專利名稱：用于初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預后生物標志物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明為預后生物標志物領域，并涉及為慢性腎臟疾病患者預測后果。
背景技術：
慢性腎臟疾病(CKD)是重要的健康問題，具有不斷增加的發(fā)病率和流行率，花費高昂并且后果不良。引入腎臟疾病后果等級主動性(Kidney Disease Outcome Quality Initiative) (K/DOQI)分類并使用估算的腎小球濾過率(eGFR)評估腎功能，已鑒定到大量患有以前未診斷的CKD的患者(國家腎臟基金會(National Kidney Foundation), Am J Kidney Dis 2002 ；39(2Suppl 1) :SU66 ；疾病控制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention) (CDC) ,Morb Mortal Wkly Rep 2007 ；56 :161-165)。然而,僅有少部分CKD患者最終發(fā)展到末期腎病(ESRD) (Clase等,BMJ 2004 ；329 :912-915)。鑒定具有CKD發(fā)展的最高風險的患者，仍然是一個挑戰(zhàn)。由于許多實驗室采納了 K/D0QI的推薦方案并日常報告GFR估算值，在未診斷CKD的篩查中獲得了顯著成功。但是，對于進一步風險分層并鑒定其他風險預測因子以對患有CKD、最可能發(fā)展到ESRD的患者進行定向干預，存在著緊迫需求。氨基端proBNP(NT-proBNP)，一種用于心血管疾病的公認預后標志物，已顯示在患有初次CKD的非糖尿病患者中預測腎臟疾病進展(Spanaus等，Clin Chem 2007 ；53 1264-1272)。A-型利尿鈉肽(ANP)和腎上腺髓質素(ADM)是強有力的降血壓劑、利尿劑和利尿鈉肽，其參與維持心血管和腎臟體內平衡(Vesely等，Cardiovasc Res 2001 ；51 :647-658 ； Bunton等，Pharmacol Ther 2004;103:179-201)。已報道在患有心血管疾病的患者和患有腎臟疾病的患者中,ANP和ADM的血漿濃度增加(Lerman等，Lancet 1993 ；341 :1105-1109 ； Jougasaki Circulation 1995 ；92 :286-289 ；Winters Biochem Biophys Res Commun 1988 ;150 :231-236 ;Ishimitsu等，J Clin Invest 1994 ;94 :2158-2161)。然而，ANP和 ADM 還從未被當做標志物來預測腎臟疾病的發(fā)展。腎上腺髓質素(ADM)這種肽，作為一種從人類嗜鉻細胞瘤分離的包含52個氨基酸的新的降血壓肽，在1993年首次被描述(Kitamura等，(1993)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 :553-560)。同年，包含185個氨基酸的前體肽的編碼cDNA和該前體肽的完整氨基酸序列也被描述(Kitamura 等，(1993)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 194 :720-725)。 在N端特別包含有21個氨基酸的信號序列的前體肽，被稱為“前腎上腺髓質素原”。ADM肽包含pre-pro-ADM的95到146位氨基酸，其由pre-pro_ADM通過蛋白水解切割而形成。在pre-pro-ADM的切割中形成的某些肽片段已進行詳細的性質研究，特別是生理活性肽腎上腺髓質素(ADM)和“PAMP”，后者是包含在pre-pro-ADM中緊隨信號肽的21個氨基酸之后的20個氨基酸02-41位)的肽。另一個未知功能并具有高的離體穩(wěn)定性的片段是中段腎上腺髓質素原(MR-proADM) Gtruck 等，(2004), Peptides 25(8) :1369-72)，對其已開發(fā)出一種可靠的定量方法(Morgenthaler 等(2005), Clin. Chem. 51(10) :1823-9)。1993年ADM的發(fā)現(xiàn)和定性引發(fā)了大量研究活動和無數(shù)出版物，它們的結果最近已被總結在各種綜述文章中，在本說明書的情況下，具體來說參考在“Peptides”雜志的 ADM ?？?Peptides 22(2001))中的文章，特別是(TakahashU2001)，P印tides 22， 1691和Eto Q001)，P印tides 22,1693-1711)。該主題進一步綜述在Hinson等的文章中 (Hinson等，(2000)，Endocr. Rev. 21 (2)，138-167)。ADM可以被當作多功能調控肽。它以帶有C端甘氨酸的無活性形式釋放到循環(huán)中(Kitamura等，(1998)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(2),551-555)。ADM是有效的血管舒張劑。降血壓效應已與ADM的C端部分中的肽區(qū)段具體相關聯(lián)。另一方面，ADM的N端肽序列表現(xiàn)出升血壓效應(Kitamura等，(2001)，Peptides 22， 1713-1718)。心房利尿鈉肽(ANP，也稱為心房利尿鈉因子(ANF))是一種包含28個氨基酸殘基的肽類激素(SEQ ID NO :8)。ANP基因包含3個外顯子和2個內含子，并編碼153個氨基酸的 pre-proANP(SEQ ID NO :6)。在切開N端信號肽(25個氨基酸)和兩個C端氨基酸(127/1 ) 后，釋放出proANP。ANP包含來自前體激素原proANP的C端的99-1 位氨基酸殘基(SEQ ID NO :7)。該激素原被切割成28個氨基酸的ANP成熟肽，也稱為ANP (1-28)或α -ANP,以及氨基端片段 ANP (1-98) (NT-proANP, SEQ ID NO 9)。因此，NT-proANP 和 ANP 以等摩爾量產生。98個氨基酸的NT-proANP可以進行進一步蛋白水解加工。中段proANP (MR-proANP) 被定義為proANP或其包含proANP的至少53-90位氨基酸殘基的任何片段。proANP的53 至90位氨基酸顯示在SEQ ID NO 10中(

圖10)。MR-proANP的測量已被用于急性代謝失調心力衰竭的鑒別診斷中(Gegenhuber等，Clin Chem 2006;52:827-31)。關于ANP及其前體和片段，幾份出版物涉及在患有晚期腎臟疾病的患者中測量這些被分析物，特別是在血液透析之前和之后。在這些出版物中，分析了測量到的被分析物水平與其他參數(shù)的相關性，所述其他參數(shù)在獲得用于測量的樣品的同時從患者獲得。還沒有出版物跟蹤了疾病隨時間的發(fā)展，因此不能并且也沒有研究在給定時間點測量到的被分析物水平是否與疾病嚴重性的增加相關，即被分析物水平是否適合用于疾病發(fā)展的預測。 Nephron. 1991 ；58(1) :17_22，“血液透析后血漿中免疫反應性的心房利尿鈉因子激素原的 N 端、C 端禾口 4000 道爾頓中段的變化” (Change in plasma immunoreactive N—terminus， C-terminus,and 4, 000-dalton midportion of atrial natriuretic factor prohormone with hemodialysis), Winters CJ, Vesely DL。 Regul Pept Suppl. 1985 ；4 :110-2,"^ 期血液透析患者中心房利尿鈉多肽的血漿濃度”(Plasma concentration of atrial natriuretic polypeptide in chronic hemodialysis patients), Yamamoto Y, Higa T, Kitamura K, Tanaka K, Kangawa K, Matsuo H。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于預測初次慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)展或用于監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供來自患有初次慢性腎臟疾病的患者的樣品，(b)測定ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，(c)將ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測相關聯(lián)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于預測初次慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)展的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供來自患有初次慢性腎臟疾病的患者的樣品，(b)測定ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，(c)將ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測相關聯(lián)。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供來自患有初次慢性腎臟疾病的患者的樣品，(b)測定ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，(c)將ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測相關聯(lián)。最優(yōu)選實施方案是如上所述用于預測初次腎臟疾病的發(fā)展的方法。這是最有價值的實施方案。這種用于預測的方法可以隨著本文后面概述的所有具體實施方案而變。方法允許將患有進行性慢性腎臟疾病的患者與患有非進行性慢性腎臟疾病的患者區(qū)分開。本文中的進行性CKD是指發(fā)展和可能發(fā)展到血清肌酸酐加倍和末期腎病(ESRD)的CKD。因此， 在方法的優(yōu)選實施方案中，患者被分類成發(fā)展者或非發(fā)展者。因此，發(fā)展者是其CKD最終將發(fā)展成末期腎病(ESRD)的患者。在一個實施方案中，這意味著發(fā)展者被定義為發(fā)展到血漿肌酸酐加倍而優(yōu)選不達到ESRD的終點的患者。ESRD是非補償性腎病。這意味著腎損傷不再可逆轉，并且需要透析或移植。這意味著用于預測初次CKD的發(fā)展和/或用于監(jiān)測慢性腎臟疾病的方法的優(yōu)選患者亞組只包含不處于ESRD的患者。在本發(fā)明的另一個實施方案中，發(fā)展者被定義為發(fā)展到需要更換腎臟的終點ESRD 的患者。因此，發(fā)展被定義為疾病從輕度至中度腎臟疾病朝向上面提到的終點之一的過程， 所述終點是血漿肌酸酐加倍而優(yōu)選不達到ESRD或達到需要更換腎臟的ESRD。本發(fā)明的方法特別適用于具有輕度至中度腎臟疾病的患者。具有輕度至中度腎臟疾病的患者被定義為在被分析物測量之前具有至少3個月的穩(wěn)定腎功能的患者。在優(yōu)選實施方案中，具有輕度至中度腎臟疾病的患者不需要血液透析。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法用于預測慢性腎臟疾病的發(fā)展或監(jiān)測慢性腎臟疾病，但是不預測死亡風險。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，死亡不是被用作將患者分類成發(fā)展者或非發(fā)展者的終點。然而，對于本技術領域的專業(yè)人員來說，顯然發(fā)展者與非發(fā)展者相比具有增加的死亡風險。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于為患有輕度至中度腎臟疾病的患者預測初次慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)展或監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供來自患有初次慢性腎臟疾病、具有輕度至中度腎臟疾病的患者的樣品，(b)測定ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，(c)將ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測相關聯(lián)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及用于為患有輕度至中度腎臟疾病的患者預測初次慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)展或監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供來自患有初次慢性腎臟疾病、具有輕度至中度腎臟疾病的患者的樣品，(b)測定ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，(c)將ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測相關聯(lián)，不將死亡的預測考慮在內。這意味著初次慢性腎臟疾病的進展，其中進展意味著腎功能惡化。腎功能惡化的度量是基線血清肌酸酐的增加、即至少倍增，和/或需要換腎療法的ESRD。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，測定ANP或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，并將其用作單一標志物。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，測定ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，并將其用作單一標志物。優(yōu)選情況下，ANP或其片段或其前體或所述前體的片段選自NT-proANP、 MR-proANP和成熟ANP或其片段。片段可以具有優(yōu)選至少12個氨基酸的長度。優(yōu)選情況下，ADM或其片段或其前體或所述前體的片段選自成熟ADM、MR-proADM、 PAMP和CT-proADM或其片段。片段可以具有優(yōu)選至少12個氨基酸的長度。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中，初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測，可以通過附加地測定并使用至少一種其他實驗室參數(shù)或其他標志物的水平來改進，所述其他實驗室參數(shù)或其他標志物選自肌酸酐、GFR( “腎小球濾過率”;GFR可以通過例如測量碘海醇清除率來測定(Bostom 等，J Am Soc Nephrol 2002 ；13 :2140-2144))、蛋白尿、白蛋白、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、GDF15、ST2、NGAL、降鈣素原及其片段、BNP或其片段或其前體或所述前體的片段特別是ProBNP或NT-proBNP、血管加壓素原及其包括和肽素、血管加壓素和后葉激素運載蛋白II的片段、內皮素原-1及其包括CT-proET-l、NT-proET-l、大內皮素-1和內皮素-1的片段。此外，優(yōu)選情況下，附加地測定選自下列的至少一個臨床參數(shù)年齡、性別、收縮壓、舒張壓、體重指數(shù)、當前吸煙嗜好、抗高血壓治療。本發(fā)明還涉及用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展或用于監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，其中ANP和/或ADM或其前體或片段的水平單獨地或與其他預后有用的實驗室或臨床參數(shù)聯(lián)合，通過可以選自下列可選方案的方法用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展-與初次慢性腎臟疾病患者群體中全部預定樣品中的ANP和/或ADM或其前體或其片段的水平的中位數(shù)進行比較，-與初次慢性腎臟疾病患者群體中全部預定樣品中的ANP和/或ADM或其前體或其片段的水平的分位數(shù)進行比較，-根據(jù)Cox比例風險分析或使用風險指數(shù)計算例如NRJ(凈重新分類指數(shù))或 IDI (綜合鑒別指數(shù))進行計算。在具體實施方案中，使用診斷測定方法測量MR-proADM的水平，所述測定方法包含一個或多個針對位于I^re-proADM的第45-92位氨基酸中的一個或多個表位的捕獲探針。另一方面，本發(fā)明還涉及使用ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段，用于在患有初次慢性腎臟疾病的患者中預測腎臟終點(renal endpoints)。此外，本發(fā)明涉及使用ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段，用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展。 在本發(fā)明的一個實施方案中，患有初次慢性腎臟疾病的患者未患糖尿病。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，慢性腎臟疾病是非糖尿病性慢性腎臟疾病。
在本發(fā)明的范圍內還包括使用ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段，用于將患有初次慢性腎臟疾病的患者分類成發(fā)展者或非發(fā)展者。具體來說，ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段被用作不依賴于 GFR的預測物和分類標志物。本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的任一種方法，用于在患有初次慢性腎臟疾病的患者中監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的成功。在這種情形中，本發(fā)明的方法可以在療法開始后實施一次或多次，并且結果可以互相或與療法開始前的結果進行比較，以便評估療法的成功。本發(fā)明的范圍內還包括使用本發(fā)明的任一種方法，用于監(jiān)測腎功能。在一個實施方案中，使用具有低于0. 3nmol/L和/或低于初次慢性腎臟疾病患者群體的中位數(shù)的檢測極限，以及在正常范圍內<30% CV的測定間精確度的MR-proADM測定方法，用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展。在另一個實施方案中，使用具有低于20pmol/L和/或低于初次慢性腎臟疾病患者群體的中位數(shù)的檢測極限，以及在正常范圍內<30% CV的測定間精確度的MR-proADM測定方法，用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展。本發(fā)明還涉及使用針對ANP或其片段或其前體或所述前體的片段和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的捕獲探針，用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展。在ADM 的情形中，優(yōu)選情況下，所述捕獲探針針對位于pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一個或多個表位。在ANP的情形中，優(yōu)選情況下，所述捕獲探針針對位于proANP的第53-90位氨基酸中的一個或多個表位。一般來說，本文中所定義的肽和前體肽的片段，涉及其長度為至少12個氨基酸的片段。片段優(yōu)選為肽的可免疫檢測的片段。在本發(fā)明的上下文中，術語“腎上腺髓質素原”(proADM)和術語“腎上腺髓質素原或其片段”是指ProADM的完整分子或其包括但不限于ADM、PAMP和MR-proADM的至少12個氨基酸的片段。在優(yōu)選實施方案中，ProADM是指proADM的完整分子或其除了成熟ADM之外的至少12個氨基酸的片段。在其他優(yōu)選實施方案中，proADM是指proADM的完整分子或其除了成熟ADM或成熟ADM的片段之外的至少12個氨基酸的片段。因此，在本發(fā)明的一個具體實施方案中，“測定ProADM或其片段的水平”是指測定proADM或其片段的水平，其中成熟ADM和/或成熟ADM的片段的水平不測定。腎上腺髓質素的前體肽(前腎上腺髓質素原)的氨基酸序列在圖1中給出(SEQ ID NO :1)。腎上腺髓質素原是指前腎上腺髓質素原序列的22到185位氨基酸殘基。腎上腺髓質素原(pro-ADM)的氨基酸序列在圖2中給出(SEQ ID NO :2)。pro-ADM的N端20肽 (PAMP)是指pre-proADM的第22-41位氨基酸殘基。PAMP的氨基酸序列在圖3中給出(SEQ ID NO. 3)。MR-腎上腺髓質素原(MR-pro-ADM)涉及pre-pro_ADM的第45-92位氨基酸殘基。MR-pro-ADM的氨基酸序列提供在圖4中(SEQ ID NO :4)。成熟腎上腺髓質素(ADM)的氨基酸序列在圖5中給出(SEQ ID NO 5)。ANP的氨基酸序列在圖8中給出(SEQ ID NO 8)。153個氨基酸的pre-proANP的序列顯示在圖6中(SEQ ID NO 6)。在切開N-端信號肽(25個氨基酸)和兩個C-端氨基酸(127/128)后，釋放出proANP (圖7，SEQ ID NO :7)。ANP包含來自前體激素原pro-ANP 的C-端的99-1 位氨基酸殘基。該激素原被切割成28個氨基酸的ANP成熟肽，也稱為 ANP(l-28)或α-ANP，以及氨基端片段ANP(l-98)(NT-proANP，圖9，SEQ ID NO :9)。中段 proANP (MR-proANP)被定義為NT-proANP或其包含proANP的至少第53-90位氨基酸殘基 (圖10中的SEQ ID NO 10)的任何片段。在本文中，當在蛋白或肽的上下文中提到時，術語“片段”是指可以從較大蛋白或肽得到的較小蛋白或肽，因此其包含較大蛋白或肽的部分序列。所述片段可以從較大蛋白或肽通過其一個或多個肽鍵的皂化作用而產生。在本發(fā)明的文本中，在表述例如“蛋白酶水平”、“被分析物水平”和類似的表述中， 術語“水平”是指在相應上下文中提到的分子實體的量，或在酶的情況下它也可以是指酶活性。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方案中，測定腎上腺髓質素原或其片段和/或 proANP或其片段的所述水平，并將其用作單一標志物。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方案中，初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測，可以通過附加地測定和使用至少一種其他實驗室參數(shù)來改進，所述實驗室參數(shù)選自肌酸酐、GFR( “腎小球濾過率”;GFR可以通過例如測量碘海醇清除率來測定(Bostom等，J Am Soc Nephrol 2002 ；13 :2140-2144))、蛋白尿、白蛋白、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、⑶F15、ST2、NGAL、 降鈣素原及其片段、BNP或其片段或其前體或所述前體的片段特別是proBNP或NT-proBNP、 血管加壓素原及其包括和肽素、血管加壓素和后葉激素運載蛋白II、內皮素原-1及其片段包括CT-proET-l、NT-proET-l、大內皮素-1和內皮素_1的片段。術語“附加地測定”不暗示、盡管也不排除這些測定在技術上組合。術語“附加地使用”被定義為參數(shù)——它可以是實驗室和/或臨床參數(shù)——的任何類型的數(shù)學組合，其產生了初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測。這種數(shù)學組合的一個實例是Cox比例風險分析， 從其可以推導出患有初級慢性腎臟疾病的對象的疾病發(fā)展的風險，但是也可以使用其他方法。本發(fā)明還包括將個體的標志物水平與預定值進行比較。預定值可以采取各種形式。它可以是單一截止值這可以是例如參比群體的中位數(shù)或平均值或75^9(^、95&或 99th百分位數(shù)。這也可以是例如“最適”截止值。給定標志物的最適截止值是對于該標志物來說診斷靈敏度和特異性的積最大時的值。診斷靈敏度是患有疾病或發(fā)生疾病的風險 (在任何具體情況下取決于所回答的診斷或預后問題)并且也被標志物正確識別出的患者 (“真陽性”)的相對分數(shù)，診斷特異性是不患有疾病或發(fā)生疾病的風險(在任何具體情況下取決于所回答的診斷或預后問題)并且也被標志物正確識別出的患者(“真陰性”)的相對分數(shù)。取決于臨床或經(jīng)濟學需要，這可以通過對截止值進行優(yōu)化以獲得最大陰性預測值或最大陽性預測值。因此，人們可以根據(jù)被認為更加合適的是以也鑒定到“假陽性”為代價而鑒定大多數(shù)有風險對象，還是以錯過幾個具有中等風險的對象為代價而主要鑒定高風險對象，來挑選截止值。預定值可以根據(jù)對比組來建立，例如一個規(guī)定組中的風險為另一個規(guī)定組中風險的兩倍。它可以是范圍，例如將測試群體等量(或不等量)地分組，例如低風險組、中風險組和高風險組，或分成四等分，最低的四分之一是具有最低風險的個體，最高的四分之一是是具有最高風險的個體。在所選的特定參比群體中，預定值可以隨著他們的嗜好、種族、遺傳等而變化。因此，所選的預定值可以考慮個體所屬類別。本技術領域的普通專業(yè)人員可以使用不超出常規(guī)的實驗來選擇適合的范圍和類別。如上討論的各種閾值水平的有效性，可以通過例如Kaplan-Meier分析(圖11_14) 看出，其中描述了對于所調查患者群體的亞組來說事件、即在本發(fā)明的情況下是腎臟疾病的發(fā)展、的發(fā)生。這里，對于四個Kaplan-Meier分析來說，所調查的患者群體各自被分成兩個亞組。亞組定義如下a)所調查的患者群體被分成MR-proANP值高于中位數(shù)水平(106pmol/L)的一個組和MR-proANP值低于中位數(shù)水平的另一個組(圖11)，b)所調查的患者群體被分成MR-proADM值高于中位數(shù)水平(0. 75nmol/L)的一個組和MR-proADM值低于中位數(shù)水平的另一個組(圖12)，c)所調查的患者群體被分成MR-proADM值高于最適閾值水平(0. 865nmol/L(靈敏度為0. 766，特異性為0. 809))的一個組和MR-proADM值低于最適閾值水平的另一個組(圖
13),d)所調查的患者群體被分成MR-proANP值高于最適閾值水平(84. 15pmol/L(靈敏度為0. 891，特異性為0. 582))的一個組和MR-proANP值低于最適閾值水平的另一個組(圖
14)。在本發(fā)明中鑒定到的最適閾值水平是基于所調查的特定群體，并且由于上面描述的原因，它們在其他可比群體中可能不同(+/-20% )。在本發(fā)明的文本中，術語“閾”、“閾值”、“截止”和“截止值”同義使用。這些結果得到Cox回歸分析(表4)的進一步支持，所述Cox回歸分析證實了 MR-proANP和MR-proADM兩者對于預測初次慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)展的效用。通過使用個體的MR-proADM和/或MR-proANP值和其他預后性實驗室和臨床參數(shù)來計算個體風險的其他數(shù)學可能性是例如NRI (凈重新分類指數(shù))或IDI (綜合鑒別指數(shù))。指數(shù)可以按照Pencina的文獻來計算(Pencina MJ等“評估新標志物的增加預測能力從 ROC 曲線下面積到重新分類等”(Evaluating the added predictive ability of a new marker :from area under the ROC curve to reclassification and beyond), Stat Med. 2008 ；27 :157-172)。在某些實施方案中，不能依靠組中的一種或多種標志物的具體閾值來確定從對象獲得的標志物水平的分布情況是否指示了特定的診斷/預后。相反，本發(fā)明可以利用標志物組“分布情況”作為不可分割的整體進行評估。這種標志物組中變化的特定“指紋”組合形式能夠有效用作特定的診斷或預后指示物。正如在本文中討論的，變化的組合形式可以從單一樣品或組的一個或多個成員的時間變化(或組的響應值)獲得。這里的組是指一組標志物。組的響應值可以通過各種方法產生。一個實例是Cox比例風險分析。另一個實例是優(yōu)化ROC曲線這可以通過對在各種截止值下特定組的靈敏度對組的1_(特異性)的ROC曲線作圖來獲得。在這些方法中，來自對象的標志物測量值的分布情況合在一起，被認為提供了診斷或預后的全局概率(表示成數(shù)字分值或風險百分率)。在這樣的實施方案中，標志物的某些子集的增加可能足以在一個患者中指示特定診斷/預后，而標志物的不同子集的增加可能足以在另一個患者中指示相同或不同的診斷/預后。也可以向組中的一個或多個標志物施加權重因數(shù)，例如，當標志物在鑒定特定診斷/預后中效用特別高時，可以將其權重成使得在給定水平下，它單獨即足以傳遞陽性結果的信號。同樣，權重因數(shù)也可以提供成使得任何特定標志物的給定水平都不足以傳遞陽性結果的信號，而只有當另一個標志物也有助于分析時才傳遞結果的信號。在某些實施方案中，標志物和/或標志物組被選擇成表現(xiàn)出至少約70%的靈敏度、更優(yōu)選至少約80%的靈敏度、更優(yōu)選至少約85%的靈敏度、更優(yōu)選至少約90%的靈敏度以及最優(yōu)選至少約95%的靈敏度，與至少約70%的特異性、更優(yōu)選至少約80%的特異性、更優(yōu)選至少約85%的特異性、更優(yōu)選至少約90%的特異性以及最優(yōu)選至少約95%的特異性的組合。在特別優(yōu)選實施方案中，靈敏度和特異性兩者均為至少約75%、更優(yōu)選至少約80%、更優(yōu)選至少約85%、更優(yōu)選至少約90%以及最優(yōu)選至少約95%。在這種情況下， 術語“約”是指給定測量值的+/_5%。在其他實施方案中，陽性似然比、陰性似然比、機會比或風險比被用作測試的預測風險或診斷疾病的能力的度量。在陽性似然比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者的對象中陽性結果可能性相等；值大于1表示在患病組中陽性結果可能性更大；值小于1表示在對照組中陽性結果可能性更大。在陰性似然比的情況下，值為1表示在“患病” 和“對照”組二者的對象中陰性結果可能性相等；值大于1表示在測試組中陰性結果可能性更大；值小于1表示在對照組中陰性結果可能性更大。在某些優(yōu)選實施方案中，標志物和/ 或標志物組優(yōu)選被選擇成表現(xiàn)出至少約1. 5或1. 5以上或約0. 67或0. 67以下、更優(yōu)選至少約2或2以上或約0. 5或0. 5以下、更優(yōu)選至少約5或5以上或約0. 2或0. 2以下、更優(yōu)選至少約10或10以上或約0. 1或0. 1以下，以及最優(yōu)選至少約20或20以上或約0. 05或 0. 05以下的陽性或陰性似然比。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/_5%。在機會比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者的對象中陽性結果可能性相等；值大于1表示在患病組中陽性結果可能性更大。值小于1表示在對照組中陽性結果可能性更大。在某些優(yōu)選實施方案中，標志物和/或標志物組優(yōu)選被選擇成表現(xiàn)出至少約2或2以上或約0. 5或0. 5以下、更優(yōu)選至少約3或3以上或約0. 33或0. 33以下、更優(yōu)選至少約4或4以上或約0. 25或0. 25以下、更優(yōu)選至少約5或5以上或約0. 2或0. 2以下以及最優(yōu)選至少約10或約10以上或約0. 1或約0. 1以下的機會比。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/_5%。在風險比的情況下，值為1表示在“患病”和“對照”組二者中終點(例如死亡)的相對風險是相等；值大于1表示在患病組中風險更高；值小于1表示在對照組中風險更高。 在某些優(yōu)選實施方案中，標志物和/或標志物組優(yōu)選被選擇成表現(xiàn)出至少約1. 1或1. 1以上或約0. 91或0. 91以下、更優(yōu)選至少約1. 25或1. 25以上或約0. 8或0. 8以下、更優(yōu)選至少約1. 5或1. 5以上或約0. 67或0. 67以下、更優(yōu)選至少約2或2以上或約0. 5或0. 5以下以及最優(yōu)選至少約2. 5或2. 5以上或約0. 4或0. 4以下的風險比。在這種情況下，術語“約”是指給定測量值的+/-5%。專業(yè)技術人員將會理解，將診斷或預后指示物與診斷或與將來臨床結果的預后風險相關聯(lián)，是一種統(tǒng)計學分析。例如，標志物水平大于X可以傳遞患者與水平低于或等于X 的患者相比更可能遭受不利后果的信號，正如通過統(tǒng)計學顯著性水平所確定的。此外，標志物濃度從基線水平的改變可以反映患者的預后，并且標志物水平變化的程度可能與不利事件的嚴重性相關。統(tǒng)計學顯著性通常通過比較兩個或多個群體并確定置信區(qū)間和/或ρ值來確定。參見例如Dowdy和Wearden，《用于研究的統(tǒng)計學》(Statistics for Research), John Wiley & Sons，New York，1983。本發(fā)明的優(yōu)選置信區(qū)間是 90%、95%、97. 5%、98%、 99 %,99. 5 %,99. 9 % 和 99. 99 %,而優(yōu)選的 ρ 值是 0. 1、0· 05,0. 025,0. 02,0. 01,0. 005、 0. 001 和 0. 0001。在其他實施方案中，可以進行多次診斷或預后標志物的測定，并使用標志物的時間變化確定診斷或預后。例如，可以在初始時間測定對象樣品中的標志物濃度，并在第二個時間從第二個對象樣品再次測定。在這樣的實施方案中，從初始時間到第二個時間標志物的增加可以指示特定的診斷或特定的預后。同樣地，從初始時間到第二個時間標志物的減少可以指示特定的診斷或特定的預后。當在本文中使用時，術語“樣品”是指出于對目標對象例如患者進行診斷、預后或評估的目的而獲得的體液樣品。優(yōu)選的測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、 痰液和胸膜腔積液。此外，本技術領域的專業(yè)人員將會認識到，某些測試樣品在分級或純化步驟、例如將全血分離成血清或血漿組分后，可以更容易地分析。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品和尿液樣品，或上面提到的任何樣品的提取物。當在本文中使用時，術語“患者”是指由于疾病而正接受醫(yī)學護理或將接受醫(yī)學護理的活的人類或非人類生物體。這包括疾病未確定、正在接受病理征兆調查的人。因此，本文描述的方法和測定法可應用于人類和獸醫(yī)疾病兩者。當在本文中指稱診斷和預后標記物的用途時，術語“相關聯(lián)”是指將患者中標記物的存在或量，與其在已知患有給定病癥或已知具有給定病癥風險的人、或已知沒有給定病癥的人中的存在或量進行比較。正如上面討論的，可以將患者樣品中的標志物水平與已知與特定預后相關的水平進行比較。樣品的標志物水平被說成已經(jīng)與診斷相關聯(lián)；也就是說， 專業(yè)技術人員可以使用標志物水平確定患者是否進行特定類型的診斷，并做出相應應答。 可替選地，樣品的標志物水平可以與已知與良好結果(例如不存在疾病等)相關的標志物水平進行比較。在優(yōu)選實施方案中，標志物水平的分布情況與總體概率或特定結果相關聯(lián)。“預后”是指指派給定過程或結果將會發(fā)生的概率。這通常通過檢查一種或多種 “預后指示物”來確定。它們是標記物，其在患者(或從患者獲得的樣品)中的存在或量傳遞了給定過程或結果將會發(fā)生的概率的信號。例如，當在從這些患者獲得的樣品中一種或多種預后指示物達到足夠高的水平時，所述水平可以傳遞患者具有最終發(fā)展到末期腎病 (ESRD)的增加的概率，即患者具有成為“發(fā)展者”的增加的概率的信號。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，測量MR-proADM的水平。MR-proADM包含pre-proADM 的第45-92位氨基酸。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，使用診斷測定法測量proADM或其片段的水平，所述診斷測定法使用了一種或多種針對位于pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一個或多個表位的捕獲探針。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，測量MR-proANP水平。MR-proANP是指包含 proANP的第53-90位氨基酸的任何proANP片段。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，使用診斷測定法測量proANP或其片段的水平，所述診斷測定法使用了一種或多種針對位于proANP的第53-90位氨基酸中的一個或多個表位的捕獲探針。當在本文中提到時，“測定方法”或“診斷測定方法”可以是在診斷學領域中應用的任何類型的測定方法。這樣的測定方法可以基于待檢測被分析物與具有一定親和性的一種或多種捕獲探針的結合。對于捕獲分子與目標靶分子之間的相互作用來說，親和常數(shù)優(yōu)選大于IO8W10上面提到的標志物的水平可以通過本技術領域任何公知的方法來獲得。典型情況下，水平通過測量體液例如血液、淋巴、唾液、尿液等中的標志物水平或活性來測定。水平可以通過免疫測定法或用于測定標志物水平的其他常規(guī)技術來測定。公認的方法包括將患者的體液樣品送往商業(yè)化實驗室進行測量，但是也可以在護理現(xiàn)場進行測量。在本發(fā)明的文本中，“捕獲分子”是可用于結合來自樣品的目標靶分子、即被分析物的分子。因此，捕獲分子必須在空間上和表面特征例如表面電荷、疏水性、親水性、路易斯供體和/或受體是否存在等方面適當塑造，以特異性結合目標靶分子。因此，結合可以由例如捕獲分子與目標靶分子之間的離子、范德華、n-n、S-π、疏水或氫鍵相互作用或兩種以上上面提到的相互作用的組合來介導。在本發(fā)明的情形中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、糖類分子、PNA分子、蛋白質、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選情況下，捕獲分子是抗體，包括其與目標靶或分子具有足夠親和性的片段，并包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體或其源自于變體鏈的長度為至少12個氨基酸的片段的化學和/或生物化學修飾的衍生物。優(yōu)選的檢測方法包括各種格式的免疫測定法，例如放射免疫測定法、化學發(fā)光和熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫測定法(ELISA)、基于Luminex的珠子陣列、蛋白質微陣列測定法，以及快速檢測格式例如免疫層析條樣試驗。測定法可以是均相或非均相測定法、競爭和非競爭性夾心測定法。在特別優(yōu)選的實施方案中，測定法采用夾心測定法形式，其是非競爭性免疫測定法，其中待檢測和/或定量分子與第一抗體并與第二抗體結合。第一抗體可以結合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或條上，并且第二抗體是例如用染料、放射性同位素或反應性或催化活性組成部分標記的抗體。然后通過適合的方法測量與被分析物結合的標記抗體的量?！皧A心測定法”所涉及的通用組合物和步驟是已確立的，并為專業(yè)技術人員所公知。(《免疫測定手冊》 (The Immunoassay Handbook), David Wild Elsevier LTD, Oxford ；HH (2005 年 5月)，ISBN-13 :978-0080445267 ；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol. 2006Feb ；10(1) 4-10. PMID :16376134)，在此引為參考。在特別優(yōu)選實施方案中，測定方法包含兩種捕獲分子，優(yōu)選為都作為分散相存在于液體反應混合物中的抗體，其中第一種標記組分附著在第一種捕獲分子上，其中所述第一種標記組分是基于熒光或化學發(fā)光淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二種標記組分附著于第二種捕獲分子上，使得當兩種捕獲分子與被分析物結合后產生可測量信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復合物。在特別優(yōu)選的實施方案中，測定法包含兩種捕獲分子，優(yōu)選為都作為分散體系存在于液體反應混合物中，其中第一標記組分與第一捕獲分子結合，其中所述第一標記組分是基于熒光或化學發(fā)光-淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，所述標記系統(tǒng)的第二標記組分與第二捕獲分子結合，使得當兩種捕獲分子與被分析物結合后產生可測量信號，允許檢測包含樣品的溶液中形成的夾心復合物。在更優(yōu)選情況下，所述標記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學發(fā)光染料、特別是花青類型的染料的組合。在本發(fā)明的情形中，基于熒光的測定方法包含使用染料，所述染料可以例如選自 FAM(5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如 CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7、占噸、6-羧基-2，，4，，7，，4，7-六氯熒光素(HEX)、 TET、6-羧基-4，，5-二氯-2，，7，- 二甲氧基熒光素(JOE)、N，N，N' , N'-四甲基 _6_ 羧基羅丹明(TAMRA)、6_羧基-X-羅丹明(ROX)、5_羧基羅丹明-6G (R6G5)、6_羧基羅丹明_6G(RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯并亞胺類例如Hoechst 33258 ；菲啶類例如德克薩斯紅、雅吉瓦黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶類染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、嚇啉染料、聚甲炔染料等。在本發(fā)明的情形中，基于化學發(fā)光的測定方法包含根據(jù)化學發(fā)光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化學技術百科全書》(Encyclopedia of chemical technology) H四片反，J. I. KroschwitzΜ. Howe-GrantJohn Wiley & Sons，1993，vol. 15，p. 518-562中，在此引為參考，包括在551-562頁中的引用文獻。優(yōu)選的化學發(fā)光染料是吖啶酯。在特別優(yōu)選實施方案中，使用具有低于0.3nmol/L的檢測極限以及在正常范圍內 <30% CV的測定間精確度的MR-proADM測定方法，在對象中預測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的高風險的對象。本發(fā)明的另一個實施方案是使用捕獲探針、例如針對proADM或其片段的抗體，在對象中預測初次不利事件或鑒定具有發(fā)生初次不利事件的高風險的對象。在本發(fā)明的情形中，特別優(yōu)選的是使用針對包含在Pre-proADM的45_92氨基酸位置中的表位和/或針對包含在ProANP的53-90氨基酸位置中的表位的一種或多種抗體。
實施例實施例 ι -M^^f^mmm (mmkd)研究本研究的目的是在患有初次CKD的患者組群的前瞻性7年隨訪研究中，使用覆蓋更穩(wěn)定的激素原片段(MR-proANP和MR-proADM)的中段表位的新的夾心免疫測定法，研究 ANP和ADM對腎臟疾病進展的預測價值。結果表1顯示了按照K/D0QI的慢性腎臟疾病臨床實踐準則使用基線GFR分層的等級中 NT-proBNP、MR-proANP 和 MR-proADM 的血漿濃度?？邕^ CKD 等級，存在 NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM血漿濃度中位數(shù)的連續(xù)增加。此外，非參數(shù)關聯(lián)性分析顯示出GFR 與所有三種參數(shù)之間的顯著關聯(lián)性(表2)。227位登記患者中的177位隨訪數(shù)據(jù)可用。在基線研究完成后隨訪持續(xù)時間的中位數(shù)為53個月(范圍為3至84個月)。在隨訪期間，65位患者發(fā)展到終點，所述終點在 36位患者中是血清肌酸酐加倍并且未達到ESRD，在四位患者中是需要換腎治療的ESRD。 表3報告了發(fā)展者和非發(fā)展者的基線CKD患者特征。達到發(fā)展終點的患者年齡較大、具有較高的蛋白質排泄率以及較低的GFR。此外，在發(fā)展者中與非發(fā)展者中相比，NT-proBNP, MR-proANP 和 MR-proADM 的血菜濃度中位數(shù)較高(NT-proBNP，321 比 84ng/L ；MR-proANP, 164 比 74pmol/L ；以及 MR-proADM, 1. 13 比 0. 55nmol/L)。圖11到12顯示了根據(jù)基線時MR-proANP和MR-proADM的中位數(shù)分層到兩個組中的177位CKD患者的Kaplan-Meier曲線分析。GFR值低于中位數(shù)并且MR-proANP和 MR-proADM血漿濃度高于中位數(shù)的患者，與GFR值高于中位數(shù)并且MR-proANP和MR-proADM 血漿濃度低于中位數(shù)的患者相比，具有更糟的腎臟預后和明顯更短的發(fā)展時間[以月計的發(fā)展平均時間，分別為對于MR-proANP來說51. 1(95% CI 45. 2-57. 1)比71. 4(95% CI 64.7-78. 1)，ρ < 0.001 ；對于 MRproADM 來說 51. 6 (95 % CI45. 6-57. 6)比 73. 6 (95 % CI 68. 5-78. 6)，ρ < 0. 001]。使用根據(jù)中位數(shù)值對預測變量進行分層方法的單變量Cox 比例風險回歸分析，顯示出對于高于中位數(shù)的GFR來說顯著降低的風險比(HR) (HR 0. 12 ； 95 % CI0. 06-0. 24 ；ρ < 0. 001),以及對于基線時高于中位數(shù)的 NT-proBNP (HR 3. 84 ； 95% CI 2. 14-6. 89 ；ρ < 0. 001)、MR-proANP(HR 4. 47 ；95% CI2. 46-8. 12 ；ρ < 0. 001)和 MR-proADM(HR 5. 84 ；95% CI 3. 04-11. 21 ；ρ < 0. 001)濃度來說顯著增加的 HR。使用預測變量的增量方法的Cox比例風險回歸分析的結果在表4中給出。在對年齡和性別進行調整的模型1中，GFR、蛋白尿、NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM對腎臟疾病的發(fā)展顯示出明顯的HR。在對GRF和蛋白尿進一步調整后，對于MR-proANP和MR-proADM 來說HR略微減弱，但是兩種變量仍保持與疾病發(fā)展的強烈關聯(lián)，而對于NT-proBNP來說HR 不再顯著(模型2、。甚至在對NT-proBNP進一步調整后，MR-proANP和MR-proADM仍各自保留為腎臟疾病進展的有力預測物(模型幻。因為幾個所調查的變量都是非正態(tài)分布的， 因此我們通過將對數(shù)變換的變量包含在模型中，進行了靈敏度分析。這些分析顯示出非常相似的結果(數(shù)據(jù)未顯示)，例外的是NT-proBNP，其在對年齡、性別、GFR和蛋白尿進行調整后仍然顯著(HR 1. 59 ；95% CIl. 15-2. 19 ；ρ = 0. 005)。然而，為了估算值的更好的可判讀性，我們以原始的標度呈現(xiàn)數(shù)據(jù)。我們還通過將MR-proANP和MR-proADM兩個變量包含在同樣的Cox回歸模型中并對年齡、性別、DFR和蛋白尿進行調整，研究了 MR-proANP和MR-proADM兩者是否獨立地增加 CKD發(fā)展的預測。兩個變量的風險比都降低(與表4的模型2中的估算相比)，但是仍保持顯著(對于 MR-proANP 來說 HR 1. 60 ；95% CI 1. 11-2. 30，ρ = 0. 011 ；對于 MR-proADM 來說 HR 1. 96 ；95% CI 1. 31-2. 94，ρ < 0. 001)。在二級分析中，我們只包含了根據(jù)K/D0QI的慢性腎臟疾病臨床實踐準則處于3期及以上的患者(GFR < 60ml/min/l. 73m2)。我們對于整個組來說觀察到與表4的模型2和 3所呈現(xiàn)的非常相似的估算值(數(shù)據(jù)未顯示)。討論
本研究是調查MR-proANP和MR-proADM對患有初次CKD的白人患者的腎病發(fā)展的預后價值的首個遠景長期觀察。我們的數(shù)據(jù)表明，基線時增加的MR-proANP和MR-proADM 血漿濃度是腎臟終點的強有力的預測物，即使在獨立于GFR的情況下。通過在許多實驗室采納K/D0QI的推薦方案并日常報告GFR估算值，在未診斷CKD 的篩查中獲得了顯著成功(國家腎臟基金會(National Kidney Foundation) ,Am J Kidney Dis 2002 ；39(2Suppl 1) :S1_266 ；疾病控制和預防中心(Centers for Disease Control and Prevention) (CDC) ,Morb Mortal Wkly Rep 2007 ；56 :161-165)。但是，對于進一步風險分層并鑒定其他風險預測因子以對患有CKD、最可能發(fā)展到ESRD的患者進行定向干預， 存在著緊迫需求。我們的研究的重要發(fā)現(xiàn)是下述事實，即MR-proANP和MR-proADM與通過碘海醇測量的GFR強烈相關，碘海醇測量已被報道接近于測量腎功能的黃金標準(Bostom等，J Am Soc Nephrol 2002;13:2140-2144)。我們發(fā)現(xiàn)，在跨 GFR 等級間 MR-proANP 和 MR-proADM 的血漿濃度連續(xù)增加，表明了與疾病嚴重性的關聯(lián)。這種與GFR的強烈關聯(lián)性可能可歸因于下述證據(jù)，即ANP和ADM都在腎臟中產生(Vesely等，Am J Physiol Renal Physiol 2003 ；285 :167-177),并且兩者在腎臟中都具有重要的生物學功能(Vesely等，Cardiovasc Res 2001 ；51 :647-658 ；Nishikimi 等，Curr Med Chem 2007 ；14 :1689-1699)。此外，已報道兩種肽的腎臟保護性質，表明在CKD中ANP和ADM的濃度增加的代償性作用(Vesely等， Cardiovasc Res 2001 ；51 :647-658 ；Vesely ^,Am J Physiol Renal Physiol 2003 ；285 167-177 ；Nishikimi 等，Curr Med Chem 2007 ；14 :1689-1699)。在評估的背景下，MR-proANP和MR-proADM的預后價值，與腎臟疾病進展的已確立的預后性、但難以測定的標志物GFR的價值相當。在對年齡和性別進行調整的Cox比例風險回歸模型中，GFR、MR-proANP和MR-proADM的行為類似。但是，重要的是注意到除了 GFR之外，MR-proANP和MR-proADM兩者都顯著增加了疾病發(fā)展的預測。兩種參數(shù)中的每種增加一個標準偏差，伴有疾病發(fā)展的風險增加兩倍以上，即使是在對基線GFR進行調整之后。盡管如此，我們向模型同時添加兩種參數(shù)，獲得了兩種參數(shù)對風險預測的顯著并且獨立的貢獻。NT-proBNP 的預后能力與 GFR、MR-proANP 或 MR-proADM 相比較低。重要的是注意到在我們的研究中，GFR不是通過公式計算，而是通過碘海醇清除率來測量，其被認為是測量腎臟功能的精確方法。但是，由于使用造影介質并收集幾個血樣， 這種方法是繁瑣的，并且對于患者來說是一種負擔。測量MR-proANP或MR-proADM是替代的簡單方法，其提供了腎功能的良好近似，并為腎臟疾病的發(fā)展提供了性能良好的預測物， 其性能與GFR相等?？偟膩碚f，我們的工作證明了基線時MR-proANP和MR-proADM的增加的血漿濃度， 是腎臟疾病發(fā)展的強有力預測物。因此，兩種標志物都可以在臨床上用作初次CKD患者中的預測物。簡要方法研究樣品在基線時，227位年齡在18至65歲之間、具有CKD和各種程度的腎損傷的白人患者，在輕度至中度腎臟疾病(MMKD)研究中登記。這些患者從8個腎病科召集，如Kronenberg 等中所述(J Am Soc Nephrol 2000;11:105-115)。該研究得到學術論理委員會的批準，并且所有對象提供了書面知情同意書。在進入本研究之前，他們至少3個月具有穩(wěn)定的腎功能。排除標準是用免疫抑制劑、魚油或紅細胞生成素治療、血清肌酸酐高于6mg/dL、 任何類型的糖尿病、惡性腫瘤、肝病、甲狀腺病或傳染病、腎病綜合征(定義為蛋白尿> 3. 5g/l. 73m2/天)、器官移植、對離子造影介質過敏和妊娠。為了避免觀察者之間的差異，所有患者由一位醫(yī)生召集，他訪問了所有參加的中心。基線時的患者病史、包括吸煙嗜好和抗高血壓治療，通過會談記錄并通過檢查患者的記錄來證實。此外補充了臨床檢查，包括體重指數(shù)和血壓的評估。高血壓被定義為血壓高于140/90mm Hg和/或使用抗高血壓藥物。在研究登記的當天保持使用抗高血壓藥物，以便最小化對GFR測量的干擾。179位患者服用抗高血壓藥物(79% )利尿藥(n = 83 ；37% )、ACE抑制劑(n = 123 ；54% )、鈣通道阻斷劑 (n = 78 ；34% )、β -受體阻斷劑(n = 67 ；30% )以及 α -1 受體阻斷劑(n = 36 ；16% )0腎臟疾病的主要病因，在97位(在90位中活檢證實)患者中是腎小球腎炎，在37 位患者中是成年人多囊腎病，在M位患者中是間質性腎炎，在43位患者中是其他類型的腎臟疾病，在沈位患者中未知?；颊咴诟鶕?jù)K/D0QI的慢性腎臟疾病分類臨床實踐準則2的 CKD等級中的分布，提供在表1中。隨訪調查的終點被定義為基線血清肌酸酐加倍和/或需要換腎治療的ESRD。在 227位患者的最初組群中，177位患者(78%)被遠景性隨訪了最高84個月的時間(Boes 等，J Am Soc Nephrol 2006 ；17 =528-536) 0患者在門診病房的正規(guī)控制下，并且向研究協(xié)調中心報告終點。在隨訪過程中丟失的患者，已經(jīng)搬家或在基線調查后沒有訪問研究中心。 與參加隨附的患者相比，這些患者在基線時具有明顯更好的腎功能，但是在性別和年齡方面沒有顯著差異。生物化學分析在過夜禁食至少12小時后抽取血樣。將樣品立即在4°C下以1. 500g離心10分鐘，并將上清液以等份試樣儲存在-80°C，直到進一步使用。患者中的GFR使用碘海醇清除率技術，按照Bostom等中的詳細描述進行評估(J Am Soc Nephrol 2002 ；13 :2140-2144)。 常規(guī)的生物化學分析包括血清肌酸酐、蛋白尿、血清白蛋白和高靈敏性C-反應蛋白，按照 Kronenberg 等中的描述進行(J Am Soc Nephrol 2000 ；11 :105-115)。血漿 NT-proBNP 在 Modular Analytics E170 系統(tǒng)(Roche Diagnostics,Mannheim, Germany)上測量(Spanaus 等，Clin Chem 2007 ；53 :1洸4_1272)。MR-proANP和MR-proADM血漿濃度通過可商購的免疫發(fā)光測定系統(tǒng)(B. R. Α. H. M. S. AG，Hennigsdorf Germany)測量。這兩種方法的精確度已在以前評估和描述(Morgenthaler 等，Clin Chem 2004 ；50 :234-236 ；Morgenthaler 等，Clin Chem 2005 ；51 :1823-1829)。統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析使用SPSS 第 13. O 版(SPSS Inc. , Chicago, Illinois,USA)和 MedCalc 9. 4. 2. O軟件包(MedCalc Software,Mariakerke,Belgium)進行。各個組之間連續(xù)變量的單變量比較使用單向AN0VA、不成對t-檢驗進行，或在非正態(tài)分布變量的情況下使用非參數(shù)性Kruskal-Wallis或Wilcoxon秩和檢驗來進行。二分化變量使用Pearson的χ 2_檢驗進行比較。數(shù)據(jù)被呈現(xiàn)為平均值士標準偏差(SD)以及對于偏斜變量來說在適當時呈現(xiàn)為中位數(shù)和25th和75th百分位數(shù)。秩相關(rs)的Spearman系數(shù)被用于評估四種主要研究參數(shù)(即 GFR、NT-proBNP、MR-proANP 和 MR-proADM)之間的關系。對于 GFR、NT-proBNP、MR-proANP和MR-proADM高于和低于整個研究群體的中位數(shù)值的患者來說，產生了從基線到腎臟終點的時間分布的Kaplan-Meier估算值；計算了對數(shù)排序檢驗以比較組之間的存活曲線。使用按照整個組群的中位數(shù)濃度二分的所有四種參數(shù)，進行了單變量Cox比例風險回歸分析。此外，使用每個增量為相應數(shù)據(jù)的1個標準偏差(SD)的增量方法，計算了發(fā)展終點的調整過的風險評估值。所有概率是雙尾的，并且P值< 0.05被當做是顯著的。表1 根據(jù)腎小球濾過率(GFR)分層在國家腎臟基金會(National Kidney Foundation)等級中的227位患者的基線臨床和實驗室數(shù)據(jù)
GFRmL/min/1.73m2
>=90 (n=72)60-89 (n=49)30-59 (n=63)<30 (n=43)P-值*性別(男性/女性)，η50/2234/1544/1926/170.72(%)(69.4/30.6)(69.4/30.6)(68.8/30.2)(60.5/39.5)年齡(歲)39.9±13.246.1±11.645.9±11.554.4±8.5<0.001體重指數(shù)(kg/m2)24.0±3.325.6±3.825.4±3.426.1±4.80.02當前吸煙者，n(%)18(25)11 (22)11(18)9(21)0.97收縮壓(mmHg)134±21140±24139±19137±190.21舒張壓(mmHg)84±1388±1588±1488±130.20血清肌酸酐(mg/dL)1.14±0.22
1.54±0.45 [1.25;1.43;1.70]2.31±0.79 [1.70;2.18;2.80]3.63±1.28 P.73;3.50;4.61]<0.001GFR(mL/min/1.73m2)120±28 [97;110;132]74±9 [65;71;81]44±7 P8;44;50]19±7 [12;18;26]<0.001蛋白尿0.60±0.661.10±1.101.08±0.941.03±0.810.004(g/24h/1.73m2)
血清白蛋白(g/dL)4.70 士 0.384.46±0.504.55±0.384.53±0.340.01高靈敏性C-反應蛋白0.21±0.270.32±0.330.23±0.210.35±0.380.01(mg/L)
NT-proBNP (ng/L) f64±76 P2;39;76]180±221 [45;91;199]380±616 [78;173;409]769±846 [232;456;1002]<0.001MR-proANP (pmol/L) 156±28 [37;49;68]95±49 [60;78;120]159±123 [82;130;193]279±161 [168;248;339]<0.001MR-proADM0.43±0.120.65± 0.200.90±0.301.34±0.39<0.001(nmol/L) f
[1.15;1.28;1.52]縮寫GFR，腎小球濾過率；MR-proADM，中段腎上腺髓質素原；MR-proANP，中段A型利尿鈉肽原；NT-proBNP，氨基端B型利尿鈉肽原。*P-值用于在適合時從Kruskal-Wallis檢驗、單向ANOVA和卡方檢驗獲得的所有 4個組之間進行比較。數(shù)據(jù)被呈現(xiàn)為平均值士SD，以及對于偏斜變量來說在適當時呈現(xiàn)為25th、50th(= 中位數(shù))和75th百分位數(shù)。t可以在 222、221 和 220 位患者中分別獲得 NT-proBNP、MR-proANP 和 MR-proADM 的血漿水平。表2.在227位登記患者中在基線時的變量GFR、NT-proBNP、MR-proANP和 MR-proADM血漿濃度之間的Spearman相關系數(shù)(ρ-值)
權利要求
1.一種用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展或用于監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，所述方法包含下列步驟(a)提供來自患有初次慢性腎臟疾病的患者的樣品，(b)測定ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平，(c)將ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平與初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測相關聯(lián)。
2.權利要求1的方法，其中所述患者被分類為發(fā)展者或非發(fā)展者。
3.權利要求1或2的方法，其中測定ANP或其片段或其前體或所述前體的片段的水平并將其用作單一標記物。
4.權利要求1到3的方法，其中ANP或其片段或其前體或所述前體的片段選自 NT-proANP、MR-proANP 和成熟 ANP。
5.權利要求1到3的方法，其中測定ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平并將其用作單一標記物。
6.權利要求1、2或5的方法，其中ADM或其片段或其前體或所述前體的片段選自成熟 ADM、MR-proADM、PAMP 和 CT-proADM。
7.權利要求1到6的方法，其中初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的預測，通過附加地測定并使用至少一種實驗室參數(shù)或其他標志物的水平來改進，所述其他標志物選自肌酸酐、GFR、蛋白尿、白蛋白、CRP、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、⑶F15、ST2、NGAL、降鈣素原及其片段、BNP或其片段或其前體或所述前體的片段、血管加壓素原及其包括和肽素、血管加壓素和后葉激素運載蛋白II的片段、內皮素原-I及其包括CT-proET-l、NT-proET-l、大內皮素-1和內皮素-1的片段。
8.權利要求1到7的方法，其中附加地測定選自下列的至少一種臨床參數(shù)年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓治療、體重指數(shù)、當前吸煙嗜好。
9.前述權利要求任一項的用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展和用于監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的方法，其中ANP和/或ADM或其前體或片段的水平單獨地或與其他預后有用的實驗室或臨床參數(shù)聯(lián)合，通過可以選自下列可選方案的方法用于預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展-與初次慢性腎臟疾病患者群體中全部預定樣品中的ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平的中位數(shù)進行比較，-與初次慢性腎臟疾病患者群體中全部預定樣品中的ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的水平的分位數(shù)進行比較，-根據(jù)Cox比例風險分析或使用風險指數(shù)計算例如NRI (凈重新分類指數(shù))或IDI (綜合鑒別指數(shù))進行計算。
10.前述權利要求任一項的方法，其中使用診斷測定方法測量MR-proADM的水平，所述診斷測定方法包含一個或多個針對位于Pre-proADM的第45-92位氨基酸中的一個或多個表位的捕獲探針。
11.ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段在患有初次慢性腎臟疾病的患者中預測腎臟終點的應用。
12.ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的應用。
13.ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段將患有初次慢性腎臟疾病的患者分類成發(fā)展者或非發(fā)展者的應用。
14.權利要求1到11任一項的方法監(jiān)測腎功能的應用。
15.針對ANP和/或ADM或其片段或其前體或所述前體的片段的捕獲探針預測初次慢性腎臟疾病的發(fā)展的應用。
全文摘要
本發(fā)明的主題是用于預測初次慢性腎臟疾病(CKD)的發(fā)展或用于監(jiān)測慢性腎臟疾病療法的測定方法和體外方法，所述方法包含測定ANP和/或ADM或其前體或其片段的水平。
文檔編號G01N33/74GK102203621SQ200980142234
公開日2011年9月28日 申請日期2009年10月22日 優(yōu)先權日2008年10月22日
發(fā)明者弗洛里安·克羅嫩貝格, 托馬斯·穆勒, 本杰明·德普林格, 約阿希姆·斯特魯克, 芭芭拉·科勒里茲 申請人:B.R.A.H.M.S有限公司