專利名稱：質(zhì)譜分析的制作方法
質(zhì)譜分析本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法檢驗(yàn)靶分析物，特別是生物分子，例如核酸和蛋白質(zhì)的方 法。具體地說，本發(fā)明涉及利用同量異序質(zhì)量標(biāo)簽(isobaric mass labels)的多重串聯(lián)質(zhì) 譜法。本發(fā)明還涉及檢驗(yàn)一個或多個靶分析物的質(zhì)譜裝置。本領(lǐng)域已知標(biāo)記感興趣分子的各種方法，包括放射性原子、熒光染料、發(fā)光試劑、 電子捕獲試劑和光吸收染料。這標(biāo)記系統(tǒng)各自具有的特征使其適于某些應(yīng)用，而不適于其 它領(lǐng)域。最近，質(zhì)譜法領(lǐng)域開發(fā)了檢測可切割地連接于它們相關(guān)的感興趣分子的標(biāo)記物的 方法。對于諸如核酸分析等許多應(yīng)用，可從間接標(biāo)記測定分析物的結(jié)構(gòu)。這對于應(yīng)用質(zhì) 譜法尤其有利，因?yàn)閺?fù)雜的生物分子，例如DNA具有復(fù)雜的質(zhì)譜且檢測靈敏度較低。間接 檢測意味著可利用相關(guān)標(biāo)記分子鑒定原始分析物，其中為靈敏檢測和簡單質(zhì)譜而設(shè)計標(biāo)記 物。簡單質(zhì)譜表示可利用多種標(biāo)記物同時分析多個分析物。PCT/GB98/00127描述了共價連接于可切割標(biāo)記物的核酸探針陣列，而所述標(biāo)記 物可通過鑒定共價相連核酸探針的序列的質(zhì)譜法來檢測。該申請的標(biāo)記探針具有結(jié)構(gòu) Nu-L-M，其中Nu是共價連接于L (可切割接頭)的核酸，而L共價連接于M(質(zhì)量標(biāo)簽)。該 申請中優(yōu)選的可切割接頭在質(zhì)譜儀的離子源內(nèi)切割。優(yōu)選的質(zhì)量標(biāo)簽是取代的多-芳基 醚。該申請公開了各種電離方法和通過四極質(zhì)量分析器、飛行時間(TOF)分析器和扇形磁 場分析器作為通過質(zhì)譜法分析質(zhì)量標(biāo)簽的具體方法來分析。PCT/GB94/01675公開了可切割地連接于質(zhì)量標(biāo)簽分子的配體，特別是核酸。優(yōu)選 的可切割接頭是光-可切割的。該申請公開了基體輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時間 (TOF)質(zhì)譜法作為通過質(zhì)譜法檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)簽的具體方法。PCT/US97/22639公開了可釋放的不揮發(fā)質(zhì)量標(biāo)簽分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這 些標(biāo)記物包含聚合物，通常是可切割地連接于反應(yīng)基團(tuán)或配體，即探針的生物聚合物。優(yōu)選 的可切割接頭看來是化學(xué)或酶學(xué)可切割的。該申請公開了 MALDI TOF質(zhì)譜法作為通過質(zhì)譜 法分析質(zhì)量標(biāo)簽的具體方法。PCT/US97/01070、PCT/US97/01046 和 PCT/US97/01304 公開了可切割地連接于質(zhì)
量標(biāo)簽分子的配體，特別是核酸。優(yōu)選的可切割接頭看來是化學(xué)或光可切割的。該申請公 開了各種電離方法和通過四極質(zhì)量分析器、TOF分析器和扇形磁場分析器作為通過質(zhì)譜法 分析質(zhì)量標(biāo)簽的具體方法來分析。這些現(xiàn)有技術(shù)申請無一提及利用標(biāo)記生物分子的串聯(lián)或連續(xù)質(zhì)量分析。Gygi等(Nature Biotechnology 17 :994_999，“利用同位素編碼的親和力標(biāo)簽定 量分析復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物(Quantitative analysis of complex proteinmixtures using isotope-coded affinity tags) ” 1999)公開了利用“同位素編碼的親和力標(biāo)簽”從蛋白質(zhì) 中捕獲肽以便作蛋白質(zhì)表達(dá)分析。在該篇文章中，作者描述了利用與硫醇反應(yīng)的生物素接 頭捕獲其中含半胱氨酸的肽。一種來源的蛋白質(zhì)樣品與生物素接頭反應(yīng)并用內(nèi)肽酶切割。 然后利用親和素化珠分離含生物素化半胱氨酸的肽以便通過質(zhì)譜法作后續(xù)分析。可用生物 素接頭標(biāo)記一種樣品，而用氘化形式的生物素接頭標(biāo)記第二樣品來定量比較兩種樣品。然后樣品中的各肽在質(zhì)譜圖中表示為一對峰。質(zhì)譜圖中對應(yīng)于各標(biāo)簽的諸峰的積分表明連接 于標(biāo)簽的肽的相對表達(dá)水平。選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)提供了能有效濾出所需分析物外的所有 分子和污染物的高度選擇性串聯(lián)質(zhì)譜法。如果分析在確定分析窗內(nèi)易具有幾種同量異序物 質(zhì)的復(fù)雜樣品，這是非常有利的。通常將在質(zhì)譜儀第一階段(本文稱為Ql 四極1，但也等 于非-四極質(zhì)譜儀，例如離子阱等中的各階段)的前體(親代離子)選擇與該前體離子斷 裂成許多片段組合起來，這些片段中的一個或數(shù)個特定片段在隨后的MS-檢測步驟中(通 常在四極3，Q3)選擇并在離子檢測器處檢測。該兩步選擇確保檢測所需分析物并降低任何 其它離子物質(zhì)的強(qiáng)度。信噪比遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)MS/MS實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)在Ql中選擇一個質(zhì)量窗，然 后在離子檢測器中檢測所有產(chǎn)生的片段。原則上，依據(jù)MS的該方法可提供分析物的絕對結(jié) 構(gòu)特異性，與合適的穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)(SIQ聯(lián)用后，其可絕對定量分析物濃度。在常規(guī)SRM/MRM型實(shí)驗(yàn)中，利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的參比產(chǎn)生用于相對參比定量測 定分析物的分析物/參比配對。對于蛋白質(zhì)分析，此類參比肽與待檢測分析物的不同之處 僅在于摻入了同位素，從而使其在質(zhì)量上明顯不同于Ql選擇，但在化學(xué)組成和理化特性上 相同。在典型的實(shí)驗(yàn)中，選擇分析物/參比配對，即在Ql中在所述兩種質(zhì)量之間轉(zhuǎn)變質(zhì)量 選擇通道(massselection channel)。隨后使所述兩種離子斷裂產(chǎn)生不同(特異性)的片 段質(zhì)量。然后選擇一種或多種合適的片段質(zhì)量，其中Q3濾器維持在所選片段離子的位置， 因此確保該離子轉(zhuǎn)移至質(zhì)量分析器，并濾出其它離子種類。設(shè)計改進(jìn)的質(zhì)量標(biāo)簽以便采用質(zhì)譜法鑒定分析物的最近工作致力于在質(zhì)譜圖中 更易鑒定(而非其它污染物)的質(zhì)量標(biāo)簽。WO 01/68664公開了兩種或更多種質(zhì)量標(biāo)簽的集合，該集合中的各標(biāo)記物包含通 過可切割接頭連接于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分的質(zhì)量標(biāo)記物部分，所述質(zhì)量標(biāo)記物部分耐受斷裂。 該集合中各標(biāo)記物的合計質(zhì)量(aggregate mass)可以相同或不同，該集合中各標(biāo)記物的質(zhì) 量標(biāo)記物部分的質(zhì)量可以相同或不同。在具有共同質(zhì)量的質(zhì)量標(biāo)記物部分的集合中的任何 組標(biāo)記物中，各標(biāo)記物的合計質(zhì)量不同于該組中的所有其它標(biāo)記物，在具有共同合計質(zhì)量 的集合中的任何組標(biāo)記物中，各標(biāo)記物具有質(zhì)量不同于該組中所有其它質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的 質(zhì)量標(biāo)記物部分，從而該集合中所有的質(zhì)量標(biāo)簽可通過質(zhì)譜法彼此區(qū)分。該申請還公開了 分析方法，包括通過質(zhì)譜法鑒定分析物特有的質(zhì)量標(biāo)簽或質(zhì)量標(biāo)簽組合來檢測分析物?？?采用串聯(lián)質(zhì)譜法。具體地說，用于檢測質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)譜儀可以是三重四極質(zhì)量分析器，其包 括第一分析器以選擇特定質(zhì)量或質(zhì)量范圍的離子、第二質(zhì)量分析器以解離所選離子和第三 質(zhì)量分析器以檢測得到的離子。WO 03/025576公開了兩種或更多種質(zhì)量標(biāo)簽的集合，該集合中的各標(biāo)記物包含通 過至少一個酰胺鍵連接于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分的質(zhì)量標(biāo)記物部分。該質(zhì)量標(biāo)記物部分包含氨基 酸和含氨基酸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分。對于W001/68664，該集合中各標(biāo)記物的合計質(zhì)量可以相 同或不同，該集合中各標(biāo)記物的質(zhì)量標(biāo)記物部分的質(zhì)量可以相同或不同，從而該集合中所 有質(zhì)量標(biāo)簽可通過質(zhì)譜法彼此區(qū)分。對于WO 01/68664，該申請還公開了可包括串聯(lián)質(zhì)譜法 的分析方法。該申請尤其涉及分析肽和含質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分及質(zhì)量標(biāo)記物部分的質(zhì)量標(biāo)簽， 所述質(zhì)量標(biāo)記物部分含至少一個氨基酸。W02007/0U849公開了具有通用化學(xué)式的質(zhì)量標(biāo) 簽和反應(yīng)性質(zhì)量標(biāo)簽以便標(biāo)記生物學(xué)分子并通過質(zhì)譜法檢測。該發(fā)明的質(zhì)量標(biāo)簽和反應(yīng)性質(zhì)量標(biāo)簽在質(zhì)譜圖中清晰鑒定并易與分析物反應(yīng)。對于WO 01/68664，該申請還公開了可包 括串聯(lián)質(zhì)譜法的分析方法。在二十世紀(jì)90年代后期，同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的開發(fā)使生物標(biāo)志發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生革命性 變革。在一次LC-MS/MS流程中能分析多種樣品(理論上無限數(shù)量)增加了處理量，同時降 低分析差異。因此，需要通過質(zhì)譜法定量檢測和常規(guī)檢測各種樣品中的分析物的改進(jìn)方法。雖然WO 01/68664、WO 03/02557和WO 2007/0U849提供的質(zhì)量標(biāo)簽?zāi)茱@著改善 通過質(zhì)譜法分析分析物的方法，但仍需要提供通過質(zhì)譜法鑒定此類質(zhì)量標(biāo)簽來檢測分析物 的改進(jìn)方法。具體地說，雖然這些新質(zhì)量標(biāo)簽和分析方法能同時和定量分析多種樣品而不 顯著增加質(zhì)譜圖的復(fù)雜性，但采用已知的串聯(lián)質(zhì)譜法分析同量異序質(zhì)量標(biāo)簽提供的復(fù)雜樣 品的結(jié)果可能不精確。本領(lǐng)域仍需要提供能在質(zhì)譜儀中簡單鑒定質(zhì)量標(biāo)簽并靈敏定量測定 的改進(jìn)分析方法。因此，本發(fā)明的目的是解決本領(lǐng)域中現(xiàn)有技術(shù)的問題并提供通過質(zhì)譜法檢驗(yàn)靶分 析物的方法。在第一方面，本發(fā)明提供檢驗(yàn)靶分析物的方法，該方法包括(a)提供可包含靶分析物的多個樣品，其中各樣品用質(zhì)量標(biāo)簽或質(zhì)量標(biāo)簽的組合 作差異性標(biāo)記，所述質(zhì)量標(biāo)簽來自質(zhì)量標(biāo)簽的集合，各質(zhì)量標(biāo)簽是包含質(zhì)譜上不同的質(zhì)量 標(biāo)記物基團(tuán)的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽，從而可通過質(zhì)譜法區(qū)分這些樣品；(b)混合所述多個標(biāo)記樣品以產(chǎn)生分析混合物并將所述分析混合物引入質(zhì)譜儀；(c)選擇具有該第一質(zhì)荷比的離子，該第一質(zhì)荷比等于用特定數(shù)量的質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo) 記的靶分析物的離子；(d)使該具有第一質(zhì)荷比的離子斷裂成多個片段離子，其中所述多個片段離子的 一部分包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽；(e)選擇具有第二質(zhì)荷比的離子，該第二質(zhì)荷比等于包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽 的靶分析物的片段的離子；(f)使具有該第二質(zhì)荷比的離子斷裂成多個其它片段離子，其中所述其它片段離 子的一部分是所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子；(g)產(chǎn)生在步驟(f)中產(chǎn)生的其它片段離子的質(zhì)譜圖；和(h)由所述質(zhì)譜圖測定各樣品中靶分析物的含量。本發(fā)明方法利用同量異序標(biāo)記的樣品，通過定量測定感興趣分子而克服了本領(lǐng)域 的局限性，其中該方法包括選擇預(yù)定質(zhì)荷比的離子的兩步驟，其后各自是斷裂步驟。與常規(guī) 串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MQ實(shí)驗(yàn)相比，采用此類方法提供高度選擇性，因此，最終步驟中產(chǎn)生的質(zhì)譜 圖提供更精確的定量結(jié)果。在利用同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)中，首先選擇與標(biāo)記靶分析物 的質(zhì)量相等的離子。選擇后，使標(biāo)記分析物的離子斷裂，然后鑒定對應(yīng)于質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo) 記物基團(tuán)的諸峰。然而，所得圖譜常因具有與所選質(zhì)荷比相同質(zhì)荷比的污染物的共同洗脫 片段而不能精確定量測定分析物。該問題在分析蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物時產(chǎn)生。在復(fù)雜混合 物中，不同肽或肽片段可具有與靶分析物相同的質(zhì)量。這些污染肽不能通過MS/MS與靶分 析物相區(qū)分，因?yàn)樗鼈冊谶x擇步驟中作為母體離子質(zhì)荷比而一起選擇。因此，使母體離子斷 裂以釋放質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)會提供選擇的所有肽的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的圖譜，包括具有與靶分析物相同質(zhì)量的污染性肽。本發(fā)明因額外的選擇(步驟e)和斷裂(步驟f)步驟而克服了 MS/MS的該局限 性。在步驟e)中，選擇與包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽的靶分析物片段的所需離子相等的質(zhì) 荷比確保除去質(zhì)譜圖中在Ql中(步驟c)選擇的大多數(shù)(即使不是全部)污染性分子。在 步驟d)中斷裂成多個片段并且無一具有與步驟e)中所選第二質(zhì)荷比相等的質(zhì)荷比的污染 性肽會除去。因此，斷裂步驟f)釋放的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)僅來自靶分析物，所得質(zhì)譜圖提供 靶分析物的高度改進(jìn)的精確定量測定結(jié)果。本發(fā)明方法尤其有利于分析復(fù)雜樣品，因?yàn)轭~ 外的選擇性程度提高了特異性。本發(fā)明方法成功地在SRM (選擇反應(yīng)監(jiān)測一種分析物)或MRM(多反應(yīng)監(jiān)測多 種分析物)的高靈敏度和選擇性之間產(chǎn)生組合，在用于定量測定目的的最終分析步驟中復(fù)用。步驟(h)中測定的量可以是各樣品中靶分析物的相對量或各樣品中靶分析物的
絕對量。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)是能一起分析多個樣品。所述多個樣品可以是可包含靶分析物 的測試樣品。術(shù)語“測試樣品”指可能存在分析物的任何樣本。測試樣品可僅包含一種分析物。 或者，測試樣品可包含多種不同分析物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，一個樣品是測試樣品，一個樣品是校準(zhǔn)樣品，其中所 述校準(zhǔn)樣品包含靶分析物的一個或多個不同試樣，各試樣具有已知量的該分析物，其中所 述測試樣品和所述校準(zhǔn)樣品的各試樣作差異性標(biāo)記。當(dāng)存在一種或多種校準(zhǔn)樣品時，本發(fā)明方法中的步驟h)最好包括根據(jù)校準(zhǔn)樣品 中一個或多個試樣中分析物的已知和測定量校準(zhǔn)測試樣品中分析物的含量。在優(yōu)選的實(shí)施 方式中，該方法包括將各試樣中分析物的含量與通過質(zhì)譜法測定的各試樣中分析物的含量 作圖的步驟。該步驟可簡單地包括計算和技術(shù)人員熟知的實(shí)施此類計算的數(shù)學(xué)程序或算 法。然后通過質(zhì)譜法檢測樣品中的含量，根據(jù)校準(zhǔn)圖計算樣品中分析物的含量。就本發(fā)明而 言，述及“通過質(zhì)譜法檢測的含量”通常是通過質(zhì)譜法檢測的涉及分析物含量的離子豐度、 離子強(qiáng)度或其它信號。該實(shí)施方式提供獨(dú)立于外部獲得的校準(zhǔn)值的更精確定量測定結(jié)果， 因而提供更穩(wěn)定而可靠的分析。不同的試樣各自具有不同的已知量的分析物。術(shù)語“已知量”表示校準(zhǔn)樣品的各 試樣中分析物的絕對量或定性量已知。絕對量表示已知的數(shù)量。這考慮了待測定測試樣品中分析物的絕對量。本文中定性量表示數(shù)量并非絕對知曉，但可能是具有特定狀態(tài)的對象，例如健康 或患病狀態(tài)對象中預(yù)計的數(shù)量范圍，或取決于所研究的測試樣品類型的一些其它預(yù)計范 圍。由于各試樣含有不同量的分析物，其是“不同的”。一般通過從標(biāo)準(zhǔn)樣品取得不同體積 來實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，對于取得不同體積將確保各試樣中以所需比例存在不同量而無需知曉絕對量 的定性量尤其是這樣?；蛘撸髟嚇臃謩e制備而不從同一樣品中取得。在一個實(shí)施方式中， 各不同試樣具有相同體積，但包含不同量的分析物。該校準(zhǔn)樣品或各校準(zhǔn)樣品優(yōu)選包含靶分析物的兩種或更多種不同試樣。利用靶分 析物的兩種或更多種不同試樣能構(gòu)建各分析物的多點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線而不會增加MS復(fù)雜性。利用步驟g)中產(chǎn)生的質(zhì)譜圖定量測定分析物，可同時定量測定和鑒定樣品和校準(zhǔn)樣品中的 分析物?；蛘?，僅測定分析物的含量。該方法為在一次實(shí)驗(yàn)中檢測最多10種、最多20種、 最多50種或更多種分析物提供手段。除一個或多個校準(zhǔn)樣品外，本發(fā)明方法可包括分析多個測試樣品。在該實(shí)施方式 中，優(yōu)選檢驗(yàn)所述多個測試樣品各自的相同分析物。待檢驗(yàn)的各測試樣品優(yōu)選利用相同的 校準(zhǔn)樣品。通常向不同的各測試樣品中加入包含分析物的一種或多種試樣的已知體積的相 同校準(zhǔn)樣品。該方法尤其可用于涉及患者的多種樣品的臨床研究。如果制備大量校準(zhǔn)樣品 并取得各部分，多個實(shí)驗(yàn)室可利用相同的校準(zhǔn)樣品，從而促進(jìn)交叉研究和交叉實(shí)驗(yàn)室比較。 可利用一種或多種同量異序質(zhì)量標(biāo)簽差異性標(biāo)記各測試樣品并在步驟b)中與一個或多個 校準(zhǔn)樣品混合，在步驟h)中同時測定各樣品中的分析物含量?；蛘撸捎孟嗤|(zhì)量標(biāo)簽標(biāo) 記各測試樣品，各不同測試樣品重復(fù)步驟b)到h)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可用于檢驗(yàn)多個不同靶分析物。在一個實(shí)施方式 中，該方法包括為各靶分析物重復(fù)步驟(C)到(h)的步驟。在其中一種樣品是測試樣品的 該實(shí)施方式中，可為各不同分析物提供校準(zhǔn)樣品。各校準(zhǔn)樣品包含靶分析物的一個或多個 不同試樣，其中所述測試樣品和各校準(zhǔn)樣品的各試樣作差異性標(biāo)記。在一個實(shí)施方式中，多 種分析物是在步驟(a)之前通過化學(xué)或酶學(xué)加工蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽的肽 片段。在具體實(shí)施方式
中，所述多種分析物是相同蛋白質(zhì)或多肽的肽?，F(xiàn)在，參考以下附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明圖Ia顯示用兩種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的肽VATVSLPR 的MS/MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(質(zhì)量為126 127的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比 為2 1)，圖Ib顯示圖Ia的圖譜的放大部分，其顯示質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的諸峰。圖加顯示

圖1所分析的標(biāo)記肽VATVSLPR的bl_離子的MS/MS圖譜；圖2b顯示圖 2a的圖譜的放大部分，其顯示質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的諸峰。圖3顯示用六種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的肽VAFSLR的 MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(質(zhì)量為126 127 128 129 130 131的 質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為1:3:5:5:3:1)。圖4顯示圖3所分析的標(biāo)記VAFSLR肽的MS/MS圖譜。圖fe顯示圖3所分析的標(biāo)記VAFSLR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS圖譜；圖 5b顯示圖3所分析的標(biāo)記VAFSLR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS/MS圖譜。圖6顯示用六種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的肽AVFSLR的 MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(質(zhì)量為126 127 128 129 130 131的 質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為1 1 1 4 4 4)。圖7顯示圖6所分析的標(biāo)記AVFSLR肽的MS/MS圖譜。圖fe顯示圖6所分析的標(biāo)記AVFSLR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS圖譜；圖 8b顯示圖6所分析的標(biāo)記AVFSLR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS/MS圖譜。圖9顯示用六種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的肽FAVSLR的 MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(質(zhì)量為126 127 128 129 130 131的 質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為4 4 4 1 1 1)。圖10顯示圖9所分析的標(biāo)記FAVSLR肽的MS/MS圖譜。
圖Ila顯示圖9所分析的標(biāo)記FAVSLR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS圖譜；圖 lib顯示圖9所分析的標(biāo)記FAVSLR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS/MS圖譜。圖12顯示用六種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的肽LAFSVR的 MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(質(zhì)量為126 127 128 129 130 131的 質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為5 3 1 1 3 5)。圖13顯示圖12所分析的標(biāo)記LAFSVR肽的MS/MS圖譜。圖14a顯示圖12所分析的標(biāo)記LAFSVR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS圖譜； 圖14b顯示圖12所分析的標(biāo)記LAFSVR肽的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/MS/MS圖譜。圖15顯示用六種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽各自標(biāo)記的肽 VAFSLR和LAFSVR的混合物的MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(肽VAFSLR 質(zhì)量為 126 127 128 129 130 131 的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為 1:3:5:5:3:1; 和肽LAFSVR 質(zhì)量為126 127 128 129 130 131的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為 5 · 3 · 1 · 1 · 3 · 5) ο圖16顯示圖15所分析的標(biāo)記VAFSLR和LAFSVR肽的混合物的MS/MS圖譜。圖17顯示圖15所分析的標(biāo)記VAFSLR和LAFSVR肽的混合物的不同質(zhì)量標(biāo)記物基 團(tuán)的MS/MS圖譜。圖18a顯示圖15所分析的標(biāo)記VAFSLR的bl_離子的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/ MS/MS圖譜；圖18b顯示圖15所分析的標(biāo)記LAFSVR的bl_離子的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的 MS/MS/MS 圖譜。圖19顯示用六種質(zhì)量標(biāo)簽的集合中的不同同量異序質(zhì)量標(biāo)簽各自標(biāo)記的肽 AVFSLR和FAVSLR和混合物的MS圖譜，各標(biāo)記物代表預(yù)定相對量的肽(肽AVFSLR 質(zhì)量為 126 127 128 129 130 131 的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為 1 :1:1:4:4:4; 和肽FAVSLR 質(zhì)量為126 127 128 129 130 131的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之比為 4:4:4:1:1:1)。圖20顯示圖19所分析的標(biāo)記AVFSLR和FAVSLR肽的混合物的MS/MS圖譜。圖21顯示圖19所分析的標(biāo)記AVFSLR和FAVSLR肽的混合物的不同質(zhì)量標(biāo)記物基 團(tuán)的MS/MS圖譜。圖2 顯示圖19所分析的標(biāo)記AVFSLR的bl_離子的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的MS/ MS/MS圖譜；圖22b顯示圖19所分析的標(biāo)記FAVSLR的bl_離子的不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的 MS/MS/MS 圖譜。圖23顯示標(biāo)記肽AEFAEVSK的MS/MS圖譜和用于標(biāo)記該肽的質(zhì)量標(biāo)簽(TMTO)的 結(jié)構(gòu)。該肽在N-末端和賴氨酸處標(biāo)記。顯示了該質(zhì)量標(biāo)簽斷裂產(chǎn)生的離子。圖24顯示用兩種質(zhì)量標(biāo)簽的集合(包含TMT2-U6和TMT2-127的TMT 二聚體) 標(biāo)記的肽VLEPTLK的MS/MS圖譜和用于標(biāo)記該肽的質(zhì)量標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)。該肽在N-末端和賴 氨酸處標(biāo)記。顯示了該質(zhì)量標(biāo)簽斷裂產(chǎn)生的離子。圖2 顯示用質(zhì)量標(biāo)簽TMT-O標(biāo)記的血清白蛋白LVNEVTEFAK的肽的MS/MS圖譜， 圖2 顯示用質(zhì)量標(biāo)簽TMT六聚體(sixplex)標(biāo)記的血清白蛋白LVNEVTEFAK的肽的MS/MS 圖譜。圖25a和25b的肽在N-末端和賴氨酸處標(biāo)記。圖2 和25b的標(biāo)記肽之間顯示有 IODa的質(zhì)量差異。
圖26a顯示圖25a的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y3離子片段，圖26b顯示圖 25b的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y3離子片段。y3離子片段保留賴氨酸殘基上的一個 完整質(zhì)量標(biāo)簽，從而在圖26a和26b的兩種標(biāo)記片段離子之間產(chǎn)生5湯姆森(Thomson) (Th， 質(zhì)荷比的單位)的m/z差異。圖27a顯示圖25a的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y5離子片段，圖27b顯示圖 25b的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示y5離子片段。y5片段離子保留賴氨酸殘基上的一個 完整質(zhì)量標(biāo)簽，從而在圖27a和27b的兩種標(biāo)記片段離子之間產(chǎn)生5湯姆森(Th，質(zhì)荷比的 單位)的m/z差異。圖28a顯示圖25a的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示b7離子片段，圖28b顯示圖 25b的MS/MS圖譜的放大部分，其顯示b7離子片段。b7片段離子保留N-末端上的一個完 整質(zhì)量標(biāo)簽，從而在圖28a和^b的兩種標(biāo)記片段離子之間產(chǎn)生5湯姆森(Th，質(zhì)荷比的單 位)的m/z差異。圖^a顯示用TMT 0 (TMT zero)和TMT六聚體標(biāo)記的肽LVTDLTK的MS圖譜。該 肽在N-末端和賴氨酸處作標(biāo)記，從而在標(biāo)記的肽TMT 0和TMT六聚體之間產(chǎn)生IODa的質(zhì) 量差異。在雙荷電前體離子之間觀察到5Th的質(zhì)量差異。圖29b顯示用TMT 0和TMT六聚體標(biāo)記的肽HPDYSVVLLLR的MS圖譜。該肽在N-末 端作標(biāo)記，從而在標(biāo)記的肽TMT 0和TMT六聚體之間產(chǎn)生5Da的質(zhì)量差異。在三荷電前體 離子之間觀察到1. 67Th的質(zhì)量差異。圖30顯示用質(zhì)量標(biāo)簽TMT-O和質(zhì)量標(biāo)簽TMT六聚體(TMT6-127)標(biāo)記的10種血 漿肽的MRM離子色譜。圖31a_d顯示用ΤΜΤ-0和TMT六聚體(TMT6-127)標(biāo)記的血漿肽K的MRM離子色 譜。以不同比例混合TMT-標(biāo)記的血漿樣品。圖32顯示肽K的TMT 0 =TMT六聚體(如圖31a_31d所示)的預(yù)計比例和觀察比 例的關(guān)系圖。分析一式三份進(jìn)行。圖33顯示QitTof 儀器的示意圖。圖:34a、34b和3 顯示能進(jìn)行MS/MS/MS的質(zhì)譜儀的其它配置。術(shù)語“分析物”不作特別限定，可采用本發(fā)明方法檢驗(yàn)所提供的任何類型分子，該 分子可用質(zhì)譜法分析并能用含質(zhì)譜學(xué)不同的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記。分 析物包括氨基酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸、多核苷酸、寡核苷酸、DNA、RNA、 肽-核酸、糖、淀粉和復(fù)雜的碳水化合物、脂肪和復(fù)雜的脂質(zhì)、聚合物和有機(jī)小分子，例如藥 物和藥物樣分子或其片段。分析物優(yōu)選肽、蛋白質(zhì)、核苷酸或核酸。對于本發(fā)明，術(shù)語分析物應(yīng)與術(shù)語生物分子同義。對于本發(fā)明，術(shù)語“蛋白質(zhì)”應(yīng)包括含有兩個或更多個氨基酸的任何分子，包括二 肽、三肽、肽、多肽和蛋白質(zhì)。對于本發(fā)明，術(shù)語“核酸”應(yīng)包括含有兩個或更多個核苷酸堿基的任何分子，包括 二核苷酸、三核苷酸、寡核苷酸、脫氧核糖核酸、核糖核酸和肽核酸。表述“六聚體串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)集合”指六個同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的集合，其 中各標(biāo)記物包含質(zhì)譜學(xué)不同的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)。六聚體串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽的集合的例子是 TMT6-128, TMT6-129, TMT6-130, TMT6_131，其中“6”代表該集合中標(biāo)記物的數(shù)量，“TMT”后的數(shù)字U8-131代表質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)量。二聚體串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽的集合同樣指兩個同量異 序質(zhì)量標(biāo)簽的集合。二聚體串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽的集合的例子是TMT2-I^和TMT2-127，其中“2” 代表該集合中標(biāo)記物的數(shù)量，“TMT”后的數(shù)字1 和127代表質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)量。五 聚體串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽的集合指五個同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的集合。本發(fā)明的術(shù)語“MS”指質(zhì)譜方法，包括產(chǎn)生樣品的離子和產(chǎn)生這些離子的質(zhì)譜圖。本發(fā)明的術(shù)語“MS/MS”指本發(fā)明方法，包括選擇特定質(zhì)荷比的離子，使所選離子斷 裂，例如通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID)并產(chǎn)生片段離子的質(zhì)譜圖。本發(fā)明的術(shù)語“MS/MS/MS”指本發(fā)明方法，包括步驟(a)-(h)。對于本發(fā)明，術(shù)語“質(zhì)譜法”應(yīng)包括能進(jìn)行斷裂分析的任何類型的質(zhì)譜法。適用于 本發(fā)明的質(zhì)譜儀包括能進(jìn)行MS/MS/MS的含任何形式分析器的儀器。在一個實(shí)施方式中，在質(zhì)譜儀的不同四極中進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟(c)-(g)。在該 實(shí)施方式中，選擇具有第一質(zhì)荷比的離子的步驟c)在串聯(lián)儀器的第一質(zhì)譜分析器Oil)中 進(jìn)行。然后將選擇的離子引入單獨(dú)的碰撞室(Q2)，它們在其中與氣體或固體表面碰撞從而 在步驟d)中產(chǎn)生多個片段離子。然后將步驟d)的碰撞產(chǎn)物引入第三質(zhì)量分析器(Q3)，其 中在步驟e)中選擇第二質(zhì)荷比的離子(MS/MS離子)。然后將步驟e)的所選離子引入單獨(dú) 的碰撞室(Q4)，它們在其中與氣體或固體表面碰撞從而在步驟f)中產(chǎn)生多個其它片段離 子。將步驟f)的其它片段離子引入步驟g)中串聯(lián)儀器的其它質(zhì)量分析器0^5)以檢測碰撞 產(chǎn)物。典型的串聯(lián)儀器包括5個四極質(zhì)譜儀、串聯(lián)扇形儀器(tandem sector instrument) 和四極飛行時間(TOF)質(zhì)譜儀?；蛘撸景l(fā)明方法的步驟(c)-(g)在質(zhì)譜儀的同一區(qū)域中順序進(jìn)行。例如，這可在 離子阱和傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)質(zhì)譜儀中實(shí)現(xiàn)?？陕?lián)用常規(guī)3D離子阱，混合幾何儀器，例如四極離子阱與TOF分析器以及較大的 足跡四扇形儀器實(shí)施本發(fā)明的MS/MS/MS實(shí)驗(yàn)。Wu Z.，Bordas-Nagy J.和 Fenselau C. (1991) “三重質(zhì)譜法(MS/MS/MS)與 四-扇形串聯(lián)質(zhì)譜儀中的浮動碰撞室(Triple mass spectrometry (MS/MS/MS) with a floated collision cell in a four-sector tandem massspectrometer)，，Organic Mass Spectrometry 26，10，908-911描述了用串聯(lián)雙聚焦質(zhì)譜儀上的第三無場區(qū)中的電 浮動碰撞室進(jìn)行MS/MS/MS實(shí)驗(yàn)的方法。該實(shí)驗(yàn)利用JEOL JMS-HXl 10/HX110四-扇形質(zhì) 譜儀進(jìn)行，雖然該方法包括校準(zhǔn)所有加速電壓(accelerating voltages)下的磁體校準(zhǔn) (magnetcalibration)，但其通常適用于任何碰撞室電壓值。四極離子阱(QIT)是累積和儲存離子的有效手段。聯(lián)用QIT與TOF質(zhì)譜儀提供單 用QIT或TOF質(zhì)譜儀所不具有的能力。Syagen 早已將這些裝置組合入稱為QitTofTM的一
種儀器，其是提供QIT MS的MSn優(yōu)點(diǎn)與TOFMS的高速數(shù)據(jù)收集速度的首個市售可得儀器。 QitTof 儀器的構(gòu)造示于圖33。Shimadzu隨后也開發(fā)了 LCMS-QIT-T0F系統(tǒng)。圖；34所示 示意圖說明QitTof 儀器的幾何構(gòu)造。與其它儀器相比，QitTof 幾何構(gòu)造尤其有優(yōu)勢。與正交-提取TOF MS相比， QitTof 構(gòu)造可能具有更高的離子傳輸效率并能進(jìn)行有效的MSn操作。由于離子被脈沖出 而非掃出QIT，QIT因較高的重復(fù)率而產(chǎn)生動態(tài)范圍較高和離子阱性能較高的質(zhì)量-選擇性 噴射(mass-selective ejection)。TOF提供多通道質(zhì)量檢測的優(yōu)點(diǎn)，從而能有效收集所有離子。利用TOF分析器還實(shí)現(xiàn)了更好的離子質(zhì)量精度。幾種其它儀器幾何構(gòu)造考慮可用于本發(fā)明的MS3實(shí)驗(yàn)，將來可能的選擇示于圖34。 在本階段難以評估各設(shè)計的性能，需要進(jìn)一步研究。圖34A描述了具有三個掃描四極和兩 個碰撞室的五-四極配置。離子倍增檢測器通常與四極質(zhì)量分析器聯(lián)用。圖34B描述了具 有正交反射TOF(orthogonalreflectron T0F)作為終末期分析器的雙重掃描四極。圖;MC 描述了具有定時離子門的三重階段TOF儀器，從而允許用戶規(guī)定質(zhì)量范圍的離子進(jìn)入第一 (級)兩個雙線性TOF分析器。本發(fā)明可采用基體輔助激光解吸/電離(MALDI)技術(shù)。MALDI需要生物分子溶液 包埋在摩爾過量的光可激發(fā)的“基體”中。應(yīng)用合適頻率的激光導(dǎo)致基體激活，進(jìn)而造成基 體與其包埋的生物分子一起快速蒸發(fā)。質(zhì)子從酸性基體向生物分子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生該生物分子的 質(zhì)子化形式，可通過正離子質(zhì)譜法，特別是飛行時間(TOF)質(zhì)譜法檢測。通過MALDI TOF也 可能進(jìn)行負(fù)離子質(zhì)譜法。該技術(shù)賦予離子顯著量的平動能，但盡管如此其不傾向于誘導(dǎo)過 度斷裂?？刹捎眉す饽芰亢陀糜诩铀賮碓粗须x子的勢差施加時間來控制該技術(shù)的斷裂。該 技術(shù)因其質(zhì)量范圍大、其圖譜中主要是單電荷離子以及能同時分析多種肽而特別優(yōu)選。本 發(fā)明可采用T0F/T0F技術(shù)。光可激發(fā)的基體包含“染料”，即，該化合物強(qiáng)烈吸收特定頻率的光并優(yōu)選不通過 熒光或磷光放出能量而是經(jīng)熱，即，通過震動模式消散該能量。正是激光激發(fā)導(dǎo)致的基體震 動使得染料的快速升華，同時將包埋的分析物帶入氣相。雖然MALDI技術(shù)可用于本發(fā)明，但本發(fā)明不限于該類技術(shù)，如果需要，技術(shù) 人員可將本領(lǐng)域常見的其它技術(shù)用于本發(fā)明。例如，可采用電噴霧或納米電噴霧 (nanoelectrospray) ^ °本發(fā)明方法可在步驟(a)之前包括用一個或多個同量異序質(zhì)量標(biāo)簽差異性標(biāo)記 各樣品和校準(zhǔn)樣品各試樣(有一種或多種校準(zhǔn)樣品存在時)的其它步驟。在有一個或多個 校準(zhǔn)樣品存在的實(shí)施方式中，該方法在步驟(a)之前還包括混合差異性標(biāo)記的試樣以產(chǎn)生 校準(zhǔn)樣品的其它步驟?？蓪蟹治鑫镞B接于一個質(zhì)量標(biāo)簽、兩個質(zhì)量標(biāo)簽或多于兩個質(zhì)量標(biāo)簽。靶分析 物或其片段優(yōu)選連接于兩個同量異序質(zhì)量標(biāo)簽。靶分析物各端連接有至少一個質(zhì)量標(biāo)簽也 是優(yōu)選的。這在靶分析物是蛋白質(zhì)或核酸時尤其優(yōu)選?？稍诤线m條件下標(biāo)記樣品以控制有多少標(biāo)記物連接于靶分析物。例如，可將過量 標(biāo)記物加入樣品以確保最大量的標(biāo)記物連接于各分析物。當(dāng)將質(zhì)量標(biāo)簽連接于核酸或蛋白 質(zhì)分析物各端是有利之時最好這樣。或者，可控制質(zhì)量標(biāo)簽的反應(yīng)活性基團(tuán)和/或標(biāo)記條 件以將質(zhì)量標(biāo)簽連接于分析物的優(yōu)選端，例如蛋白質(zhì)的C-末端或N-末端。如果靶分析物是蛋白質(zhì)或肽，優(yōu)選用質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記各靶分析物的N-末端和C-末 端。各分析物的賴氨酸的氨基-末端胺基團(tuán)和C-末端ε-胺基團(tuán)優(yōu)選各包含質(zhì)量標(biāo)簽。圖 25a和圖26b所示的肽(LVNEVTEFAK)連接于兩個標(biāo)記物，其中一個連接于N-末端亮氨酸， 一個標(biāo)記物連接于C-末端賴氨酸。在本發(fā)明方法中，步驟C)中選擇第一質(zhì)荷比等于用特定數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶 分析物離子的離子。各樣品中該標(biāo)記的靶分析物因具有相同的質(zhì)量而在步驟c)中選擇。在一個實(shí)施方式中，所述第一質(zhì)荷比等于用特定數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的未斷裂母體離子的質(zhì)荷比?；蛘撸龅谝毁|(zhì)荷比等于用特定數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析 物的片段離子的質(zhì)荷比。步驟c)選擇的具體質(zhì)荷比取決于靶分析物和連接于該靶分析物的標(biāo)記物數(shù)量。 技術(shù)人員不難為步驟c)選擇合適的第一質(zhì)荷比。步驟c)中選擇的離子優(yōu)選具有2+或更 高的電荷狀態(tài)。當(dāng)對，例如包含組分，如蛋白質(zhì)的混合物的樣品實(shí)施本發(fā)明方法時，多個蛋白質(zhì)或 蛋白質(zhì)片段可具有相同質(zhì)量，因此在步驟c)中可選擇具有相同質(zhì)量的多個不同離子。步驟c)后，具有第一質(zhì)荷比的所選離子在步驟d)中斷裂成多個片段離子，其中該 多個片段離子的一部分包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽。該多個片段離子的一部分包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽表示大于0%的片段離子 包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽。步驟d)中提供的這些片段中的該部分足以使得質(zhì)量報道 基團(tuán)在步驟g)產(chǎn)生的質(zhì)譜圖中檢測。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用同量異序質(zhì)量標(biāo)簽片段標(biāo)記的分析物在步驟d)中斷裂從而產(chǎn)生 包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽的片段離子。這是本發(fā)明的重要發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槟茏鬟M(jìn)一步的選擇 步驟以先除去污染物，再切割標(biāo)記的靶分析物的質(zhì)量報道基團(tuán)。這提供精確的定量結(jié)果。本 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)靶分析器最好連接于兩個或更多各質(zhì)量標(biāo)簽以確保步驟d)后至少一個質(zhì)量標(biāo) 簽是完整的。當(dāng)靶分析物是肽時，肽主要斷裂成y_和b_離子系列，其中也可見其它形式，包括 a-系列、C-系列、χ-系列和ζ-系列?？稍诓襟Ed)中選擇斷裂條件以控制所產(chǎn)生的片段離 子類型。斷裂條件的選擇最好能確保b-和y-離子是最主要的片段離子。宜選擇很低的碰 撞能量以防止連續(xù)斷裂。例如，可利用離子阱以確保不發(fā)生連續(xù)斷裂。斷裂通常由碰撞誘導(dǎo)解離(CID)、表面誘導(dǎo)解離(SID)、電子俘獲解離(EOT)、電子 轉(zhuǎn)移解離(ETD)或快速原子轟擊。電子俘獲解離(ECD)是斷裂多荷電(質(zhì)子化)肽或蛋白質(zhì)離子一個串聯(lián)質(zhì)譜分 析(結(jié)構(gòu)闡明)的方法。在該方法中，多質(zhì)子化的肽或蛋白質(zhì)局限于傅里葉變換離子回旋 共振(FT-ICR)質(zhì)譜儀的彭寧阱(Perming trap)中并接觸具有近熱能量(near-thermal energy)的電子。質(zhì)子化肽俘獲熱電子(thermalelectron)是放熱的( 6eV;leV = 1.60hl(T19J)，并通過非遍歷過程(即，不涉及分子內(nèi)震動能量再分配的過程)導(dǎo)致肽骨架 斷裂。[M+nH]n++e_ — [ [M+nH] ‘1)+]* —片段此外，可用低能電子中和一個或多個蛋白質(zhì)陽離子以特異性切割鍵從而形成C、ζ 產(chǎn)物，相比之下，b、y產(chǎn)物由例如碰撞激活解離(CAD ；也稱為碰撞誘導(dǎo)解離，CID)等其它技 術(shù)形成。由于引入RF 3D四極離子阱OiIT)、四極飛行時間(TOF)或RF線性2D四極離子阱 (QLT)儀器的RF場的熱電子僅能在毫秒范圍維持它們的熱能且不為這些裝置所捕獲，因此 E⑶是僅單用于FTICR(最昂貴的一類MS儀器)的技術(shù)。電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)是斷裂多質(zhì)子化肽或蛋白質(zhì)離子以供串聯(lián)質(zhì)譜分析(結(jié)構(gòu)闡 明)的方法。與電子俘獲解離(ECD)相似，ETD通過將電子轉(zhuǎn)移給陽離子(例如，多荷電肽 或蛋白質(zhì))以誘導(dǎo)它們斷裂。與ECD相反，ETD不為此目的利用游離電子，而是利用自由基 負(fù)離子(例如，具有顯著低電子親和力的蒽或偶氮苯陰離子以用作電子供體)。
[M+nH]n++A_ — [ [M+nH] (n_1)+] *+A —片段電子轉(zhuǎn)移后，ETD導(dǎo)致與ECD相似的斷裂模式，即，形成所謂的c和ζ離子。根據(jù)電 子轉(zhuǎn)移的不同方式，可利用不示于ECD的各種“低成本”質(zhì)譜儀，例如四極離子阱(QIT)或RF 線性2D四極離子阱(QLT)儀器來實(shí)施ETD。合適的參考文獻(xiàn)參見John Ε. P. Syka, Joshua J. Coon, Melanie J. Schroeder, Jeffrey Shabanowitz 禾口 Donald F. Hunt, PNAS, 101 卷，26 號，第 9528-9533 頁。雖然斷裂方法不作特別限定，但最優(yōu)選的實(shí)施方式是通過碰撞誘導(dǎo)解離進(jìn)行斷 m農(nóng)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明方法在步驟d)之后包括產(chǎn)生步驟(d)的多個片段離子 的質(zhì)譜圖的其它步驟。可利用步驟d)后產(chǎn)生的質(zhì)譜圖，通過鑒定該質(zhì)譜圖中靶分析物的一 個或多個特征性片段離子來鑒定該靶分析物。圖譜中產(chǎn)生的片段離子可用于數(shù)據(jù)庫檢索， 特別是用于肽分析物以測定該分析物的身份。步驟(d)中的斷裂可從質(zhì)量標(biāo)簽上切割一部分質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)，如果產(chǎn)生，可在 質(zhì)譜圖中觀察到代表質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的諸峰。然而，如果用該質(zhì)譜圖檢測樣品中靶分析物 的含量，會因步驟(d)中存在標(biāo)記的污染物而產(chǎn)生不精確的結(jié)果。在步驟d)中斷裂后，在步驟e)中選擇第二質(zhì)荷比等于捕獲至少一個完整質(zhì)量標(biāo) 簽的靶分析物的片段離子的離子。如上所述，當(dāng)樣品是復(fù)雜混合物時，步驟C)可選擇大量離子，包括靶分析物和具 有相同質(zhì)量的其它污染性離子。因此，對與步驟c)中選擇的離子相連的質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo) 記物基團(tuán)作分析提供的定量結(jié)果不能精確代表靶分析物的含量。為克服該局限性，步驟e) 提供對有待進(jìn)一步分析的靶分析物作進(jìn)一步選擇的步驟。質(zhì)荷比等于包含至少一個完整質(zhì) 量標(biāo)簽的靶分析物的片段離子確保質(zhì)譜圖中除去了步驟c)中選擇的污染性分子。在步驟(e)中，第二質(zhì)荷比優(yōu)選等于包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽的靶分析物的片 段離子，該片段離子是該靶分析物獨(dú)有的。步驟(e)中選擇的第二質(zhì)荷比可以是步驟d)中產(chǎn)生的任何合適片段離子，所述片 段離子包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽。第二質(zhì)荷比可以等于a_系列離子、b_系列離子、C-系列離子、X-系列離子、y_系 列離子或ζ-系列離子?？筛鶕?jù)各離子的產(chǎn)生量選擇在步驟e)中選擇的離子類型。例如， 可將肽主要斷裂成b-系列離子，bl離子可以是最主要的離子。最主要的離子確保在步驟 h)的質(zhì)譜圖中產(chǎn)生質(zhì)量報道基團(tuán)的良好信號。還可根據(jù)所需的選擇性程度選擇步驟e)中所選的離子類型。步驟e)中所選的較 大片段離子提供更好的靶分析物選擇性。例如，選擇bl離子可區(qū)分在N-末端具有不同氨 基酸的肽。然而，如果需要更高的選擇性來區(qū)分具有相同bl離子的肽，可選擇較大的離子， 例如1^2或b3離子。如果步驟d)中的斷裂產(chǎn)生具有相同質(zhì)量的不同系列離子，也最好選擇 較大的離子?？蔀楸景l(fā)明方法個別確定步驟e)中所選離子的最近類型以，例如利用MS-數(shù)據(jù)結(jié) 果或計算機(jī)方法。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，在步驟e)中選擇第二質(zhì)荷比，例如bl離子或yl離 子，對所選片段離子實(shí)施步驟f)到h)。然后可重復(fù)步驟e)到h)，在步驟e)中選擇的第二質(zhì)荷比確保選擇較大的離子，例如或y2。然后可比較較大離子的結(jié)果與較小離子的結(jié)果 作為檢查手段以確保該結(jié)果精確反映樣品中靶分析物的含量。所述第二質(zhì)荷比宜等于包含完整質(zhì)量標(biāo)簽的y_系列離子。例如，y_系列離子可 以是yl離子、12離子、y3離子等，只要該離子包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第二質(zhì)荷比等于包含完整質(zhì)量標(biāo)簽的b_系列離 子。例如，所述b-系列離子可以是bl離子、1^2離子、b3離子等，只要該離子包含至少一個 完整的質(zhì)量標(biāo)簽。與在步驟(C)中選擇的第一質(zhì)荷比相比，諸如y_系列離子或b_系列離子等離子 優(yōu)選具有較高的質(zhì)荷比。步驟e)中選擇的離子的電荷狀態(tài)比步驟(c)中選擇的離子的電 荷狀態(tài)小一，但與在步驟(c)中選擇的離子的電荷狀態(tài)相比，具有較高的質(zhì)荷比。這確保選 擇的離子出現(xiàn)在質(zhì)譜圖中非常干凈的部分而沒有任何污染離子，從而提供優(yōu)秀的信噪比?？筛鶕?jù)步驟e)中優(yōu)選的片段離子控制與靶分析物相連的質(zhì)量標(biāo)簽的數(shù)量和定 位。例如，當(dāng)分析物是肽并且優(yōu)選b-系列離子時，可控制標(biāo)記以確保該肽在N-末端連接于 質(zhì)量標(biāo)簽。如果優(yōu)選y_系列離子，可控制標(biāo)記以確保該肽在C-末端連接于質(zhì)量標(biāo)簽。優(yōu)選在步驟e)中選擇b_系列離子并重復(fù)在步驟e)中選擇y_系列離子的方法。 在該實(shí)施方式中，可控制標(biāo)記以確保該肽在C-末端和N-末端連接于質(zhì)量標(biāo)簽。例如，如果 靶分析物是肽并且賴氨酸的氨基-末端胺官能團(tuán)和C-末端ε -胺官能團(tuán)連接于質(zhì)量標(biāo)簽， 產(chǎn)生的I—離子在賴氨酸上具有一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽，或者產(chǎn)生的b-離子具有一個完整的 N-末端質(zhì)量標(biāo)簽。斷裂步驟d)可產(chǎn)生假y_離子，其代表失去一個質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)加上，例如鄰近羰 基的全長肽，電荷狀態(tài)表現(xiàn)為-1。這些離子不可用于步驟e)中的選擇，因?yàn)樗鼈兛珊衜/ ζ和電荷狀態(tài)與也僅喪失一個質(zhì)量報道基團(tuán)的靶分析物相同的污染物，如果分析物僅連接 于一個質(zhì)量標(biāo)簽，則該離子不會產(chǎn)生包含完整質(zhì)量標(biāo)簽的片段。在步驟e)中選擇具有第二質(zhì)荷比的離子后，在步驟f)中將這些離子斷裂成多個 其它片段離子，其中所述其它片段離子的一部分是質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子。由于步驟e)中的選擇使得靶分析物的離子通過進(jìn)一步分析，從斷裂步驟f)釋放 的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)僅來自靶分析物，得到的質(zhì)譜圖提供靶分析物的精確定量結(jié)果。所述其它離子的一部分是質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子表示高于0%的片段離子是質(zhì)量 標(biāo)記物基團(tuán)的離子。所述其它片段離子的質(zhì)譜圖在步驟g)中產(chǎn)生，因此，質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán) 的離子部分足以從質(zhì)譜圖中測定各樣品中靶分析物的含量?？赏ㄟ^以上步驟d)所述的任何方法進(jìn)行步驟f)中的斷裂。與步驟d)中所用能 量相比，斷裂步驟f)中所用的能量最好較高以確保切割其余質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)。 步驟f)中優(yōu)選利用碰撞室而非離子阱，因?yàn)樵摬襟E中最好產(chǎn)生連續(xù)斷裂。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明方法在步驟(f)后包括選擇質(zhì)荷比范圍等于質(zhì)量報道 基團(tuán)的質(zhì)荷比范圍的離子的其它步驟。該第三選擇步驟確保僅有質(zhì)量報道基團(tuán)的離子進(jìn)入 步驟g)中產(chǎn)生的質(zhì)譜圖，藉此除去任何污染物。在步驟f)中斷裂后，在步驟g)中產(chǎn)生所述其它片段離子的質(zhì)譜圖。在步驟h)中，從步驟g)中產(chǎn)生的質(zhì)譜圖測定各樣品中靶分析物的含量。該步驟 優(yōu)選包括鑒定對應(yīng)于質(zhì)譜圖中質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的片段離子并根據(jù)該質(zhì)譜圖中它們的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的量來測定各樣品中分析物的含量。在分析一個或多個校準(zhǔn)樣品的 實(shí)施方式中，步驟h)包括根據(jù)相關(guān)質(zhì)譜圖中質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的量，相對于同一質(zhì)譜圖中校 準(zhǔn)樣品各試樣的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的量來測定測試樣品中分析物的量。如上所述，分析物的 測定量可以是分析物的絕對量或定性量。測試樣品可來自天然來源或可合成產(chǎn)生。合成樣品的例子是重組蛋白的混合物。 在一個實(shí)施方式中，測試樣品是復(fù)雜的混合物，例如來自植物或動物的樣品。在優(yōu)選的實(shí)施 方式中，樣品來自人。本發(fā)明檢驗(yàn)的測試樣品的例子包括哺乳動物組織、液體，例如血液、血漿、血清、 腦脊液、滑膜液、眼水(ocular fluid)、尿液、淚水和淚小管滲出液，肺抽吸物，包括支氣管 肺泡灌洗液，唾液、痰、母乳、乳頭抽吸物、精液、灌洗液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞系和亞細(xì)胞細(xì)胞 器，組織，例如實(shí)體器官組織，衍生自哺乳動物、魚、禽類、昆蟲、環(huán)節(jié)動物、原生動物和細(xì)菌 的細(xì)胞培養(yǎng)上清液或制品，組織培養(yǎng)提取物、植物組織、植物液體、植物細(xì)胞培養(yǎng)提取物、細(xì) 菌、病毒、真菌、發(fā)酵肉湯培養(yǎng)液、食物、藥物和任何中間產(chǎn)物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，測試樣品是血液的血漿。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，測試樣 品是貧化血漿(cbpleted plasma)。該血漿經(jīng)純化除去了大多數(shù)豐富的血漿蛋白質(zhì)，例如白 蛋白，從而降低樣品中的蛋白質(zhì)負(fù)載，從而減少樣品中的分析物數(shù)量和總蛋白含量。待檢驗(yàn)樣品的校準(zhǔn)樣品可以是天然樣品，例如體液或組織提取物，或可以是合成 的。校準(zhǔn)樣品可包含重組表達(dá)的蛋白質(zhì)、合成制備的肽或寡核苷酸。此外，可通過重組蛋白 表達(dá)以串聯(lián)順序產(chǎn)生許多不同的肽。歐洲專利申請EP 1736480公開的方法產(chǎn)生多種參比 肽作為串聯(lián)重組蛋白質(zhì)從而類似于AQUA方法的方式用于多反應(yīng)監(jiān)測實(shí)驗(yàn)。按照本發(fā)明的 任何方面，此類產(chǎn)生方法可與同量異序質(zhì)量標(biāo)簽聯(lián)用以提供校準(zhǔn)樣品。校準(zhǔn)樣品可以是待檢驗(yàn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)化形式。校準(zhǔn)樣品可包含待檢驗(yàn)樣品的所有組 分，但其含量是特定的。例如，校準(zhǔn)樣品可包含以下物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化制品哺乳動物組織、液 體，例如血液、血漿、血清、腦脊液、滑膜液、眼水、尿液、淚水和淚小管滲出液，肺抽吸物，包 括支氣管肺泡灌洗液，唾液、痰、母乳、乳頭抽吸物、精液、灌洗液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞系和亞 細(xì)胞細(xì)胞器，組織，例如實(shí)體器官組織，衍生自哺乳動物、魚、禽類、昆蟲、環(huán)節(jié)動物、原生動 物和細(xì)菌的細(xì)胞培養(yǎng)上清液或制品，組織培養(yǎng)提取物、植物組織、植物液體、植物細(xì)胞培養(yǎng) 提取物、細(xì)菌、病毒、真菌、發(fā)酵肉湯培養(yǎng)液、食物、藥物和任何中間產(chǎn)物。如果感興趣的分析 物是蛋白質(zhì)，由于校準(zhǔn)樣品中的所有蛋白質(zhì)均作標(biāo)記，可利用此類樣品的完整蛋白質(zhì)組作 為研究樣品的所有蛋白質(zhì)的參比?；蛘?，校準(zhǔn)樣品可僅包含樣品中待檢驗(yàn)的分析物，而不含樣品中的任何其它組分。 可制備并外源性同量異序標(biāo)記包含一種或多種分析物的校準(zhǔn)樣品，將其加入含有分析物的 復(fù)雜混合物中。例如，如果樣品是血漿樣品，但僅要檢驗(yàn)該血漿樣品中特定的蛋白質(zhì)，可制 備包含重組形式蛋白質(zhì)的不同試樣的校準(zhǔn)樣品。在其它方法中，校準(zhǔn)樣品的各試樣中分析物的絕對量未知。在該實(shí)施方式中，校準(zhǔn) 樣品的各試樣中分析物的含量是已知的定性量。校準(zhǔn)步驟包括根據(jù)校準(zhǔn)樣品的試樣中分析 物的定性量和測定量來校準(zhǔn)測試樣品中分析物的含量。在特定的實(shí)施方式中，定性量是具 有特定狀態(tài)，例如健康或患病狀態(tài)的對象中分析物含量的預(yù)計范圍。提供此類校準(zhǔn)樣品以 便相對定量的試驗(yàn)的適用范圍很廣，包括生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)、工業(yè)微生物、藥物和食品制造以及人和獸醫(yī)學(xué)疾病的診斷和控制。分析復(fù)雜的生物學(xué)樣品，例如血液血漿時，?？捎孟鄬Χ繉?shí)驗(yàn)。在具體的實(shí)施方 式中，將大量的完整人血液血漿分成數(shù)份(即，四份)試樣，各用不同的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽 標(biāo)記。例如，一種可利用TMT六聚體以產(chǎn)生血液血漿的四份標(biāo)記試樣?？衫肨MT6-128、 TMT6-129、TMT6-130、TMT6_131作標(biāo)記。用該同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的另一種不同形式，即 TMT6-126標(biāo)記血液血漿研究的所有各份樣品?，F(xiàn)在可利用血液血漿的試樣產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線， 例如以0. 5-1-2-5 μ L比例混合四份試樣產(chǎn)生校準(zhǔn)樣品，然后加入1 μ L研究樣品。通過混 合樣品與包含四種差異性標(biāo)記的試樣的校準(zhǔn)樣品，實(shí)際上，用此材料進(jìn)行的所有實(shí)驗(yàn)會產(chǎn) 生多組5標(biāo)志-離子-4個來自校準(zhǔn)樣品，1個來自測試樣品。因此，4-點(diǎn)校準(zhǔn)曲線中可利 用完整的蛋白質(zhì)組。如果給該研究的所有測試樣品摻加相同量的校準(zhǔn)樣品，可能相對定量 所有研究樣品。由于多個實(shí)驗(yàn)室可利用校準(zhǔn)樣品，交叉研究和交叉實(shí)驗(yàn)室比較是可能的。雖然分析物的絕對量可能未知，但可從校準(zhǔn)曲線計算含量的變化百分比?？筛鶕?jù) 應(yīng)用調(diào)節(jié)校準(zhǔn)曲線的比例和幅度。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇校準(zhǔn)樣品的各不同試樣中分析物的含量以反映測試樣 品中分析物的已知或懷疑的變化。在還要進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施方式中，所提供試樣包含的分 析物量對應(yīng)于健康或患病對象的測試樣品中發(fā)現(xiàn)的分析物的已知或懷疑含量范圍的上限 和下限，及任選的中間點(diǎn)。由于各分析物獨(dú)立于樣品中所有其它分析物定量，制備濃度彼此極為不同的多組 校準(zhǔn)樣品的可能的，從而提高該實(shí)驗(yàn)的動態(tài)范圍。還可能制備各分析物的多個參比生物分 子，其中各生物分子的含量范圍重疊以便延伸給定分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線的總范圍。例如，根據(jù) 在串聯(lián)質(zhì)譜儀中的性能，可選擇靶蛋白的許多不同胰蛋白酶肽以便用作參比標(biāo)準(zhǔn)?？筛鶕?jù) 對應(yīng)于質(zhì)譜圖中肽的離子的離子強(qiáng)度或根據(jù)對應(yīng)于肽的離子在圖譜中出現(xiàn)的區(qū)域的信噪 比選擇參比肽?；蛘撸蛇x擇參比肽以避免具有同量異序物質(zhì)的肽。尤其宜選擇蛋白型肽， 即，僅在特定蛋白質(zhì)中存在的肽。如果用同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的六聚體集合的最多5個不同成員獨(dú)立標(biāo)記各標(biāo)準(zhǔn)肽， 可將這些成員以不同比例混合以提供5-點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。可利用相同的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽來 標(biāo)記第二、第三、第四或更多的標(biāo)準(zhǔn)肽，各肽可以不同比例混合以涵蓋與同一分析物的其它 參比肽各自涵蓋所不同的濃度范圍。產(chǎn)生衍生自靶蛋白的各肽的不同校準(zhǔn)曲線，各校準(zhǔn)曲線涵蓋不同濃度范圍。然后 從其各自的校準(zhǔn)曲線測定各肽的濃度，該濃度可向回與靶蛋白的濃度關(guān)聯(lián)。對于一些校準(zhǔn) 曲線，測試樣品中肽的含量可落在校準(zhǔn)曲線的中部，從而精確測定其在樣品中的實(shí)際含量。 對于涵蓋不同濃度范圍的其它校準(zhǔn)曲線，測試樣品中肽的含量可落在校準(zhǔn)曲線范圍外。我 們可利用各自衍生自單一感興趣分析物的多種肽來產(chǎn)生與同一分析物相關(guān)的多條校準(zhǔn)曲 線，然后選擇最精確的校準(zhǔn)曲線以便從一種或多種肽的濃度測定測試樣品中分析物的濃 度。以此方式可涵蓋較寬的動態(tài)范圍而不損害試驗(yàn)靈敏度。校準(zhǔn)樣品可包含常規(guī)量的分析物。校準(zhǔn)樣品中分析物的含量可表明植物、動物或 優(yōu)選人是健康的?；蛘撸?zhǔn)樣品包含的分析物的含量可表明有特定疾病存在和/或其階 段。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，校準(zhǔn)樣品包含的分析物的含量可表明治療效力和/或毒性。制 備具有特定性質(zhì)，例如疾病的存在和/或階段、對治療的反應(yīng)和/或毒性的已知標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)
22組?？蓮幕加谐浞直碚鞯募膊〉幕颊咧苽浒慨愋蛸|(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的體液或組織提取物 的校準(zhǔn)樣品，所述疾病包括但不限于腫瘤、神經(jīng)變性、心血管、腎臟、肝臟、呼吸、代謝、炎性 和感染性疾病。將已知量的此類樣品加入多份測試樣品，該方式可根據(jù)共同校準(zhǔn)樣品的離 子強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)譜圖中一系列分析離子強(qiáng)度，從而在不同分析之間作更精確的比較，降低 研究的分析差異性。以冠心病藥物為例，合成產(chǎn)生從胰蛋白酶消化已知心臟病標(biāo)記，例如肌紅蛋白、肌 鈣蛋白-I、CK-MB, BNP, pro-BNP和NT-pro_BNP獲得的一系列肽，分成三份試樣。各參比 肽的各試樣用，例如此類同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的集合的三種同量異序質(zhì)量標(biāo)簽之一標(biāo)記，其 中質(zhì)譜法檢測到該集合中的所有標(biāo)簽基本上具有相同的合計質(zhì)量，在質(zhì)譜儀中經(jīng)碰撞誘導(dǎo) 解離后該集合中各標(biāo)簽釋放質(zhì)量獨(dú)特的質(zhì)量標(biāo)志離子。然后將已知濃度的各獨(dú)特的參比 肽-質(zhì)量標(biāo)簽分子加入運(yùn)載體溶液，例如質(zhì)譜-相容緩沖液，從而同一參比肽的三種差異性 標(biāo)記試樣的濃度不同，該不同橫跨患有心臟病的患者中母體蛋白質(zhì)的正常生物學(xué)濃度。將 規(guī)定體積比的得到的參比肽組加入已用與標(biāo)記參比肽相同的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽集合中的 第四同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的測試樣品。然后對摻加的樣品進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法，其中以直接 模式進(jìn)行全譜掃描從而僅鑒定具有各同量異序標(biāo)記參比肽相關(guān)的特征性保留時間和質(zhì)量 的那些前體離子。對于各選擇離子，質(zhì)譜圖將含有衍生自高、中和低濃度參比肽和測試樣品 的標(biāo)志離子。從參比肽標(biāo)志離子強(qiáng)度不難構(gòu)建簡單的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可根據(jù)校準(zhǔn)曲線讀數(shù)測試樣品 中同一肽的第四標(biāo)志離子。這表示可在一次實(shí)驗(yàn)中測定多種生物學(xué)相關(guān)蛋白質(zhì)的絕對濃 度。技術(shù)人員可知道制備參比肽的不同蛋白質(zhì)的數(shù)量無需具體限定，可以是1-100，最優(yōu)選 1-50的范圍。類似地，代表性肽的數(shù)量可以是1-20、優(yōu)選1-10、更優(yōu)選1-5和最優(yōu)選1_3的 范圍。技術(shù)人員會知曉上述例子是通用例子，其中描述的原理可適用于任何疾病的已知標(biāo) 志并適用于疾病診斷、監(jiān)測疾病進(jìn)展或監(jiān)測患者對治療的反應(yīng)。其它應(yīng)用在于這些校準(zhǔn)樣品在時程實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。如果不同試樣(四)來自四個 不同時間點(diǎn)，例如零時、1小時、8小時和M小時，可在某實(shí)驗(yàn)(小鼠和人中的藥物攻擊，誘 導(dǎo)大腸桿菌和酵母菌發(fā)酵)中，對于慢性疾病的產(chǎn)生或治療反應(yīng)還在數(shù)周和數(shù)月也可在較 長時間尺度上建立關(guān)于時程的樣品“狀態(tài)”。技術(shù)人員應(yīng)知道同量異序質(zhì)量標(biāo)簽的性質(zhì)不作具體限制。本領(lǐng)域已知各種合適 的同量異序治療標(biāo)記物，例如在WO 01/68664(通過引用納入本文)和WO 03/025576 (通 過引用納入本文)中公開的串聯(lián)治療標(biāo)簽(Thompson等，2003，Anal. Chem. 75 (8) 1895-1904(通過引用納入本文))、在US68M981(通過引用納入本文)中公開的iPROT 標(biāo)簽禾口 iTRAQ 標(biāo)簽(Pappin 等，2004，Methods in Clinical Proteomics Manuscript M400129-MCP200(通過引用納入本文))。任何這些同量異序治療標(biāo)記物適于制備樣品和校 準(zhǔn)樣品及實(shí)施本發(fā)明方法。雖然本發(fā)明所用質(zhì)量標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)未作具體限定，只要它們是同量異序的并具有質(zhì) 譜學(xué)上不同的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)(部分)，但在優(yōu)選的實(shí)施方式中，質(zhì)量標(biāo)簽包含以下結(jié)構(gòu)X-L-M其中X是質(zhì)量標(biāo)記物部分，L是可切割的接頭，M是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分。L可以是單 鍵，或X的一部分或M的一部分。這些質(zhì)量標(biāo)簽可以連接于測試或校準(zhǔn)樣品中分析物的任何點(diǎn)，例如通過M、L或X。它們優(yōu)選通過M相連，例如標(biāo)記物可包含以下結(jié)構(gòu)(X-L-M)-。這通常經(jīng)由在質(zhì)量標(biāo)簽中包含反應(yīng)活性官能團(tuán)使之能結(jié)合分析物得到實(shí)現(xiàn)，例 如X-L-M-反應(yīng)活性官能團(tuán)。當(dāng)標(biāo)記物包含反應(yīng)活性官能團(tuán)時，這些標(biāo)記物稱為反應(yīng)活性質(zhì)量標(biāo)簽。將質(zhì)量標(biāo)簽連接于分析物的反應(yīng)活性官能團(tuán)不作具體限定，可包含任何合適的反 應(yīng)活性基團(tuán)。本文所用的術(shù)語質(zhì)量標(biāo)簽應(yīng)指適于標(biāo)記分析物以便測定的部分。術(shù)語標(biāo)記物是術(shù) 語標(biāo)簽的同義詞。本文所用的術(shù)語質(zhì)量標(biāo)記物部分應(yīng)指有待通過質(zhì)譜法檢測的部分。術(shù)語質(zhì)量標(biāo)記 物部分是術(shù)語質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)或術(shù)語報道基團(tuán)的同義詞。本發(fā)明質(zhì)量標(biāo)記物部分的各組分 優(yōu)選耐受斷裂，從而可通過引入易于為以下方式打斷的連接鍵來控制標(biāo)志斷裂的位點(diǎn)碰 撞誘導(dǎo)解離(CID)、表面誘導(dǎo)解離、電子俘獲解離(ECD)、電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)或快速原子轟 擊。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，不難通過CID斷裂所述連接鍵。本文所用的術(shù)語質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分應(yīng)指無需通過質(zhì)譜法檢測的部分，但其存在確保 質(zhì)量標(biāo)簽具有所需合計質(zhì)量。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分不作具體限定，僅用于改變質(zhì)量標(biāo)簽的總質(zhì)量。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，質(zhì)量標(biāo)簽的合計分子量是600道爾頓或低一些，更優(yōu)選500 道爾頓或低一些，還要優(yōu)選400道爾頓或低一些，最優(yōu)選300-400道爾頓。質(zhì)量標(biāo)簽的特別 優(yōu)選的分子量是324、338、339和380道爾頓。這些優(yōu)選的實(shí)施方式尤其有利，因?yàn)橘|(zhì)量標(biāo) 簽體積小意味著用質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記時待檢測肽的體積增加最少。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，質(zhì)量標(biāo)記物部分的分子量是300道爾頓或低一些，優(yōu)選250 道爾頓或低一些，更優(yōu)選100-250道爾頓，最優(yōu)選100-200道爾頓。這些優(yōu)選的實(shí)施方式尤 其有利，因?yàn)橘|(zhì)量標(biāo)記物部分體積小意味著其在質(zhì)譜圖的沉默區(qū)產(chǎn)生峰，從而易在質(zhì)譜圖 中鑒別質(zhì)量標(biāo)志，還能靈敏地定量。質(zhì)量標(biāo)記物部分的特別優(yōu)選的分子量是125、1沈、153和IM道爾頓，或者其中一 個或多個或所有的12C原子被13C原子取代的重量，例如未取代的質(zhì)量標(biāo)記物部分的重量 是125，其用1、2、3、4、5和6個13C原子分別相應(yīng)取代的質(zhì)量是126、127、128、129、130和 131道爾頓，和/或一個或多個或所有的14N原子被15N原子取代。本文所用的術(shù)語質(zhì)譜圖的沉默區(qū)應(yīng)指質(zhì)譜圖中與存在標(biāo)記肽斷裂產(chǎn)生的片段相 關(guān)各峰造成的背景“噪聲”低的區(qū)域。因此，術(shù)語沉默區(qū)應(yīng)指質(zhì)譜圖中待檢測肽相關(guān)各峰造 成的“背景”低的區(qū)域。對于肽或蛋白質(zhì)，質(zhì)譜圖的沉默區(qū)低于200道爾頓。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)上述反應(yīng)活性質(zhì)量標(biāo)簽易與蛋白質(zhì)快速反應(yīng)以形成標(biāo)記的蛋白 質(zhì)。本發(fā)明采用兩種或更多種質(zhì)量標(biāo)簽的集合。這些集合中標(biāo)記物是具有不同質(zhì)量的 質(zhì)量標(biāo)志的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽。因此，該集合中各標(biāo)記物如上所述，其中各質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分 確保質(zhì)量標(biāo)簽具有所需合計質(zhì)量，其中該集合包含具有質(zhì)量標(biāo)記物部分的質(zhì)量標(biāo)簽，各質(zhì) 量標(biāo)記物部分具有不同于該集合中所有其它質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)量，該集合中各標(biāo)記物具有共同的合計質(zhì)量；其中質(zhì)譜學(xué)顯示該集合中所有質(zhì)量標(biāo)簽彼此不同。術(shù)語“同量異序”表示質(zhì)譜法測定質(zhì)量標(biāo)簽具有基本上相同的合計質(zhì)量。同量異 序質(zhì)量標(biāo)簽的平均分子量通常落在彼此士0. 5Da的范圍內(nèi)。術(shù)語“標(biāo)記物”應(yīng)是術(shù)語“標(biāo) 簽”的同義詞。就本發(fā)明而言，技術(shù)人員應(yīng)知道術(shù)語“質(zhì)量標(biāo)記物部分”和術(shù)語“報道基團(tuán)” 可互換使用。集合中標(biāo)記物的數(shù)量不作特別限定，只要該集合包含多個標(biāo)記物即可。然而，如果 集合包括兩個或多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個標(biāo)記物是優(yōu)選的，更優(yōu) 選六個或更多個標(biāo)記物，最優(yōu)選八個或更多個標(biāo)記物。本文的術(shù)語合計質(zhì)量指質(zhì)量標(biāo)簽的總質(zhì)量，S卩，質(zhì)量標(biāo)記物部分、可切割接頭、質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)化部分和質(zhì)量標(biāo)簽的任何其它組分的質(zhì)量之和。該集合中各質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分的質(zhì)量不同。各質(zhì)量標(biāo)簽中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部 分的質(zhì)量等于共同的合計質(zhì)量減去該質(zhì)量標(biāo)簽中具體質(zhì)量標(biāo)記物部分的質(zhì)量再減去可切 割接頭的質(zhì)量。質(zhì)譜學(xué)顯示集合中所有質(zhì)量標(biāo)簽彼此不同。因此，質(zhì)譜儀可區(qū)分質(zhì)量標(biāo)簽，即，衍 生自質(zhì)量標(biāo)簽的各峰可以清楚地彼此分開。質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)之間的質(zhì)量差異表示質(zhì)譜儀可 區(qū)分衍生自不同質(zhì)量標(biāo)簽或質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子。本發(fā)明還可采用包含上述兩個或更多個質(zhì)量標(biāo)簽集合的質(zhì)量標(biāo)簽陣列，其中該陣 列中任一集合的各質(zhì)量標(biāo)簽的合計質(zhì)量不同于各其它集合中各質(zhì)量標(biāo)簽的合計質(zhì)量。 在優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式中，質(zhì)量標(biāo)簽的陣列優(yōu)選在化學(xué)上均相同(在化學(xué)上基 本相同)。術(shù)語“化學(xué)上基本相同”表示質(zhì)量標(biāo)簽具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中可引入 特定同位素取代或者可連接特定取代基。在進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明實(shí)施方式中，質(zhì)量標(biāo)簽可包含靈敏度增強(qiáng)基團(tuán)。所述質(zhì)量 標(biāo)簽優(yōu)選具有以下形式靈敏度增強(qiáng)基團(tuán)-X-L-M-反應(yīng)活性官能團(tuán)。在該例子中，靈敏度增強(qiáng)基團(tuán)通常連接于質(zhì)量標(biāo)記物部分，因?yàn)榇蛩阍黾釉摬糠?在質(zhì)譜儀中的檢測靈敏度。顯示有反應(yīng)活性官能團(tuán)存在并連接于與靈敏度增強(qiáng)基團(tuán)不同的 部分。然而，無需以此方式限定質(zhì)量標(biāo)簽，在一些情況中，靈敏度增強(qiáng)基團(tuán)可連接于與反應(yīng) 活性官能團(tuán)相同的部分。現(xiàn)在更詳細(xì)地描述本發(fā)明中用于標(biāo)記分析物的質(zhì)量標(biāo)簽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，X是包含以下基團(tuán)的質(zhì)量標(biāo)記物部分
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)靶分析物的方法，該方法包括(a)提供可包含靶分析物的多個樣品，其中各樣品用質(zhì)量標(biāo)簽或質(zhì)量標(biāo)簽的組合作差 異性標(biāo)記，所述質(zhì)量標(biāo)簽來自質(zhì)量標(biāo)簽的集合，各質(zhì)量標(biāo)簽是包含質(zhì)譜上不同的質(zhì)量標(biāo)記 物基團(tuán)的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽，從而可通過質(zhì)譜法區(qū)分這些樣品；(b)混合所述多個標(biāo)記樣品以產(chǎn)生分析混合物并將所述分析混合物引入質(zhì)譜儀；(c)選擇具有第一質(zhì)荷比的離子，該第一質(zhì)荷比等于用特定數(shù)量的質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶 分析物的離子；(d)使具有該第一質(zhì)荷比的離子斷裂成多個片段離子，其中所述多個片段離子的一部 分包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽；(e)選擇具有第二質(zhì)荷比的離子，該第二質(zhì)荷比等于包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽的靶 分析物的片段的離子；(f)使具有該第二質(zhì)荷比的離子斷裂成多個其它片段離子，其中所述其它片段離子的 一部分是所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子；(g)產(chǎn)生在步驟(f)中產(chǎn)生的其它片段離子的質(zhì)譜圖；和(h)由所述質(zhì)譜圖測定各樣品中靶分析物的含量量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，一個樣品是測試樣品，一個樣品是校準(zhǔn)樣 品，其中所述校準(zhǔn)樣品包含靶分析物的一個或多個不同試樣，各試樣具有已知量的該分析 物，其中所述測試樣品和所述校準(zhǔn)樣品的各試樣作差異性標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個樣品可包含多個不同靶分析物，所 述方法包括為各靶分析物重復(fù)步驟(c)到(h)的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，一個樣品是測試樣品并提供各不同分析物 的校準(zhǔn)樣品，其中各校準(zhǔn)樣品包含靶分析物的一個或多個不同試樣，其中所述測試樣品和 各校準(zhǔn)樣品的各試樣作差異性標(biāo)記。
5.如權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述校準(zhǔn)樣品或各校準(zhǔn)樣品包 含所述靶分析物的兩個或更多個不同試樣。
6.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，為分析物檢驗(yàn)多個測試樣品。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，為同一分析物檢驗(yàn)所述多個測試樣品的每 一個。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，用一個或多個所述同量異序質(zhì)量標(biāo)簽差異 性標(biāo)記各測試樣品。
9.如權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括在步驟(a)之前用 一個或多個同量異序質(zhì)量標(biāo)簽差異性標(biāo)記各測試樣品和校準(zhǔn)樣品各試樣的其它步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(a)之前還包括混合差異性標(biāo)記的 試樣以產(chǎn)生校準(zhǔn)樣品的其它步驟。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個樣品是測試樣品。
12.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(h)中測定的量是各樣品 中靶分析物的相對量。
13.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(h)中測定的量是各樣品 中靶分析物的絕對量。
14.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(d)之后包括 產(chǎn)生步驟(d)的多個片段離子的質(zhì)譜圖的其它步驟。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，通過鑒定該質(zhì)譜圖中靶分析物的一個或 多個特征性片段離子來測定該靶分析物的身份。
16.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(f)后包括選 擇質(zhì)荷比范圍等于質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)荷比范圍的離子的其它步驟。
17.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述第一質(zhì)荷 比等于用特定數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的未斷裂母體離子的質(zhì)荷比。
18.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述第一質(zhì)荷 比等于用特定數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的片段離子的質(zhì)荷比。
19.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述第二質(zhì)荷 比等于包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽的靶分析物的片段離子，該片段離子是該靶分析物獨(dú)有 的。
20.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述第二質(zhì)荷 比是包含完整質(zhì)量標(biāo)簽的一個y_系列離子的質(zhì)荷比。
21.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述第二質(zhì)荷 比是包含完整質(zhì)量標(biāo)簽的一個b-系列離子的質(zhì)荷比。
22.如權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，與在步驟(c)中選擇的第 一質(zhì)荷比相比，所述y_系列離子或b-系列離子具有較高的質(zhì)荷比。
23.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述靶分析物選自蛋白質(zhì)、多 肽、肽、氨基酸或核酸、或它們的片段。
24.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在質(zhì)譜儀的不同四極中進(jìn)行步 驟(c)-(g)。
25.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在質(zhì)譜儀的同一區(qū)域中順序 進(jìn)行步驟(c)-(g)。
26.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述樣品之一包含含有觸發(fā) 分析物的觸發(fā)試樣，所述方法在步驟(b)之后和步驟(c)之前包括檢測質(zhì)荷比等于所述觸 發(fā)分析物質(zhì)荷比的離子的其它步驟，其中檢測到質(zhì)荷比等于所述觸發(fā)分析物質(zhì)荷比的離子 時，步驟(c)啟動。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于，用同量異序質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記所述觸發(fā)試樣 中的觸發(fā)分析物。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于，用化學(xué)上相同但同位素不同并且質(zhì)量與 所述樣品中其它分析物的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽不同的質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記所述觸發(fā)試樣中的觸發(fā) 分析物。
29.如以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量標(biāo)簽包含以下結(jié)構(gòu)X-L-M式中，χ是包含以下基團(tuán)的質(zhì)量標(biāo)記物部分
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其特征在于，將所述質(zhì)量標(biāo)記物部分連接于所述質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)化部分的所述可切割接頭是可通過碰撞切割的接頭。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述接頭可利用質(zhì)譜法通過CID、ETD、E⑶ 或SID切割。
32.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記步驟包括將所述分析物與反應(yīng)活 性質(zhì)量標(biāo)簽反應(yīng)的步驟，其中所述反應(yīng)活性質(zhì)量標(biāo)簽包含質(zhì)量標(biāo)簽和反應(yīng)活性官能團(tuán)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)活性官能團(tuán)能與多肽上的任何 氨基反應(yīng)，包括親核試劑或親電試劑。
34.如權(quán)利要求32或權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量標(biāo)簽是標(biāo)記和通 過質(zhì)譜法檢測多肽的反應(yīng)活性質(zhì)量標(biāo)簽，其中所述質(zhì)量標(biāo)簽包含將所述質(zhì)量標(biāo)簽連接于多 肽的反應(yīng)活性官能團(tuán)，所述反應(yīng)活性官能團(tuán)包含以下基團(tuán)
35.如權(quán)利要求四-34中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量標(biāo)簽是來自兩種或 更多種質(zhì)量標(biāo)簽的集合的質(zhì)量標(biāo)簽，其中各質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分確保所述質(zhì)量標(biāo)簽具有所需合 計質(zhì)量，其中該集合包含具有質(zhì)量標(biāo)記物部分的質(zhì)量標(biāo)簽，各質(zhì)量標(biāo)記物部分具有不同于 該集合中所有其它質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)量，該集合中各標(biāo)記物具有共同的合計質(zhì)量；其中 質(zhì)譜學(xué)顯示該集合中所有質(zhì)量標(biāo)簽彼此不同。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述集合中的各質(zhì)量標(biāo)簽具有選自以下 的質(zhì)量調(diào)節(jié)部分(a)位于質(zhì)量標(biāo)記物部分內(nèi)和/或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分內(nèi)的同位素取代基，和(b)與質(zhì)量標(biāo)記物部分和/或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化部分相連的取代基原子或基團(tuán)。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分選自鹵素原子取代 基、甲基取代基和、？N、18o或13C同位素取代基。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分是1N或13C,該集合包 含具有以下結(jié)構(gòu)的兩種質(zhì)量標(biāo)簽
39.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分是1N和13C,該集合包 含具有以下結(jié)構(gòu)的五種質(zhì)量標(biāo)簽
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)量調(diào)節(jié)部分是1N和13C,該集合包 含具有以下結(jié)構(gòu)的六種質(zhì)量標(biāo)簽CN 102077092 A權(quán)利要求書5/7頁
41.一種檢驗(yàn)一種或多種靶分析物的質(zhì)譜裝置，其中所述裝置包括(i)引入可包含一種或多種靶分析物的兩個或更多個樣品的器件，其中各樣品用質(zhì)量 標(biāo)簽或質(zhì)量標(biāo)簽的組合作差異性標(biāo)記，其中各質(zhì)量標(biāo)簽是包含質(zhì)譜上不同質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán) 的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽；( )選擇具有第一質(zhì)荷比的離子的器件，所述第一質(zhì)荷比等于用特定數(shù)量的所述質(zhì)量 標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物；(iii)將具有所述第一質(zhì)荷比的離子斷裂成多個片段離子的器件，其中所述多個片段 離子的一部分包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽；(iv)選擇具有第二質(zhì)荷比的離子的器件，所述第二質(zhì)荷比等于包含至少一個完整質(zhì)量 標(biāo)簽的靶分析物的片段；(ν)將具有所述第二質(zhì)荷比的離子斷裂成多個其它片段離子的器件，其中所述其它片 段離子的一部分是所述質(zhì)量標(biāo)簽的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子；和(vi)適于選擇質(zhì)荷比范圍等于所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)荷比范圍的離子并適于產(chǎn)生 所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的質(zhì)譜圖的器件。
42.如權(quán)利要求41所述的裝置，其特征在于，適于選擇所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子的 所述器件選擇15Th范圍的質(zhì)荷比。
43.如權(quán)利要求42所述的裝置，其特征在于，適于選擇所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子的 所述器件選擇8Th范圍的質(zhì)荷比。
44.如權(quán)利要求43所述的裝置，其特征在于，所述8Th范圍是1M-131道爾頓。
45.如權(quán)利要求41-44中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，選擇具有第一質(zhì)荷比的離子 的器件僅適于選擇50道爾頓范圍的離子。
46.如權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，選擇具有第二質(zhì)荷比的離子 的器件僅適于選擇50道爾頓范圍的離子。
47.如權(quán)利要求41-46中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述裝置包括產(chǎn)生第一質(zhì)荷 比離子的多個片段離子的質(zhì)譜圖的其它器件。
48.如權(quán)利要求41-47中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述第一質(zhì)荷比等于用特定 數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的未斷裂母體離子的質(zhì)荷比。
49.如權(quán)利要求41-47中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述第一質(zhì)荷比等于用特定 數(shù)量質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的片段離子的質(zhì)荷比。
50.如權(quán)利要求41-49中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，器件(ii)、(iii)、(iv)、(ν) 和(vi)在質(zhì)譜儀中是不同的四極。
51.如權(quán)利要求41-49中任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，器件(ii)、(iii)、(iv)、(ν) 和(vi)在質(zhì)譜儀的單區(qū)域或多個區(qū)域中。
全文摘要
一種檢驗(yàn)靶分析物的方法，該方法包括(a)提供可包含靶分析物的多個樣品，其中各樣品用質(zhì)量標(biāo)簽或質(zhì)量標(biāo)簽的組合作差異性標(biāo)記，所述質(zhì)量標(biāo)簽來自質(zhì)量標(biāo)簽的集合，各質(zhì)量標(biāo)簽是包含質(zhì)譜上不同的質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的同量異序質(zhì)量標(biāo)簽，從而可通過質(zhì)譜法區(qū)分這些樣品；(b)混合所述多個標(biāo)記樣品以產(chǎn)生分析混合物并將所述分析混合物引入質(zhì)譜儀；(c)選擇具有第一質(zhì)荷比的離子，該第一質(zhì)荷比等于用特定數(shù)量的質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記的靶分析物的離子；(d)使具有該第一質(zhì)荷比的離子斷裂成多個片段離子，其中所述多個片段離子的一部分包含至少一個完整的質(zhì)量標(biāo)簽；(e)選擇具有第二質(zhì)荷比的離子，該第二質(zhì)荷比等于包含至少一個完整質(zhì)量標(biāo)簽的靶分析物的片段的離子；(f)使具有該第二質(zhì)荷比的離子斷裂成多個其它片段離子，其中所述其它片段離子的一部分是所述質(zhì)量標(biāo)記物基團(tuán)的離子；(g)產(chǎn)生在步驟(f)中產(chǎn)生的其它片段離子的質(zhì)譜圖；和(h)由所述質(zhì)譜圖測定各樣品中靶分析物的含量。
文檔編號G01N33/68GK102077092SQ200980126034
公開日2011年5月25日 申請日期2009年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者C·鮑曼, H·拜爾斯, M·沃德, P·舒爾茨納皮 申請人:電泳有限公司