選受試者的測試細胞群體中對假定的治療或預防性癌癥抑制劑進行檢測，以確定該作用劑或化合物是否適合于在該受試者體內(nèi)抑制癌癥。
為了鑒定適合于特定受試者的癌癥抑制劑，將來自受試者的測試細胞群體暴露于候選治療劑或化合物，并確定C2orfl8基因的表達。在本發(fā)明方法的內(nèi)容中，測試細胞群體含有表達C2orfl8基因的癌細胞。優(yōu)選地，測試細胞是上皮細胞。
具體地，可以將測試細胞群體在候選治療劑或化合物的存在下溫育，測量測試細胞群體中C2orfl8基因的表達水平，并與一個或多個參考序型進行比較，例如癌性參考表達序型、非癌性參考表達序型或不存在該治療劑或化合物時的參考表達序型。
與治療劑或化合物接觸的測試細胞群體中與含有癌細胞的參考細胞群體或不存在該作用劑或化合物的參考細胞群體相比，C2orfl8基因的表達水平降低表明該治療劑或化合物在該測試細胞群體所來源的受試者體內(nèi)具有治療潛力。
用于抑制細胞生長或治療或預防癌癥的組合物
通過本發(fā)明任何篩選方法鑒定的作用劑，針對C2orfl8基因的雙鏈分子，和針對C2orfl8多肽的抗體，可抑制或阻礙C2orfl8基因的表達，或C2orfl8多肽的生物活性，從而抑制細胞增殖。因此，本發(fā)明提供了用于抑制細胞生長的組合物或用于治療或預防 C2orfl8相關(guān)疾病的組合物，該組合物包括通過本發(fā)明任何篩選方法鑒定的作用劑，例如針對C2orfl8基因的雙鏈分子，或針對C2orfl8多肽的抗體，肽模擬物、化合物或其組合。在本發(fā)明中，細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，具體地是胰腺導管腺癌(PDAC)細胞。C2orfl8相關(guān)疾病的特征是過表達C2orfl8，例如癌癥，如胰腺癌，具體地是胰腺導管腺癌(PDAC)。本組合物可用于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病，例如癌癥，具體地是胰腺癌，如PDAC。
組合物可以作為藥物用于人類和其它哺乳動物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒和黑猩猩。
在本發(fā)明的內(nèi)容中，用于本發(fā)明在下文詳述的活性成分(包括篩選到的作用劑、反義核酸、雙鏈分子、抗體等)的合適藥物制劑包括適合于口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、局部(包括含服和舌下)、陰道或腸胃外(包括肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))給藥的制劑，或者通過吸入或吹入給藥的制劑。優(yōu)選地，給藥是靜脈內(nèi)給藥。制劑可以任選地包裝成離散的劑量單位。
適合于口服給藥的藥物制劑包括膠囊、微膠囊、扁膠囊和藥片，分別含有預定量的活性成分。合適的制劑還包括粉末、酏劑、顆粒、溶液、懸浮液和乳劑?；钚猿煞?任選地作為大丸劑、藥糖劑或糊劑施加?；蛘撸鶕?jù)需要，藥物組合物可以非口服，處于用水或任何其它可藥用的液體配制的無菌溶液或懸浮液的注射劑形式。例如，本發(fā)明的活性成分可以和可藥用的載體或介質(zhì)，具體地說，無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定化劑、調(diào)味劑、賦形劑、載體(vehicle)、防腐劑、粘合劑等混合成普遍接受的藥物實踐所需的單位劑量形式。這種制備物中所含活性成分的量可以在指定的可得范圍內(nèi)實現(xiàn)合適的劑量。
可以摻混在藥片和膠囊中的添加劑的實例包括，但不僅限于，粘合劑例如明膠、玉米淀粉、黃芪膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠；賦形劑例如結(jié)晶纖維素；膨脹劑例如玉米淀粉、明膠和褐藻酸；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精；和調(diào)味劑例如薄荷、紅珠樹油(Gaultheriaadenothrix oil)和櫻桃(cherry)。藥片可以通過壓縮或成形(任選地與一種或多種制劑成分一起)制成。壓縮藥片可以通過在合適的機械內(nèi)以自由流動形式，例如粉末或顆粒，壓縮活性成分，并任選地與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑、表面活性或分散劑混合，來制備。成形藥片的制備可以通過在合適的機械內(nèi)成形用惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀化合物。藥片可以根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法包衣。任選地還可以配制藥片使活性成分在體內(nèi)緩慢地或可控地釋放。藥片的包裝可以含有供每個月服用一片的片劑。而且，當單位劑量形式是膠囊時，除了上面的成分之外，還可以進一步含有液體載體，例如油。
口服液體制備物可以處于例如水性或油性的懸浮液、溶液、乳液、糖漿或酏劑 (elixir)的形式，或者可以制備為干燥產(chǎn)品，用于在使用前用水或其它合適的載體重建。這種液體制備物可以含有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水載體(其可以包括食用油)或防腐劑。
用于腸胃外給藥的制劑包括水成或非水成無菌注射液，其可以含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑(bacteriostats)和使得制劑與預期接受者的血液等滲的溶質(zhì)；并且水成和非水成無菌懸浮液可以包含懸浮劑和增稠劑。制劑可以以單位劑量或多劑量容器形式存在，例如密封的安瓿和小瓶(vial)，并可以保存于冷凍干燥(凍干)條件下，僅需要在即將使用前添加無菌液體載體，例如鹽、注射用水?；蛘?，制劑可以被制備成用于連續(xù)灌注。臨時使用(Extemp0rane0us)的注射溶液或懸浮液可以用前述種類的無菌粉末、顆粒或藥片制備。
而且，用于注射的無菌組分可以遵循正常的適合于注射的藥物實施方法使用溶媒(例如無菌水)加以制備。生理鹽水、葡萄糖和其它等滲液體，包括輔助劑，例如 D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，也可用作注射用水溶液。這些可以和合適的增溶劑，例如醇如乙醇；多元醇(polyalcohols)如丙二醇和聚乙二醇；和非離子表面活性劑如聚山梨醇酯80 (TM)和HCO-50。
芝麻油或大豆油可以用作油質(zhì)液體，其可以和作為增溶劑的苯甲酸芐酯或苯甲醇聯(lián)用，并可以和如下物質(zhì)一起配制，例如緩沖劑如磷酸鹽緩沖劑和乙酸鈉緩沖劑；鎮(zhèn) 痛劑如鹽酸普魯卡因；增溶劑如甲醇和苯酚；和/或抗氧化劑。所制備的注射劑可以被填充到合適的安瓿中。
用于直腸給藥的制劑包括具有標準載體例如可可脂或聚乙二醇的栓劑。用于在口腔局部給藥(例如向頰或舌下)的制劑包括錠劑(lozenges)，其含有的活性成分置于增味基料(base)如蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠內(nèi)；和糖錠劑(pastilles)，其含有的活性成分置于基料如明膠、甘油、蔗糖或阿拉伯樹膠中。為了活性成分的鼻內(nèi)給藥，可以使用液體噴霧劑或可分散的粉末或者液滴的形式。液滴可以用水或非水基料制備，基料中還含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。
為了通過吸入給藥，組合物被方便地用吹藥器(insufflator)、噴霧器、加壓包裝或其它輸送氣溶膠噴霧的便利裝置給藥。加壓包裝可以包括合適的推進劑，例如二氟二氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣溶膠的場合，劑量單位可以通過提供計量輸送閥門加以確定。
或者，為了通過吸入或吹入給藥，組合物可以采用干粉組合物的形式，例如活性成分與合適粉末基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末組合物可以按照單位劑量形式處于例如膠囊、針劑、凝膠或氣泡(blister)包裝內(nèi)，并在吸入器或吹藥器的幫助下施加該粉末。
其它的劑型包括釋放治療劑的可植入裝置和貼劑(adhesive patch)。
如果期望，可以將上述制劑進行調(diào)整以適于恒定地釋放活性成分再加以采用。藥物組合物還可以含有其它活性成分，例如抗微生物劑、免疫抑制劑或防腐劑。
應當理解，除了上面具體提到的成分之外，本發(fā)明的制劑還可以包括其它在本領(lǐng)域中關(guān)于該具體劑型的傳統(tǒng)作用劑，例如適合于口服的制劑可以包括增味劑。
優(yōu)選的單位劑量制劑是含有有效劑量的每種本發(fā)明活性成分或其合適組分的制劑，它們在下文“治療C2orfl8相關(guān)疾病的方法” 一節(jié)中有敘述。
I.含有雙鏈分子的組合物
本發(fā)明提供了用于阻止細胞生長和/或治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的組合物，其包括任何上述的或者通過上述本發(fā)明篩選方法篩選出的雙鏈分子。本發(fā)明的雙鏈分子可以適用于抑制細胞生長和預防或治療C2orfl8相關(guān)疾病。
在一個實施方案中，包含本發(fā)明一種或多種雙鏈分子的組合物可以被包裹在輸送囊泡(delivery vehicle)，例如脂質(zhì)體中，載體和稀釋劑及其鹽內(nèi)用于施加給受試者，和/或可以以可藥用的劑型提供。用于輸送核酸分子的方法在下列文獻中有介紹 Akhtar S & Juliano RL.Trends Cell Biol.l992May ； 2(5) 139-44. ； Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics, ed.Akhtar, 1995 ； Maurer N, et al.， Mol Membr Biol.l999Jan-Mar ； 16(1) 129-40. ； Hofland & Huang.Handb Exp Pharmacol. 1999137 165-192。它進一步介紹了用于輸送核酸分子的一般方法(US 6,395,713和WO 199402595)。這些規(guī)程可以用于輸送幾乎任何雙鏈分子。雙鏈分子可以通過多種本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法施用給細胞，包括但不僅限于，包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，通過離子電滲，或者通過摻入到其他囊泡內(nèi)，例如生物可降解的聚合物、水凝膠、環(huán)糊精(見例如 Gonzalez H, etal.，Bioconjug Chem. 1999 Nov-Dec ； 10(6) 1068-74. ； WO 03/47518 和 WO 03/46185)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)和PLCA微球(見例如US 6,447,796 和US 2002130430)、生物可降解的納米膠囊和生物粘性的微球，或者通過蛋白質(zhì)性載體 (W020005372》。在另一個實施方案中，本發(fā)明的雙鏈分子還可以制備或者與聚乙烯亞胺及其衍生物絡合，例如聚乙烯亞胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亞胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙鏈分子如US20030077^9所述地加以制備(即基于液體的制劑)，本文引用其全部內(nèi)容作為參考。
本發(fā)明的雙鏈分子還可以和其它治療化合物一起施加給受試者，以提高整體的治療效果。使用多種化合物治療病癥可以提高有益的效果，同時降低副作用的發(fā)生。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了本發(fā)明雙鏈分子在制造用于治療或預防表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發(fā)明涉及使用可抑制細胞內(nèi) C2orfl8基因表達的雙鏈分子制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物，該分子包括彼此雜交形成雙鏈分子并且靶定SEQ ID NO 7或8的序列的有義鏈和與之互補的反義鏈。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的雙鏈核酸分子在治療或預防表達C2orfl8基因的癌癥中的用途?；蛘撸景l(fā)明進一步提供了用于制造治療表達C2orfl8 基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括制備藥物或生理可接受的載體與抑制細胞內(nèi)C2orfl8基因表達的雙鏈分子的步驟，該分子包括有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子并靶定SEQ ID NO: 7或8的序列作為活性成分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了用于制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，該方法或過程包括將活性成分與藥物或生理可接受的載體摻混的步驟，其中該活性成分是可抑制細胞內(nèi)C2orfl8基因表達的雙鏈核酸分子，該分子包括有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈核酸分子并靶定SEQ ID NO 7或8的序列。
II.包括反義核酸的組合物
相應于C2orfl8基因核苷酸序列的反義核酸可用于降低在癌細胞中被上調(diào)的基因的表達水平，并可用于抑制細胞生長和癌癥治療，因此也包含在本發(fā)明內(nèi)。反義核酸起作用的方式是通過與C2orfl8基因的核苷酸序列或與之相應的mRNA結(jié)合，抑制該基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進mRNA的降解，和/或抑制由該基因編碼的蛋白質(zhì)的表達。因此，結(jié) 果，反義核酸抑制C2orfl8蛋白在癌細胞內(nèi)發(fā)揮功能。這里，詞組“反義核酸”是指特異和靶序列雜交的核苷酸，不僅包括與靶序列完全互補的核苷酸，也包括具有一個或多個核苷酸錯配的核苷酸。例如，本發(fā)明的反義核酸包括與C2orfl8基因或其互補序列在至少15個連續(xù)核苷酸的跨度上具有至少70%或者更高，優(yōu)選地至少80%或者更高，更優(yōu)選地至少90%或者更高的同源性的多核苷酸。本領(lǐng)域已知的算法可用于確定這種同源性。
本發(fā)明的反義核酸通過與基因的DNA或mRNA結(jié)合，抑制它們的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進mRNA的降解，和抑制蛋白質(zhì)的表達，最終抑制蛋白質(zhì)發(fā)揮功能，從而對產(chǎn)生由 C2orfl8基因編碼的蛋白的細胞發(fā)揮作用。
本發(fā)明的反義核酸可以通過與合適的對核酸無活性的基料混合而制成外用制備物，例如擦劑或糊藥。
另外，如果需要，本發(fā)明的反義核酸可以通過添加賦形劑、等滲劑、增溶劑、穩(wěn)定化劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛劑等被制備成藥片、粉末、顆粒、膠囊、脂質(zhì)體膠囊、注射劑、溶液、滴鼻液和凍干劑。還可以使用負載有反義核酸的介質(zhì)(antisense-mounting medium)以增加持久性和膜滲透性。實例包括但不僅限于脂質(zhì)體、聚_L_賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、Iipofectin或它們的衍生物。這可以通過已知的方法加以制備。
本發(fā)明的反義核酸可抑制C2orfl8蛋白的表達并可用于抑制該蛋白質(zhì)的生物活性。此外，可以使用表達抑制劑，包括本發(fā)明的反義核酸，因為它們能夠抑制C2orfl8蛋白的生物活性。
本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)過修飾的寡核苷酸。例如，硫代寡核苷酸可用于為寡核苷酸提供核酸酶抗性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了本發(fā)明反義核酸在制造用于治療表達 C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物中的用途。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了本發(fā)明反義核酸在治療或預防表達 C2orfl8基因的癌癥中的用途。
或者，本發(fā)明進一步提供了用于制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將藥物或生理可接受的載體與作為活性成分的本發(fā)明反義核酸一起配制的步驟。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了用于制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括混合活性成分與藥物或生理可接受的載體的步驟，其中該活性成分是本發(fā)明的反義核酸。
III.包含抗體的組合物
在癌癥中過表達的C2orfl8基因的基因產(chǎn)物的功能可以通過施用與該基因產(chǎn)物結(jié) 合或者以其他方式抑制其功能的化合物加以抑制。這種化合物可以包括例如針對C2orfl8 多肽的抗體，該抗體可以用作細胞生長抑制劑或用于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病的藥物組合物的活性成分。
本發(fā)明涉及針對由C2orfl8基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體或抗體片段的用途。如這里所討論的，術(shù)語“抗體”是指上述意思。
抗體可以通過與多種分子，例如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)進行修飾。本發(fā)明包括此類經(jīng)過修飾的抗體。經(jīng)過修飾的抗體可以通過抗體的化學修飾而獲得。這些修飾方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
或者，用于本發(fā)明的抗體可以是嵌合抗體，具有針對C2orfl8多肽的來自非人類抗體的可變區(qū)和來自人類抗體的恒定區(qū)，或者是人源化抗體，其由來自非人類抗體的互補決定區(qū)(CDR)、框架區(qū)(FR)和來自人類抗體的恒定區(qū)構(gòu)成。這些抗體可以通過使用已知的技術(shù)加以制備。人源化可以通過用嚙齒動物的一個或多個CDR序列替代人類抗體的相應序列來實現(xiàn)(見例如Verhoeyen etal.，Science 1988，239 1534-6) 因此，這些人源化抗體是嵌合抗體，其中完整人可變區(qū)的很小一部分被替換成來自非人類物種的相應序列。
還可以使用完全人抗體，其包括人類可變區(qū)以及人類框架區(qū)和恒定區(qū)。這些抗體可以用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，體外方法涉及使用在噬菌體上展示的人類抗體片段的重組文庫(例如Hoogenboom etal.，J MolBiol 1992，227:381-8)。類似地，可以通過將人類免疫球蛋白座位引入到轉(zhuǎn)基因動物例如小鼠體內(nèi)來制備人類抗體，這樣的動物中內(nèi)源免疫球蛋白基因被部分或者完全失活。該方法在例如下列美國專利中有介紹Nos.6,150,584 ； 5,545,807 ； 5,545,806 ； 5,569,825 ； 5,625,126 ； 5,633,425 ；和 5,661,016。
當所得的抗體要施加給人類(抗體治療)時，優(yōu)選地使用人類抗體或人源化抗體以減少免疫原性。
如上所得的抗體可以被純化成均質(zhì)。例如，抗體的分離和純化可以根據(jù)用于一般蛋白的分離和純化方法來實施。例如，抗體可以通過適當?shù)剡x擇和組合使用柱色譜加以分離和純化，例如親和色譜、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電夕永、等電聚焦等(Antibodies A LaboratoryManuaLEd Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)),但是并不僅限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。可以使用的蛋白A柱的實例包括例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F. (Pharmacia)。
除了親和之外，色譜的實例包括例如離子交換色譜、疏水色譜、凝膠過濾、反才目色譜、吸附色譜等(Strategies for Protein Purification andCharacterization A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。色譜程序可以通過液相色譜，例如HPLC和FPLC實施。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了本發(fā)明抗體在制造用于治療表達C2orfl8 基因的癌癥的藥物組合物中的用途。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了用于治療或預防表達C2orfl8基因的癌癥的本發(fā)明抗體?；蛘?，本發(fā)明進一步提供了制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將藥物或生理可接受的載體與作為活性成分的本發(fā)明抗體配制的步驟。
在另一個實施方案中，本發(fā)明還提供了制造用于治療表達C2orfl8基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將活性成分與藥物或生理可接受的載體混合的步驟，其中該活性成分是本發(fā)明的抗體。
抑制細胞牛長的方法
通過siRNA抑制胰腺癌細胞系中的內(nèi)源C2orfl8可導致過表達C2orfl8的細胞的生長被顯著抑制，這提示了 C2orfl8在保持這些細胞生存力中的至關(guān)重要的作用。因此，本發(fā)明涉及通過抑制C2orfl8的表達和/或C2orfl8蛋白的活性而抑制細胞生長。C2orfl8 的表達是被，例如，特異靶定C2orfl8基因的雙鏈分子所抑制的。C2orfl8靶序列包括例如SEQ ID NO: 7或8的核苷酸。在本發(fā)明中，細胞的特征是過表達C2orfl8，例如癌細胞，如胰腺癌細胞，具體地PDAC細胞。
這些修飾方法可以離體或者在體外實施(例如通過將細胞與作用劑一起培養(yǎng))，或者在體內(nèi)實施(例如通過向受試者施加作用劑)。這些方法涉及施加蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì) 的組合，或者核酸分子，或者核酸分子的組合，作為治療手段來對抗C2orfl8基因的異常表達或者其基因產(chǎn)物的異常活性。
因此，可用于本發(fā)明內(nèi)容的作用劑包括例如
(i)由C2orfl8基因編碼的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；
(ii)C2orfl8基因或基因產(chǎn)物的抗體或其片段；
(iii)反義核酸或“功能異常(dysfunctional)，，的核酸(即由于C2orfl8基因核酸內(nèi)的異源插入)；(siRNA)
(iv)雙鏈分子，例如小干擾RNA(SiRNA)；或
(ν)調(diào)節(jié)劑(即可改變C2orfl8多肽與其結(jié)合配偶體之間相互作用的抑制劑、拮抗劑)。
利用功能異常反義分子通過同源重組“敲除”多肽的內(nèi)源功能(見例如 Capecchi, Science 1989, 244 128892)。
水平增加可以通過如下的方法容易地檢測到定量細胞內(nèi)的肽和/或RNA，并在體外測定RNA或肽的水平、結(jié)構(gòu)和/或所表達肽的活性(或表達被改變的基因的 mRNA)。本領(lǐng)域眾所周知的方法包括，但不僅限于，免疫測定(例如通過Western印跡分析、免疫沉淀隨后進行十二烷基硫酸鈉6DS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學等)、 RT-PCR和/或雜交測定以檢測mRNA的表達(例如Northern測定、點印跡、原位雜交等 ο
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以使用通過本發(fā)明篩選到的作用劑?？梢允褂帽绢I(lǐng) 域技術(shù)人員眾所周知的方法施加這些作用劑。如果所述作用劑可以由DNA編碼，則可以將DNA插入到用于表達該DNA的載體內(nèi)，并將該載體施加給細胞。為了將雙鏈分子的載體引入到細胞內(nèi)，可以使用轉(zhuǎn)染增強劑。FuGENE6 (Roche diagnostics)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Oligofectamine (Invitrogen),禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可用作轉(zhuǎn)染增強劑。
治療C2orfl8相關(guān)疾病的方法
治療、減輕或預防C2orfl8相關(guān)疾病包括任何下列步驟例如手術(shù)除去過表達 C2orfl8的細胞、抑制癌性細胞的生長、退化或萎縮腫瘤、誘導緩解或抑制癌癥發(fā)生。 C2orfl8相關(guān)疾病的有效治療可降低患有C2orfl8相關(guān)疾病的個體的死亡率，改善其預后，降低血液中腫瘤標志的水平，和減輕與C2orfl8相關(guān)疾病相伴的可檢測癥狀。
通過siRNA敲低過表達C2orfl8基因的細胞系內(nèi)的內(nèi)源C2orfl8可導致細胞生長被顯著抑制，提示C2orfl8在維持這些細胞生存能力方面起著至關(guān)重要的作用。因此，本發(fā)明涉及通過抑制C2orfl8的表達和/或C2orfl8蛋白的活性來治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病。C2orfl8的表達被，例如，特異靶定C2orfl8基因的雙鏈分子所抑制。C2orfl8 靶序列包括例如SEQ IDNO 7或8的核苷酸。而且，C2orfl8的活性被抗_C2orfl8抗體或肽模擬物所抑制。在本發(fā)明中，C2orfl8相關(guān)疾病的特征是過表達C2orfl8，例如癌癥如胰腺癌，具體地PDAC。
在本發(fā)明中，抑制性核酸可以作為裸核酸、或者與輸送試劑結(jié)合、或者作為表達該抑制核酸的重組質(zhì)?；虿《据d體施用給受試者。
用于和本發(fā)明抑制核酸聯(lián)合施用的合適的輸送試劑包括Miras TnmsitTKO親脂試劑；Iipofectin ； Iipofectamine ； cellfectin ；或聚陽離子(例如聚賴氨酸)，或脂質(zhì)體。優(yōu)選的輸送試劑是脂質(zhì)體。
脂質(zhì)體可以輔助將抑制性核酸輸送到特定的組織，例如視網(wǎng)膜或腫瘤組織，還可以增加抑制性核酸的血液半衰期。適用于本發(fā)明的脂質(zhì)體用常規(guī)的囊泡形成性脂質(zhì)形成，此類脂質(zhì)一般包括中性或帶負電荷的磷脂和固醇例如膽固醇。一般對如下的因素的考慮指導脂質(zhì)的選擇，例如期望的脂質(zhì)體大小和脂質(zhì)體在血流中的半衰期。已知有多種方法用于制備脂質(zhì)體，例如在下列文獻中所述Szoka et al.，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 467 ；和美國專利Nos.4,235,871 ； 4,501,728 ； 4,837,028 ；和5,019,369，本文引用其全部內(nèi)容作為參考。
優(yōu)選地，包裹本發(fā)明抑制性核酸的脂質(zhì)體包括配體分子，其能夠?qū)⒅|(zhì)體輸送到癌癥部位。與腫瘤細胞中普遍存在的受體結(jié)合的配體，例如與腫瘤抗原結(jié)合的單克隆抗體，是優(yōu)選的。
特別優(yōu)選地，包裹本發(fā)明抑制核酸的脂質(zhì)體被修飾，從而避免被單核巨噬細胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，例如通過具有與結(jié)構(gòu)表面結(jié)合的調(diào)理作用抑制模塊。在一個實施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可以同時包括調(diào)理作用抑制模塊和配體。
用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制模塊通常是與脂質(zhì)體膜結(jié)合的大型親水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當調(diào)理作用抑制模塊化學地或物理地搭接在膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質(zhì)的活性基團直接結(jié)合，則調(diào)理作用抑制模塊與脂質(zhì)體膜“結(jié)合”。這些調(diào)理作用抑制性親水性聚合物形成保護性表層，顯著地減少單核巨噬細胞系統(tǒng)(“MMS” )和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(” RES” ) 對脂質(zhì)體的攝入；在例如美國專利第4,920,016號中對此有記載，后者的全部公開內(nèi)容援引并入本說明書。因此，與未修飾的脂質(zhì)體相比，被調(diào)理作用抑制模塊修飾過的脂質(zhì)體能夠保留在血液循環(huán)中的時間顯著更長。出于以上理由，上述脂質(zhì)體有時也被稱為“隱形”(stealth)脂質(zhì)體。
已知隱形脂質(zhì)體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統(tǒng)供給的組織中。因此，在以這樣的微血管系統(tǒng)缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質(zhì)體會高效率地蓄積。參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18:6949-53。此外，由于 RES的攝入的減少，防止隱形脂質(zhì)體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制模塊修飾的本發(fā)明的脂質(zhì)體能夠?qū)⒈景l(fā)明的雙鏈核酸分子輸送至腫瘤細胞。
適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制模塊優(yōu)選為分子量約500 約40,000道爾頓、更優(yōu)選約2,000 約20,000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺(polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalcohols)，諸如化學結(jié)合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂，諸如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚體也是適合的。此外，抑制調(diào)理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調(diào)理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通過與碳酸的衍生物反應而連接了羧基的羧基化多糖類或寡糖。
優(yōu)選地，調(diào)理作用抑制模塊是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時稱作“PEG化脂質(zhì)體”。
調(diào)理作用抑制模塊可以通過許多公知技術(shù)中的任何一種結(jié)合到脂質(zhì)體膜上。例如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結(jié) 合，然后再結(jié)合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na(CN)BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水的30 12比例混合物。
上文討論了表達本發(fā)明的雙鏈核酸分子的載體。這樣的表達至少一種本發(fā)明的雙鏈核酸分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑組合施用，所述合適的投遞試劑包括 Miras Transit LTl 親脂性試劑、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin> 聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質(zhì)體。將表達本發(fā)明的抑制性核酸分子的重組病毒載體輸送到患者的癌癥區(qū)域的方法在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的抑制性核酸可以通過任何適合于將抑制性核酸輸送到癌癥部位的方法施加給受試者。例如，抑制核酸可以通過基因槍、電穿孔施用，或者通過合適的腸胃外或腸道(enteral)途徑施用。合適的腸道給藥途徑包括口服、直腸或鼻內(nèi)給藥。
合適的非消化道施用途徑包括靜脈內(nèi)施用(例如靜脈內(nèi)推注、靜脈內(nèi)輸注、動脈內(nèi)推注、動脈內(nèi)輸注和針對血管網(wǎng)絡的導管滴注)，組織周圍和組織內(nèi)注射(例如腫瘤周圍和腫瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施用到癌癥區(qū)域或其附近，例如借助導管或其它放置裝置 (例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的視網(wǎng)膜片劑(retinal pellet)或栓劑或植入物)，和吸入。優(yōu)選通過注射或輸注將雙鏈核酸分子或載體施用到癌癥部位或其附近。
本發(fā)明的抑制性核酸可以以單劑量或者多劑量施用。當本發(fā)明的抑制性核酸通過輸注施用時，輸注可以是單個持續(xù)劑量或者可以通過多次輸注輸送。優(yōu)選地將作用劑直接注射到位于癌部位處或其附近的組織內(nèi)。尤其優(yōu)選地，將作用劑多次注射到癌部位處或附近的組織內(nèi)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以容易地確定用于將本發(fā)明的抑制性核酸施用于給定受試者的合適劑量方案。例如，抑制性核酸可以一次性地，例如作為單次注射或沉積，施用給受試者癌癥部位處或其附近?；蛘?，抑制性核酸可以每天一次或兩次施用給受試者，歷時大約3-大約觀天，更優(yōu)選地大約7-大約10天。在優(yōu)選的劑量方案中，抑制性核酸每天一次注射到癌癥部位處或其附近，歷時7天。當劑量方案涉及多次施用時，應當理解施用給受試者的抑制性核酸的有效量可以包括在整個劑量方案期間施用的抑制性核酸的總量。
分別以基因和基因產(chǎn)物的表達水平或生物活性增加(相對于沒有罹患該疾病或病癥的受試者)為特征的疾病或病癥可以用拮抗(即減少或抑制)該過表達基因的活性的治療方法進行治療。拮抗活性的治療方法可以治療性或預防性施用。
因此，可以在本發(fā)明內(nèi)容中使用的治療方法包括例如
(i)由C2orfl8基因編碼的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；
(ii)C2orfl8基因或基因產(chǎn)物的抗體或其片段；
(iii)反義核酸或“功能異常(dysfunctional)，，的核酸(即由于在該過表達基因核酸內(nèi)的異源插入)；(SiRNA)
(iv)雙鏈分子，例如小干擾RNA(SiRNA)；或
(ν)調(diào)節(jié)劑(即可改變過表達多肽與其結(jié)合配偶之間相互作用的抑制劑、拮抗劑)。
功能異常反義分子用于通過同源重組“敲除”多肽的內(nèi)源功能(見例如 Capecchi, Science 1989, 244 128892)。
水平增加可以通過如下的方法容易地檢測到定量肽和/或RNA，通過獲得受試者組織樣品(例如來自活組織檢查)并在體外測定其中RNA或肽的水平、結(jié)構(gòu)和/或所表達肽的活性(或表達被改變的基因的mRNA)。本領(lǐng)域眾所周知的方法包括，但不限于，免疫測定(例如通過Western印跡分析、免疫沉淀隨后進行十二烷基硫酸鈉6DS) 聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學等)、和/或雜交試驗以檢測mRNA的表達(例如 Northern測定、點印跡、原位雜交等)。
預防給藥發(fā)生在疾病明顯臨床癥狀顯現(xiàn)之前，從而使疾病或病癥被防止或者進程延遲。在本發(fā)明的內(nèi)容中，預防是任何可降低疾病的病死率負擔或發(fā)病率的活動。預防可以在一級、二級和三級預防水平上發(fā)生。一級預防避免疾病的發(fā)生，二級和三級水平的預防涵蓋旨在防止疾病進展和癥狀出現(xiàn)，以及通過恢復功能降低已經(jīng)建立的疾病的負面影響和減少疾病相關(guān)并發(fā)癥的活性。因此，本發(fā)明包括廣泛的旨在減輕C2orfl8相關(guān)疾病，例如癌癥如胰腺癌，具體地說PDAC，的嚴重程度的治療方法。
本發(fā)明的治療方法可以包括使細胞與可調(diào)節(jié)C2orfl8基因產(chǎn)物一種或多種活性的作用劑接觸的步驟?？烧{(diào)節(jié)蛋白活性的作用劑實例包括，但不僅限于，核酸、蛋白質(zhì)、這些蛋白的天然存在的同源配體、肽、肽模擬物和其它小分子。
因此本發(fā)明提供了通過降低C2orfl8基因表達或基因產(chǎn)物活性用于治療或減輕受試者體內(nèi)癌癥癥狀或者預防癌癥的方法。本方法具體適合于治療或預防C2orfl8相關(guān)疾病，例如癌癥如胰腺癌，具體地說PDAC。
合適的治療劑可以預防性或治療性施用給罹患或者具有發(fā)生C2orfl8相關(guān)疾病的危險(易感)的受試者。這些受試者可以通過使用標準的臨床方法加以鑒定，或者通過檢測C2orfl8基因的異常表達水平(“上調(diào)”或“過表達”)或基因產(chǎn)物的異?；钚约右澡b定。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，通過本方法篩選得到的作用劑可以用于治療或預防癌癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可以用于施用這些作用劑給受試者，例如作為動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)皮注射或者作為鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)或口服給藥。如果所述作用劑由DNA編碼，則可以將DNA插入到用于基因治療的載體內(nèi)，并將載體施用給受試者以實施治療。為了將雙鏈分子的載體引入到細胞內(nèi)，可以使用轉(zhuǎn)染增強劑。FuGENE6 (Rochediagnostics)，Lipofectamine 2000 (Invitrogen)， Oligofectamine (Invitrogen)禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)可以有用地作為轉(zhuǎn)染增強劑。
用于給藥的劑量和方法隨著待治療患者的體重、年齡、性別、癥狀、病癥和給藥方法而不同；然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以常規(guī)地選擇合適的劑量和給藥方法。
例如，盡管與C2orfl8多肽結(jié)合并調(diào)節(jié)多肽活性的作用劑的劑量取決于前述的各種因素，但是當正常成年人(60kg體重)口服時，劑量一般為每天大約O.lmg-大約 IOOmg,優(yōu)選地每天大約l.Omg-大約50mg，更優(yōu)選地每天大約l.Omg-大約20mg，。
當以注射的形式向正常成年人(60kg體重)腸胃外施用作用劑時，盡管不同的患者、靶器官、癥狀和給藥方法會出現(xiàn)一些差異，但是方便的是靜脈內(nèi)注射每天大約 O.Olmg-大約30mg，優(yōu)選地每天大約O.lmg-大約20mg，更優(yōu)選地每天大約O.lmg-大約 IOmg的劑量。在其它動物的情況下，合適的劑量可以同歸轉(zhuǎn)化成60kg體重加以計算。
類似地，本發(fā)明的藥物組合物可以用于治療或預防癌癥。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可用于將組合物施用給受試者，例如作為動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或者經(jīng)皮注射，或者作為鼻內(nèi)、經(jīng)支氣管、肌肉內(nèi)或經(jīng)口給藥。
對于每種前述病癥，組合物，例如多肽和有機化合物，可以經(jīng)口或者通過注射給藥，劑量范圍為每天大約0.1-大約250mg/kg。成年人的計量范圍一般為大約5mg-大約17.5g/日，優(yōu)選地大約5mg-大約IOg/日，最優(yōu)選地大約IOOmg-大約3g/日。藥片或其它單位劑量形式的以離散單位提供的藥物可以方便地含有在這種劑量下或者作為多次劑量下有效的量，例如含有大約5mg_大約500mg，通常大約IOOmg-大約500mg的單位。
所用的劑量取決于多種因素，包括受試者的年齡、體重和性別，待治療的確切病癥和其它嚴重程度。同時，給藥的途徑也隨著病癥及其嚴重程度而不同。在任何情況下，合適的和最佳的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過考慮上述因素常規(guī)地計算出來。
具體地，針對C2orfl8基因的反義核酸可以通過直接施用到患病部位或者通過注射到血管內(nèi)從而到達患病部位而施用給患者。
本發(fā)明反義核酸衍生物的劑量可以根據(jù)患者的病癥和所用的期望量而合適地進行調(diào)節(jié)。例如，可以施用的劑量范圍是0.1-100mg/kg，優(yōu)選地0.1-50mg/kg。
[發(fā)明模式1]
下面，本發(fā)明將參考實施例進行更加詳細的介紹。然而，下面的材料、方法和實施例僅僅是舉例說明本發(fā)明的多個方面，并不意圖對本發(fā)明的范圍進行限制。因此，與這里所述相似或等價的方法和材料也可以用于實施或測試本發(fā)明。
一般方法
1.細胞系和臨床樣品
PDAC 細胞系 MIA_PaCa2 和 Panc-I，禾PNIH3T3，HEK-293T 和 COS7 細胞購自 ATCC (美國典型培養(yǎng)物保藏中心)。PDAC細胞系KLM-1，PK-59，PK-45P, SUIT-2 和PK-I由東北大學(仙臺，日本)生物醫(yī)學研究細胞資源中心提供。所有的Panc-1， KLM-1, PK-59, PK-45P, SUIT-2 禾Π PK-I 細胞系均在 RPMI-1640 (Invitrogen， Carlsbad, CA)中生長，所有的 COS-7，NIH3T3, HEK-293,禾Π MIA_PaCa2 細胞系均在達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM) (Invitrogen)中生長。所有細胞系均在補充有 10%胎牛血清(FBS)和抗生素/抗真菌劑溶液的合適培養(yǎng)基中單層生長，并且保持在 37°C含有5% C02的氣氛中。冷凍的并且石蠟包埋的PDAC組織從手術(shù)樣品獲得，手術(shù) 樣品是在獲得了合適的知情同意后在大阪癌癥和心血管疾病醫(yī)學中心切除的。本研究使用這些臨床樣品得到了東京大學醫(yī)學科學研究所IRB和大阪癌癥與心血管疾病醫(yī)學中心 IRB的批準。
2.半定量 RT-PCR
來自胰腺癌組織的PDAC細胞和正常導管上皮細胞的純化如前所述(Nakamura T，et al.0ncogene.2004 Mar 25 ； 23(13) 2385-400.)。對來自純化 PDAC 細胞和正常胰腺導管上皮細胞的RNA用基于T7的體外轉(zhuǎn)錄(Epicentre Technologies, Madison, WI) 進行兩輪RNA擴增，合成單鏈cDNA。用Trizol試劑(Invitrogen)根據(jù)制造商推薦的程序提取來自人類胰腺癌細胞系的總RNA。所提取的RNA用DNase I (Roche Diagnostic, Basel, Switzerland)處理，并用 oligcKdT)引物和 Superscript II 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。制備每種單鏈cDNA的合適稀釋物用于隨后的PCR擴增，通過監(jiān)視 α -微管蛋白(TUBA)作為定量對照物。使用如下的引物序列
5' -AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3‘ 6EQIDN0:1)禾口
5' -CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3‘ 6EQ ID NO 2)用于 TUBA，
5 ‘ -GGTAGCTCAGTCATAAAACACCG-3 ‘ (SEQ ID NO 3)禾口
5 ‘ -GTCTCTCCATCATCCTCACTGTC-3 ‘ (SEQ ID NO 4)用于 C2orfl8(NM_017877)。
所有的反應涉及在 GeneAmp PCR system 9700 (ΡΕ Applied Biosystems, Foster,CA)上進行最初94°C變性2η ι，隨后經(jīng)過23個循環(huán)(對于TUBA)或28個循環(huán)(對于 C2orfl8)94°C 30s, 55°C 30s,和 72°C 30s。
3.Northern 印跡分析
用Trizol試劑(Invitrogen)從14個胰腺癌細胞系提取總RNA，并進行Northern 印跡分析。用DNase I (Nippon Gene)處理后，用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare， Piscataway, NJ)根據(jù)制造商的方案純化mRNA。取1微克來自胰腺癌細胞的每種mRNA 以及從正常成人心臟、肺、肝臟、腎臟、骨髓和胰腺分離的mRNA(BD Biosciences，Palo Alto, CA)在變性瓊脂糖凝膠上進行分析，并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。將該癌癥膜和人多組織印跡(Clontech，PaloAlto，CA)與 32P-標記的 C2orf 18 cDNA 雜交 16 小時，其中 32P-標記的 C2orfl8cDNA 是用 Afcga Label 試劑盒(GE Healthcare)標記的。用引物 5 ‘ -GGTAG CTCAGTCATAAAACACCG-3 ‘ 6EQ ID NO 3)和 5 ‘ —GTCTCTCCATCATCCTCACTGT C-3 ‘ (SEQ ID NO 4)制備C2orfl8 cDNA的-個232bp PCR產(chǎn)物作為探針。預雜交、雜交和清洗的實施按照制造商的使用說明。印跡在-80°C放射自顯影10天。
4.C2orf_a,器側(cè)一料口免趣織、仆岸械
由Sigma-Aldrich日本(石狩，日本)制備了分別對應于C2orfl8蛋白(Genbank 登錄號NP_060347，SEQ ID NO 12)密碼子70-86和密碼子351-371區(qū)域的兩條肽(CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)禾口 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQID NO 6),用它們的混合物免疫兩只家兔。免疫血清在裝填有可偶聯(lián)每種肽抗原的 Affi-Gel 10活化親和介質(zhì)(Bio-Rad Laboratories，Hercules, CA)的親和柱上根據(jù)基本的方法學進行純化。來自PDAC的常規(guī)組織切片從手術(shù)樣品獲得，手術(shù)樣品是在Osaka癌癥與心血管疾病醫(yī)學中心在獲得了合適的知情同意的前提下切除的。將切片脫蠟，并在 pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中在108°C下高溫滅菌15η ι。在過氧化物酶阻斷試劑(Dako Cytomation, Carpinteria, CA)中溫育30分鐘以滅活內(nèi)源過氧化物酶活性。用胎牛血清溫育封閉之后，將切片用兔抗_C20rfl8多克隆抗體(1 1500稀釋)在室溫下溫育1小時。用PBS清洗后，用過氧化物酶標記的抗兔免疫球蛋白(Envision kit，Dako Cytomation)進行免疫檢測。最后，反應物用3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺(DakoCytomation)顯影。用蘇木精進行復染。
5.C2orfl8特異的小干擾RNA(siRNA)表汰構(gòu)津體
為了下調(diào)PDAC細胞內(nèi)的內(nèi)源C2orfl8表達，使用psiU6BX3.0載體表達針對靶基因的短發(fā)夾RNA，如前所述(Taniuchi K，et al.Cancer Res.2005 Jan 1 ； 65(1) 105-12.)。U6啟動子被克隆到基因特異序列的上游(來自靶轉(zhuǎn)錄本的19-nt序列與該序列的反向互補物被一個短接頭TTCAAGAGA分開)，以 5個胸腺嘧啶作為終止信號，并有一個neo盒子用于遺傳霉素(Invi-trogen)篩選。C2orfl8 的靶序列是 5 ‘ -GGAGCACAGCTTCCAGCAT-3 ‘ (SEQID NO 7) (#196)，5 ‘ -GCACGACAGTCAGCACAAG-3 ‘ (SEQ ID NO 8) (#574)和 5 ‘ -GTGACTTCCTCTTTATGGA-3 ‘ (SEQ ID NO 9) (#3254)，陰性對照的靶序列是 5' -GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 ‘ 6EQ ID NO 10) (siEGFP)。將人 PDAC 細胞系，MIA_PaCa2和Panc-I細胞，涂布在ΙΟ-cm平板上，并分別用#196，#574，#32 或siEGFP siRNA表達載體用FuGENE6 (Roche)根據(jù)制造商的使用說明進行轉(zhuǎn)染。細胞用 0.8mg/ml (用于 MIA_Paca2)，或 1.0mg/ml (用于 Panc-Ι)遺傳霉素(Invitrogen)進行篩選。在轉(zhuǎn)染7天后收集細胞，通過用上述引物進行則RT-PCR對C2orfl8的敲低效果進行分析。在含有遺傳霉素的合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天后，將細胞用100%甲醇固定，用 0.1%結(jié)晶紫-H20染色，進行集落形成測定。
在3- ，5-二甲基-2-噻唑)_2，5_ 二苯基溴化四唑(MTT)測定中，在轉(zhuǎn)染 11天后，用細胞計數(shù)試劑盒_8(DOJINDO，熊本，日本)測量細胞存活能力。用酶標儀 550 (Bio-Rad)測量490nm吸光度，以630nm吸收作為參考。
siRNA 序列
[表1]
權(quán)利要求
1.一種檢測或診斷受試者中癌癥的方法，包括確定受試者來源的生物樣品中C2orfl8 的測試表達水平的步驟，其中所述水平與C2orfl8正常對照水平相比的增加表明所述受試者罹患癌癥或者具有發(fā)生癌癥的危險，其中C2orfl8的測試表達水平通過選自下組的任何一種方法確定(a)檢測C2orfl8 的 mRNA，(b)檢測由C2orfl8編碼的蛋白，和(C)檢測由C2orfl8編碼的蛋白的生物活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述增加對應于比所述正常對照水平高至少10%的測試 C2orfl8表達水平。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
4.權(quán)利要求1的方法，其中通過檢測C2orfl8探針與所述受試者來源生物樣品的基因轉(zhuǎn)錄本的雜交來確定C2orfl8表達水平。
5.權(quán)利要求1的方法，其中通過檢測針對由C2orfl8基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體的結(jié)合來確定C2orfl8表達水平。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗體識別由氨基酸序列 CRAAGQSDSSVDPQQPF (SEQ ID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)構(gòu)成的C2orfl8表位。
7.權(quán)利要求1的方法，其中受試者來源的生物樣品是活組織檢查。
8.一種篩選用于治療或預防癌癥的候選作用劑或能夠抑制癌細胞生長的C2orfl8多肽激動劑或拮抗劑的候選物的方法，所述方法包括如下步驟a)使測試作用劑與由C2orfl8編碼的多肽接觸；b)檢測所述多肽與所述測試作用劑之間的結(jié)合活性；和c)選擇結(jié)合該多肽的測試作用劑。
9.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選作用劑的方法，所述方法包括如下步驟a)使測試作用劑與表達C2orfl8的細胞接觸；b)檢測步驟a)中細胞內(nèi)的C2orfl8表達水平；和c)選擇與不存在該作用劑時檢測到的C2orfl8的表達水平相比，降低步驟a)的細胞中C2orfl8的表達水平的測試作用劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述細胞包括胰腺癌細胞。
11.一種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選化合物的方法，所述方法包括如下步驟a)使測試作用劑與由C2orfl8編碼的多肽接觸；b)檢測步驟a)的多肽的生物活性；和c)選擇與不存在該測試作用劑時檢測到的生物活性相比，抑制步驟a)的多肽的生物活性的測試作用劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該生物活性是細胞增殖活性。
13.—種篩選用于治療或預防癌癥或抑制癌細胞生長的候選作用劑的方法，所述方法包括如下步驟a)使測試作用劑與引入了如下載體的細胞接觸，該載體包括C2orfl8基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) 區(qū)和在所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)控制下表達的報告基因；b)檢測所述報告基因在步驟a)的細胞內(nèi)的表達或活性水平；和c)選擇與不存在該測試作用劑時的水平相比，降低所述報告基因在步驟a)的細胞中的表達或活性水平的測試作用劑。
14.權(quán)利要求8，9，10或13中任一項的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
15.一種鑒定可抑制C2orfl8與ANT2之間結(jié)合的作用劑的方法，所述方法包括如下步驟a)使選自下組的第一多肽i)包含氨基酸序列SEQID NO 12的多肽；ii)包含氨基酸序列SEQID NO : 12的多肽，其中添加、替換、刪除或插入了一個或多個氨基酸，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO : 12組成的多肽等價的對 ANT2的結(jié)合活性；iii)包含與由氨基酸序列SEQID NO 12構(gòu)成的多肽具有至少大約80%同源性的氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQID NO: 12構(gòu)成的多肽等價的對ANT2的結(jié)合活性；和iv)由在嚴格條件下與由核苷酸序列SEQID NO: 11構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO 12組成的多肽等價的對 ANT2的結(jié)合活性；在作用劑的存在下與選自下組的第二多肽接觸i)包含氨基酸序列SEQID NO 26的多肽；ii)包含氨基酸序列SEQID NO : 26的多肽，其中添加、替換、刪除或插入了一個或多個氨基酸，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO : 26構(gòu)成的多肽等價的對 C2orfl8的結(jié)合活性；iii)包含與由氨基酸序列SEQID NO 26構(gòu)成的多肽具有至少大約80%同源性的氨基酸序列的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQID NO: 26構(gòu)成的多肽等價的對C2orfl8的結(jié)合活性；iv)由在嚴格條件下與由核苷酸序列SEQID NO: 25構(gòu)成的多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽，條件是該多肽具有與由氨基酸序列SEQ IDNO 26構(gòu)成的多肽等價的對 C2orfl8的結(jié)合活性；b)檢測所述第一多肽與第二多肽之間的結(jié)合水平；c)比較所述第一和第二多肽的結(jié)合水平與不存在該作用劑時檢測到的結(jié)合水平；和d)選擇降低所述第一和第二多肽間結(jié)合水平的作用劑。
16.一種抑制受試者中癌細胞生長的方法，包括向所述受試者施用雙鏈分子的步驟，其中所述雙鏈分子降低C2orfl8的表達水平。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述雙鏈分子包含C2orfl8的有義核酸和反義核酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中該雙鏈分子包括相應于由SEQID NO 7或8構(gòu)成的序列的核苷酸序列作為靶序列。
19.權(quán)利要求18的方法，所述雙鏈分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是相應于由SEQIDNO : 7或8構(gòu)成的序列的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，而[A']是由[A]的互補序列構(gòu)成的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求16的方法，其中將所述雙鏈分子與轉(zhuǎn)染增強劑一起施用給受試者。
21.權(quán)利要求16的方法，其中所述癌癥是胰腺癌。
22.一種用于治療或預防癌癥的組合物，所述組合物包括藥學有效量的針對C2orfl8 的雙鏈分子作為活性成分，和可藥用的載體。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中該雙鏈分子包括由SEQID NO 7或8構(gòu)成的核苷酸序列作為靶序列。
24.權(quán)利要求22的組合物，其中該雙鏈分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中 [A]是相應于核苷酸序列SEQ ID NO 7或8的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23 個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。
25.一種用于治療或預防癌癥的組合物，包括藥學有效量的編碼針對C2orfl8的雙鏈分子的載體作為活性成分，和可藥用載體。
26.權(quán)利要求22或25的組合物，其中所述癌癥是胰腺癌。
27.—種雙鏈分子，包括有義鏈和反義鏈，其中該有義鏈包含相應于由SEQID NO: 7或8構(gòu)成的靶序列的核苷酸序列，并且其中該反義鏈包含與所述有義鏈互補的核苷酸序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈分子，并且其中所述雙鏈分子在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內(nèi)時抑制所述基因的表達。
28.權(quán)利要求27的雙鏈分子，其中所述有義鏈的長度為大約19個-大約25個核苷酸。
29.權(quán)利要求28的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子是單個核苷酸轉(zhuǎn)錄本，其包含通過單鏈核苷酸序列連接的有義鏈和反義鏈。
30.權(quán)利要求29的雙鏈分子，其中所述雙鏈分子具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中[A]是由SEQ ID NO: 7或8構(gòu)成的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列，而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。
31.一種載體，包括含有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個或二者，其中所述有義鏈核酸包含核苷酸序列SEQIDNO : 7或8，并且所述反義鏈核酸包含與所述有義鏈互補的序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄本彼此雜交形成雙鏈分子，并且其中所述載體在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內(nèi)時抑制細胞增殖。
32.載體，包括含有有義鏈核酸和反義鏈核酸的多核苷酸的組合中的任一個，其中所述有義鏈核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO : 7或8，并且所述反義鏈核酸包含與所述有義鏈互補的序列，其中所述有義鏈和所述反義鏈的轉(zhuǎn)錄本彼此雜交形成雙鏈分子，并且其中所述載體在被引入到表達C2orfl8基因的細胞內(nèi)時抑制細胞增殖。
33.權(quán)利要求31的載體，其中所述轉(zhuǎn)錄本進一步包含連接所述有義鏈和所述反義鏈的單鏈核苷酸序列。
34.權(quán)利要求33的載體，其中所述多核苷酸具有通式5'-[A]-[B]-[A' ]-3'，其中 [A]是由SEQ ID NO : 7或8構(gòu)成的核苷酸序列，[B]是由大約3個到大約23個核苷酸構(gòu) 成的核苷酸序列，而[A']是與[A]互補的核苷酸序列。
35.一種與C2orfl8蛋白結(jié)合的抗體。
36.權(quán)利要求35的抗體，其中該抗體識別由氨基酸序列CRAAGQSDS SVDPQQPF (SFQ ID NO 5)禾口 / 或 AEESEQERLLGGTRTPINDAS (SEQ ID NO 6)構(gòu)成的C2orfl8表位。
37.一種用于檢測受試者體內(nèi)的癌癥的作用劑，其包括權(quán)利要求35的抗體。
全文摘要
本文描述了用于檢測或診斷發(fā)生癌癥(特別是胰腺癌)的傾向的客觀方法。在一個實施方案中，該診斷方法涉及利用抗-C2orf18抗體確定C2orf18表達水平的步驟。本發(fā)明進一步提供了篩選可用于治療C2orf18相關(guān)疾病(例如癌癥，如胰腺癌)的治療劑的方法，抑制細胞生長和治療或減輕其癥狀的方法。本發(fā)明還提供產(chǎn)品，例如多核苷酸、多肽、和載體雙鏈分子、抗體、載體和由它們構(gòu)成的組合物。
文檔編號G01N33/15GK102026672SQ20098011719
公開日2011年4月20日申請日期2009年3月10日優(yōu)先權(quán)日2008年3月12日
發(fā)明者中川英刀, 中村佑輔, 中鶴修一申請人:腫瘤療法科學股份有限公司

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該技術(shù)已申請專利。僅供學習研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：中村佑輔;中川英刀;中鶴修一
技術(shù)所有人：腫瘤療法科學股份有限公司
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