專利名稱：肝癌預(yù)后標記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝癌預(yù)后標記物(marker for prognosis of liver cancer)；涉及用于評估肝癌預(yù)后的組合物，該組合物包含能夠檢測所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平的變化的物質(zhì)；涉及用于評估肝癌預(yù)后的試劑盒，該試劑盒包含所述用于評估肝癌預(yù)后的組合物； 涉及使用所述肝癌預(yù)后標記物進行肝癌預(yù)后評估的方法；以及涉及使用所述肝癌預(yù)后標記物來篩選肝癌的治療劑的方法。
背景技術(shù)：
癌癥與惡性腫瘤有相同的意義。它是指這樣一種疾病，由于各種原因，調(diào)節(jié)細胞增殖的功能受到損害，因此異常的細胞不受控制并過度增殖從而穿透至周圍的組織和器官， 形成塊狀物并破壞正常的組織。由于癌癥的快速生長、滲透性的(穿透性的或擴散的)生長、擴散(從其發(fā)生區(qū)域移動很遠)等原因，源于人體內(nèi)各種組織的癌癥會給人的生命帶來危險。在癌癥當中，已知肝癌是世界上最致命的癌癥之一。尤其是，據(jù)報導(dǎo)稱，在亞洲和次撒哈拉的非洲區(qū)，每年至少約有50萬人死于肝癌。肝癌主要分為起源于肝細胞自身的肝細胞癌和癌癥由其他組織擴散至肝臟的轉(zhuǎn)移性肝癌。大約至少90%的肝癌為肝細胞癌，通常理解術(shù)語肝癌是指肝細胞癌。據(jù)報導(dǎo)大多數(shù)肝癌的起因是受到乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的急性或慢性感染。然而，有關(guān)肝癌發(fā)生和發(fā)展的細胞內(nèi)的分子機制還沒有被闡明。根據(jù)傳統(tǒng)研究，據(jù)報導(dǎo)稱在諸如各種生長因子基因等原癌基因由于各種原因突變成癌基因而過度表達或過度激活的情況下，或者在諸如Rb蛋白或p53蛋白之類的腫瘤抑制基因由于各種原因突變而低表達或喪失功能的情況下，可以引起包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。尤其是，關(guān)于肝癌，已經(jīng)證實例如經(jīng)修飾的ρ53、β-連環(huán)蛋白(beta-catenin)、AXINI、p21(WAFl/CIPl)和 p27Kip等基因為與其相關(guān)。但是，近來認識到，包括肝癌在內(nèi)的大多數(shù)癌癥的發(fā)生和發(fā)展并不由于單獨的特定基因，而是由于與細胞周期、信號傳遞等有關(guān)的多種基因的復(fù)雜相互作用。因而，有必要從只集中在個別的基因或蛋白的表達或功能中脫離出來，而進行對各種基因或蛋白的整體研究。肝癌的預(yù)后是指預(yù)見患有肝癌的患者的各種情況，例如從肝癌中全面康復(fù)的可能性，經(jīng)治療后復(fù)發(fā)的可能性，肝癌診斷后患者生存的可能性等等。這可以根據(jù)疾病的嚴重性、診斷時間、治療進展等各種情況而變化。只有根據(jù)其預(yù)后適當?shù)貞?yīng)用各種治療方法時， 肝癌才能夠得到有效的治療。例如，對于被評估為有良好的預(yù)后的患者，有必要避免可能對患者引起嚴重副作用的危險的治療方法，例如激進的化療或手術(shù)、放療等，而選擇那些相對溫和、保守和安全的治療方法。另一方面，對于被評估為有較差的預(yù)后的患者，應(yīng)當積極地進行化療或手術(shù)，例如放療等治療方法以力圖增加生存期或生存率。根據(jù)迄今為止進行的研究，已經(jīng)發(fā)展的肝癌的預(yù)后非常糟糕，顯示了自診斷起6 個月內(nèi)死亡的高致死率，剩余僅四個月的平均壽命長度。但是，大小小于3厘米的肝癌有良好的預(yù)后，且已知無需任何特別治療，一年的生存率為90%，且手術(shù)后5年的生存率為約 40 50%。然而，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)很難精確地評估肝癌患者的預(yù)后。為了精確評估預(yù)后，需要一種把患者劃分為各風(fēng)險組群的分析方法。然而，迄今為止，僅僅依靠在診斷和初次手術(shù)治療時的臨床病理肝癌階段來確定預(yù)后，而沒有一種用于精確評估肝癌的方法。但是，不幸的是，僅僅通過肝癌階段無法精確確定每一位肝癌患者的預(yù)后。CBS蛋白(胱硫醚β -合酶)是一種將同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變成胱硫醚的酶，已知其在轉(zhuǎn)硫(transsulfuration)通路中起作用，并在體內(nèi)蛋氨酸代謝中發(fā)揮重要作用[J Biol Chem. 1994 May 20 ；269 (20) :14835-40]。NNMT蛋白(煙酰胺N甲基轉(zhuǎn)移酶)是一種進行煙酰胺和吡啶的N-甲基化的酶，已知其與各種藥物和異生物的代謝有關(guān)[Genomics. 1998 Sep 15 ；52 (3) :312-24]。TKT蛋白(轉(zhuǎn)酮醇酶)是一種在非氧化的磷酸戊糖途徑中發(fā)揮核心作用的酶，作為該族的成員，已知有TKTLl (轉(zhuǎn)酮醇樣酶1)、TKTL2 (轉(zhuǎn)酮醇樣酶2) [J Biol Chem. 1993 Jan 15 ；268 (2) :1397-404]。AIFMl蛋白(線粒體相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)因子1)是也稱為AIF的黃素蛋白。已知若發(fā)生細胞凋亡，則該蛋白移動至細胞核，引起染色體的聚集和斷裂，并誘導(dǎo)來自線粒體的細胞色素 c 和半胱天冬酶 9 的分泌[Nature. 1999 Feb 4 ；397 (6718) :441-6]。AKT蛋白是與AKT2、AKT3有關(guān)的蛋白，并且已知其在通過磷脂酰肌醇3激酶生長因子信號傳遞(即，血小板源生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素和胰島素樣生長因子I (IGF-I)等的信號傳遞)中起作用，當其被激活時，已知能夠磷酸化凋亡相關(guān)蛋白并使它們失活[Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jul ；84 (14) :5034-7]。ATG3蛋白(自噬相關(guān)3同源物)參與了諸如GATE_16、GABARAP、MAP_LC3等人ATG8 同源物與脂類之間的結(jié)合。有報道稱缺乏ATG3的小鼠不形成自噬小體，并在出生后一天內(nèi)死亡[J Biol Chem. 2002 Apr 19 ；277 (16) 13739-44. Epub 2002 Feb 1]。ATG5蛋白(自噬相關(guān)5同源物)與自噬作用有關(guān)。ATG5已知能夠通過ATG7和 ATGlO的作用形成ATG12-ATG5綴合物，并且該ATG12-ATG5綴合物移動到自噬小體膜處以在ATG8和磷脂酰乙醇胺的結(jié)合中起作用。有報道稱缺乏ATG5的小鼠不形成自噬小體，并在出生后立即死亡，且截斷的ATG5能夠誘導(dǎo)細胞色素c的分泌和激活線粒體內(nèi)的半胱天冬酶9[Nature 432 1032-1036(2004)] ATG7蛋白(自噬相關(guān)7同源物)與自噬作用有關(guān)。有報導(dǎo)稱ATG7與ATGlO — 起形成ATG12-ATG5綴合物，而ATG7與ATG3 —起參與ATG8和磷脂酰乙醇胺的結(jié)合。缺乏 ATG7的小鼠不形成自噬小體，并在出生后立即死亡[J Biol Chem. 2001 Jan 19 ；276 (3) 1701-6. Epub 2000 Nov 28]。ATG12蛋白(自噬相關(guān)12同源物)與自噬作用有關(guān)。已知ATG12通過ATG7和 ATGlO的作用形成ATG12-ATG5綴合物，并且該ATG12-ATG5綴合物移動到自噬小體膜處以在 ATG8 和磷脂酰乙醇胺的結(jié)合中起作用[J Biol Chem. 1998 Dec 18 ；273 (51) :33889-92]。BAX蛋白(BCL2相關(guān)X蛋白)BCL2蛋白族的一員，已知其通過與BCL2的結(jié)合促進細胞凋亡，并且與線粒體膜電位的損失和細胞色素c的分泌有關(guān)[Cell. 1993 Aug 27 ；74(4) 609-19]。BCL2蛋白(B細胞淋巴瘤蛋白2)是一種線粒體的膜蛋白，能夠抑制細胞凋亡。已知其抑制細胞色素c從線粒體的分泌，激活半胱天冬酶并通過與凋亡激活因子的結(jié)合抑制細胞凋亡[Proc Natl Acad Sci USA. 1986 Jul ；83 (14) :5214-8]。BCL2L1蛋白(Bcl_2樣1蛋白)是BCL2蛋白組的一員，已知其位于線粒體的外膜并與線粒體膜通道的分配有關(guān)。它以兩種亞型存在。較長形式的BCL-XL已知能夠抑制細胞凋亡，而較短形式的BCL-XS能夠促進細胞凋亡[Cell. 1993 Aug 27 ；74(4) :597-608]。BNIP3蛋白(BCL2/腺病毒ElB 19kD_相互作用蛋白3)能夠與ElB 19kDa蛋白和BCL2結(jié)合，且已知可以誘導(dǎo)細胞凋亡和自噬作用[J Exp Med. 1997 Dec 15 ；186(12) 1975-83]。CASP8蛋白(半胱天冬酶8，凋亡相關(guān)的半胱天冬酶)是屬于半胱天冬酶家族的酶，它是通過FAS在細胞凋亡機制初始階段起作用的酶。如果其通過與FADD的結(jié)合和蛋白水解性切割而激活，它激活各種其他的半胱天冬酶[Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Dec 10 ；93 (25) :14486-91 ；Biochem J. 1997 Aug 15 ；326 (Pt 1) :1_16]。CSElL蛋白(CSE1染色體分離1樣)已知在將importin-α再次從細胞核發(fā)送至細胞質(zhì)中起作用，并與細胞凋亡或細胞增殖有關(guān)[Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Oct 24 ； 92(22) :10427-31]。DIABLO蛋白(具有低等電點的直接的IAP結(jié)合蛋白)是一種位于線粒體內(nèi)的蛋白，且如果發(fā)生細胞凋亡，則它移動至細胞質(zhì)與IAP(凋亡抑制物蛋白)結(jié)合以幫助半胱天冬酶的激活[Cell. 2000 Jul 7 ；102(1) :43-53]。DRAM蛋白(損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控蛋白)是一種溶酶體的膜蛋白，已知其與p53腫瘤抑制子控制的自噬作用有關(guān)并且在P53控制的細胞凋亡中是必須的[Cell. 2006 Jul 14； 126(1) :121-34]。E2F1蛋白(E2F轉(zhuǎn)錄因子1)是E2F家族轉(zhuǎn)錄因子的一員，已知其與細胞周期和腫瘤抑制子的控制密切相關(guān)，并且通過與Rb蛋白的結(jié)合促進細胞生長或誘導(dǎo)與p53相關(guān)的細胞凋亡 Wene. 1996 Sep 16 ； 173 (2) :163-9]。FAS蛋白(AP0-1，CD95，TNFRSF6)是TNF受體家族的一員。已知其接受FAS配體的信號并與FADD(Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白)、半胱天冬酶8以及半胱天冬酶10 —起組成DISC (死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物)來誘導(dǎo)細胞凋亡[J Biol Chem. 1992 May 25 ；267 (15) 10709-15]。FRAPl蛋白(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)也稱為mTOR。已知其調(diào)節(jié)諸如細胞內(nèi) DNA損傷、營養(yǎng)耗盡等與壓力有關(guān)的反應(yīng)，且包含F(xiàn)RAPl的T0RC2復(fù)合物已知是細胞周期阻滯和FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物的抑制免疫作用的靶點[Nature. 1994 Jun 30 ；369 (6483) 756-8]。LAMPl蛋白(溶酶體相關(guān)膜蛋白1)也稱為⑶107a抗原。它是一種膜糖蛋白，且似乎與癌細胞的擴散有關(guān)[J Biol Chem. 1990 May 5 ；265 (13) =7548-51] LC3蛋白(MAPI輕鏈3樣蛋白1)是微管結(jié)合蛋白，它與微管與細胞骨架間的相互作用有關(guān)。LC3蛋白是酵母ATG8的同源物，已知其能夠通過多種自噬蛋白的作用與磷脂酰乙醇胺結(jié)合并組成自噬小體[J Biol Chem. 1994 Apr 15 ；269 (15) :11492-7]。PRKAAl蛋白(AMP激活的蛋白激酶，催化性，α-1)是AMPK的催化亞基。該AMPK 是起到檢測細胞內(nèi)能量水平的作用的蛋白。已知它在當ΑΜΡ/ΑΤΡ比例增高時激活以限制各種生物合成反應(yīng)[FEBS Lett. 1994 Dec 12 ；356(1) :117-21]。PTEN蛋白(磷酸酶和張力蛋白同源物)已知是一種腫瘤抑制子，在多種類型的癌癥中失活。它既是一種蛋白磷酸酶同時也是一種磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3磷酸酶，已知其能夠破壞 Pi:3K-AKT/PKB 信號傳遞[Nat Genet. 1997 Apr ； 15 (4) :356-62]。ULKl蛋白(Unc-51樣激酶1)是一種與軸突生長有關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，也稱為ATGl同源物。對于自噬作用而言，已知其能夠被mTOR磷酸化[Genomics. 1998 Jul 1 ； 51 (1) :76-85]。XIAP蛋白(X連鎖凋亡蛋白抑制子)是IAP家族的一員，且在IAP中，它有強的細胞凋亡抑制效果。已知其通過與腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)因子TRAF1、TRAF2的結(jié)合抑制細胞凋亡并抑制半胱天冬酶的活性[Nature. 1996 Jan 25 ；379 (6563) :349-53]。但是，還不清楚這些蛋白表達水平和表達模式在肝臟組織中如何具體變化，以及如何使用這些蛋白評估肝癌預(yù)后。而且，迄今為止還沒有使用蛋白或編碼蛋白的基因作為用于肝癌預(yù)后標記物的實例。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)課題本發(fā)明的一個目的是提供一種有關(guān)肝癌預(yù)后的生物標記物，以容易且精確地評估肝癌患者的預(yù)后，和還提供一個開發(fā)用于肝癌的治療劑的重要的起點。因而，本發(fā)明提供了一種肝癌預(yù)后標記物；一種用于評估肝癌預(yù)后的組合物，該組合物包含能夠檢測所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平的變化的物質(zhì)；一種用于評估肝癌預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含所述用于評估肝癌預(yù)后的組合物；一種使用所述肝癌預(yù)后標記物進行肝癌預(yù)后評估的方法；以及一種使用所述肝癌預(yù)后標記物來篩選肝癌的治療劑的方法。技術(shù)方案本發(fā)明比較取自多位診斷為患有肝癌的患者的肝癌組織中的基因表達程度，并根據(jù)每位患者的進展檢測特異性大量或小量表達的基因，從而發(fā)現(xiàn)能夠用于評估肝癌預(yù)后的肝癌預(yù)后標記物。本發(fā)明的第一個方面涉及肝癌預(yù)后標記物，所述肝癌預(yù)后標記物包含選自由下列基因組成的組中的一個或至少兩個基因的組合CBS (胱硫醚 β -合酶；NCBI GI :209862802 ；SEQ ID NO 79)；NNMT (煙酰胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶；NCBI GI :62953139 ；SEQ ID NO 80)；TKT(轉(zhuǎn)酮醇酶；NCBI GI :205277461 ；SEQ ID NO 81)；AIFMl (線粒體相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)因子 1 ；NCBI GI =22202627 ；SEQ ID NO 82)；AKTKRAC-α 絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶；NCBI GI :62241010 ；SEQ ID NO 83)；ATG3(自噬相關(guān)蛋白 3 ；NCBI GI :34147490 ；SEQ ID NO 84)；ATG5(自噬相關(guān)蛋白 5 ；NCBI GI :92859692 ；SEQ ID NO 85)；ATG7(自噬相關(guān)蛋白 7 ；NCBI GI :222144225 ；SEQ ID NO 86)；ATG12(自噬相關(guān)蛋白 12 ；NCBI GI :38261968 ；SEQ ID NO 87)；BAX (凋亡調(diào)節(jié)因子 BAX ；NCBI GI :34335114 ；SEQ ID NO 88)；BCL2(凋亡調(diào)節(jié)因子 Bcl-2 ；NCBI GI :72198188 ；SEQ ID NO 89)；
BCL2L1 (凋亡調(diào)節(jié)因子 Bcl-X ；NCBI GI :20336333 ；SEQ ID NO 90)；BNIP3(BCL2/腺病毒 ElB 19kD 相互作用蛋白 3 ;NCBI GI :7669480 ；SEQ ID NO: 91)；CASP8(半胱天冬酶 8 ；NCBI GI :122056470 ；SEQ ID NO 92)；CSElL (Exportin-2 ；NCBI GI :29029558 ；SEQ ID NO 93)；DIABLO (Diablo 同源物，線粒體；NCBI GI :218505810 ；SEQ ID NO 94)；DRAM (損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控蛋白；NCBI GI :110825977 ；SEQ ID NO 95)；E2F1 (轉(zhuǎn)錄因子 E2F1 ；NCBI GI :168480109 ；SEQ ID NO 96)；FAS(腫瘤壞死因子受體超家族成員 6 ；NCBI GI =23510419 ；SEQ ID NO 97)；FRAPl (FKBP12-雷怕霉素復(fù)合物相關(guān)蛋白；NCBI GI :206725550 ；SEQ ID NO 98)；LAMPl (溶酶體相關(guān)膜糖蛋白 1 ；NCBI GI :112380627 ；SEQ ID NO 99)；LC3[MAP1LC3A](微管結(jié)合蛋白 1A/1B 輕鏈 3A ;NCBI GI :31563519 ；SEQ ID NO: 100)；PRKAAl (5 ‘ -AMP激活的蛋白激酶催化亞基 α -1 ；NCBI GI :94557300 ；SEQ ID NO 101)；PTEN (磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3磷酸酶和雙特異性的蛋白磷酸酶PTEN ；NCBI GI :110224474 ； SEQ ID NO :102)；ULKl (絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶 ULKl ；NCBI GI :225637564 ；SEQ ID NO :103)；和XIAP (含桿狀病毒 IAP 重復(fù)序列的蛋白 4 ；NCBI GI :32528298 ；SEQ ID NO :104)。肝癌的預(yù)后可以從多個方面來評估。然而，典型地從復(fù)發(fā)的可能性、生存的可能性以及無病生存的可能性等方面來確定。本說明書中所描述的研究通過下述方式進行從多位肝癌患者的肝癌組織中獲取基因表達譜，總體考慮復(fù)發(fā)的可能性、生存的可能性以及無病生存的可能性等方面以通過進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理過程來檢測在表達水平顯著差異的基因， 并發(fā)現(xiàn)能夠評估肝癌預(yù)后的標記物。在本說明書中，“肝癌預(yù)后標記物”是指一種基因標記物，它是用于評估肝癌發(fā)生后患者具有好的或差的預(yù)后的標準。本發(fā)明中，在有著良好的預(yù)后的患者的肝癌組織內(nèi)該標記物的表達水平與通過實驗預(yù)先確定的標準水平相比顯著的高或低。尤其是，在本發(fā)明中，該標記物具有顯著低的P值，該值是基于有著良好的預(yù)后和較差的預(yù)后的患者的肝癌組織中的表達差異計算的。優(yōu)選，P值小于0.05。對于多位已知患有肝癌的患者的肝癌組織，本發(fā)明通過將有著良好的或較差的治療進展的患者的肝癌組織的基因表達譜與標準水平比較而進行分析。因此，如此確定的標記物能夠特異性區(qū)別有著良好的肝癌預(yù)后或較差的肝癌預(yù)后的患者，因而其能夠有效地用于肝癌預(yù)后的評估。而且，考慮到如此確定的標記物在有著特定預(yù)后的患者中的肝癌組織中特異性大量表達或小量表達，該標記物的生理學(xué)功能有可能直接涉及有關(guān)肝癌的發(fā)生和進展的生理學(xué)功能，尤其是肝癌的預(yù)后。因此，該標記物能夠有效地用做肝癌的發(fā)生和進展的研究中的靶標或用于肝癌的治療劑的開發(fā)。特別地，在本發(fā)明的第一個方面中的肝癌預(yù)后標記物是基于空前的多位患者的肝癌組織的統(tǒng)計分析而發(fā)現(xiàn)的。因而，與基于僅僅一些患者的肝癌組織的基因表達譜而發(fā)現(xiàn)的關(guān)于肝癌的常規(guī)標記物相比，所述標記物有著較大的顯著性，具有較高的臨床利用價值，且具有用于評估肝癌預(yù)后的更精確的評估力。本發(fā)明的第二個方面涉及用于評估肝癌預(yù)后的組合物，所述組合物包含有能夠特異性檢測第一方面中所述的肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的物質(zhì)。這里，可以通過確定由相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA的水平或模式的一般生化分析方法來檢測每種肝癌預(yù)后標記物的表達水平或表達模式。像這樣的用于確定mRNA的水平或模式的分析方法有RT-PCR、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、RNA酶保護實驗、Northern印記、 DNA微陣列等等。此外，可以使用在相關(guān)領(lǐng)域中通常使用的方法。通過上述的分析方法，能夠?qū)⒏伟┗颊叩纳飳W(xué)樣本中的mRNA的水平或模式與標準水平進行比較，并從中檢測本發(fā)明的肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的差異。這使得能夠評估肝癌患者的預(yù)后。在本說明書中，“生物學(xué)樣本”是指能夠檢測到所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平或表達模式，或者由所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式的分離自人體內(nèi)細胞、組織等等。其可以例如是尿、血液、血漿、血清等，但不具體僅限于這些。用于通過RT-PCR測定mRNA的水平或模式的試劑盒包含有本發(fā)明的所述肝癌預(yù)后標記物的mRNA的特異引物。在本說明書中，“引物”是指能夠互補地與模板結(jié)合并使逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶能夠啟動模板復(fù)制的具有自由3’羥基的核酸序列。引物是具有與特定基因核酸序列互補的序列的核苷酸，可以使用長度約7bp 50bp、優(yōu)選約IObp 30bp的引物。其他的RT-PCR試劑盒根據(jù)具體的實施方式可以包括試管或其他適合的容器、反應(yīng)緩沖液、脫氧核苷酸(dNTP)、酶如Taq聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC-水、無菌水等。在合適的緩沖溶液中和溫度下，引物能夠在聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶) 和四種不同的三磷酸核苷以及溫度存在的情況下啟動DNA的合成。所述引物可以包含不改變在DNA合成起始點起作用的引物的基本性質(zhì)的其他堿基序列。可以使用公知的方法化學(xué)合成引物，且可以使用相關(guān)領(lǐng)域中公知的多種方法來將核酸序列轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的第二個方面中的“能夠特異性檢測肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的物質(zhì)”可以是在相應(yīng)的肝癌預(yù)后標記物的表達水平或表達模式的分析方法中特異性用于相應(yīng)標記物的任何物質(zhì)，或者是所述物質(zhì)中至少兩種的組合，并不限于用于RT-PCR 的引物。本發(fā)明的第二個方面的技術(shù)特性在于將被試肝癌患者的肝癌組織中的所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平或表達模式與標準水平比較，并檢測差異。因而，任何能夠檢測這樣差異的物質(zhì)可以被用作“能夠特異性檢測肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的物質(zhì)”，并實現(xiàn)本發(fā)明的目標技術(shù)效果。而且，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)具體的實施方式參照相關(guān)領(lǐng)域的公知常識能夠選擇并使用合適的物質(zhì)。本發(fā)明的第三個方面涉及到用于評估肝癌預(yù)后的組合物，所述組合物包含有能夠特異性檢測第一方面中的所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)。關(guān)于本發(fā)明的所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平或表達模式，除了本發(fā)明的第二個方面中的檢測根據(jù)每一種標記物的mRNA的水平或模式的方法之外，還可以使用用于檢測樣本中每一種標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式以估計每一種標記物的表達水平或表達模式的方法。本發(fā)明中所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式的特異性檢測是指確定生物學(xué)樣本中存在多少本發(fā)明中所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白和其以何種模式存在的方法。例如，與所述肝癌預(yù)后標記物編碼的蛋白特異結(jié)合的抗體能夠用于確定存在水平或存在模式的過程。本說明書中，“抗體”是指能夠與抗原的表位特異結(jié)合的蛋白，它是一個包含有多克隆抗體、單克隆抗體以及重組抗體的概念。對于使用抗體測定蛋白的存在水平或存在模式的方法，有蛋白質(zhì)印跡、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、放射免疫測定、放射免疫擴散、Ouchterlony免疫擴散、火箭免疫電泳 (rocket Immunoelectrophoresis)、組織免疫染色、免疫沉淀測定、補體結(jié)合試驗、FACS(熒光活化細胞分類)、蛋白芯片等。但是，除上述以外，可以使用在相關(guān)領(lǐng)域中普遍采用的任何方法。通過上述的分析方法，可以將被試肝癌患者的生物學(xué)樣本中的抗原抗體復(fù)合物的形成水平或形成模式與標準水平比較，且能夠從中確定本發(fā)明的所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式，并最終能夠評估肝癌患者的預(yù)后。這里，“抗原抗體復(fù)合物”是指所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白和它的特異抗體的復(fù)合物。一般通過檢測與二抗偶聯(lián)的檢測標記信號的大小和模式來測定抗原抗體復(fù)合物的形成水平或形成模式。這樣的檢測標記例如可以是酶、熒光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、納米粒子、氧化還原分子、放射性同位素等等，但并不限于這些。當使用酶作為檢測標記時，作為能夠使用的酶有β-葡糖醛酸糖苷酶(β-gluculonidase)、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、尿素酶、過氧化物酶或堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP 酶、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶、熒光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸烯醇式丙酮酸脫羧酶、內(nèi)酰胺酶等等，但所述酶并不限于這些。當使用熒光物質(zhì)作為檢測標記時，作為能夠使用的熒光物質(zhì)有熒光素(fluorescein)、異硫氰酸鹽、羅丹明、藻紅素、藻青素、別藻藍素、鄰苯二甲醛、熒光胺等，但所述熒光物質(zhì)并不限于這些。當使用配體作為檢測標記時，作為能夠使用的配體有生物素衍生物等等，但所述配體并不限于這些。當使用發(fā)光物質(zhì)作為檢測標記時，作為能夠使用的發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯、發(fā)光素 (Iuciferin)、發(fā)光素酶(luciferase)等，但所述發(fā)光物質(zhì)并不限于這些。當使用納米粒子作為檢測標記時，作為能夠使用的納米粒子有膠體金、著色膠乳(tinted latex)等等，但所述納米粒子并不限于這些。當使用氧化還原分子作為檢測標記時，作為能夠使用的氧化還原分子有二茂鐵、釕絡(luò)合物、紫羅堿(viologen)、醌、Ti離子、Cs離子、二酰亞胺、1，4_苯醌、 氫醌、K4W(CN)8、
2+、[RU (bpy) 3] 2+、[MO (CN) 8] 4-等，但所述氧化還原分子并不限于這些。當使用放射性同位素作為檢測標記時，作為能夠使用的放射性同位素有3H、14C、 32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、1251、1311 or 186Re 等等，但所述放射性同位素并不限于這些。在本發(fā)明的第三個方面中，“能夠特異性檢測所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)”可以是在檢測所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)的分析方法中特異性用于所述標記物所編碼蛋白的任何物質(zhì)，并不一定限于抗體。本發(fā)明的第三個方面的技術(shù)特征在于將取自肝癌患者的生物樣品中的所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式與基準比較，并檢測差異。 因而，任何的物質(zhì)均可以被用作“能夠特異性檢測肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)”并能實現(xiàn)本發(fā)明旨在達到的技術(shù)效果，只要該物質(zhì)能夠檢測到這樣差異即可。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于本領(lǐng)域的一般常識和已知技術(shù)，根據(jù)具體實施方式
能夠容易選擇/揀選合適的物質(zhì)。本發(fā)明的第四個方面涉及預(yù)測肝癌預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含有本發(fā)明第二或第三方面所述的用于預(yù)測肝癌預(yù)后的組合物。除了包含在用于評估肝癌預(yù)后的組合物中的能夠特異性檢測肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的物質(zhì)，或能夠特異性檢測肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)，本發(fā)明中用于評估肝癌預(yù)后的試劑盒還可以包括適用于分析基因的表達水平或表達方式的方法或分析蛋白的存在水平或存在模式的方法的一種或多種其他成份、溶液或裝置。例如，對于檢測基因的表達水平或表達模式的診斷試劑盒，該診斷試劑盒可以包括進行RT-PCR所需的基本成份，除了標記物基因的mRNA各自特異性的引物外，該RT-PCR試劑盒根據(jù)具體的實施方式可以包括例如試管或其他適合的容器、反應(yīng)緩沖液、脫氧核苷酸(dNTPs)、酶例如Taq聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA酶、RNA酶抑制劑、DEPC-水 (DEPC水)、無菌水、用作定量的對照組的基因特異性引物對等。同時，在診斷試劑盒用于檢測蛋白的存在水平或存在模式的情況下，該診斷試劑盒可以包括例如進行ELISA所需的基本成份。該ELISA試劑盒可以包括能夠檢測結(jié)合抗體的組分，例如，標記的二抗、生色團、酶 (例如與抗體連接的酶)及其底物，和對定量對照組蛋白特異的抗體。進一步地，根據(jù)具體的實施方式，該診斷試劑盒可以包括DNA微陣列或蛋白微陣列。本發(fā)明的第五個方面涉及一種用于肝癌預(yù)后評估的方法，該方法包括步驟1，使用第二方面的用于評估肝癌預(yù)后的組合物對取自被試肝癌患者的生物學(xué)樣本進行處理；和步驟2，通過將步驟1的處理結(jié)果與基準進行比較，檢測權(quán)利要求1中的肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的差異。此外，發(fā)明的第五個方面涉及一種用于肝癌預(yù)后評估的方法，該方法包括步驟1，使用第三方面的用于評估肝癌預(yù)后的組合物處理取自肝癌患者的生物學(xué)樣本；和步驟2，通過將步驟1的處理結(jié)果與基準進行比較，檢測權(quán)利要求1中的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白在存在水平和/或存在模式的差異。例如，對在肝癌預(yù)后良好的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預(yù)后標記物進行表達水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物的表達水平高于基準， 可以得知肝癌的預(yù)后相對較好。同時，例如對在肝癌預(yù)后差的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預(yù)后標記物進行表達水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物的表達水平高于基準，可以得知肝癌的預(yù)后相對較差。同時，例如，對在肝癌預(yù)后良好的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白進行存在水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物所編碼的蛋白的存在水平高于基準，可以得知肝癌的預(yù)后相對較好。同時，例如在對肝癌預(yù)后較差的患者的肝癌組織中表達更多的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白進行存在水平差異檢測時，如果來自被試肝癌患者的生物樣本中該標記物所編碼的蛋白的存在水平高于基準， 可以得知肝癌的預(yù)后相對較差。本發(fā)明的第六個方面涉及使用本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物來篩選肝癌治療劑的方法。由于本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物根據(jù)肝癌患者的預(yù)后而顯示出表達模式的顯著差異，它可以是直接參與和肝癌的發(fā)生或發(fā)展特別是預(yù)后有關(guān)的生理學(xué)功能的基因。因此，該標記物所編碼的蛋白能夠有效地用做研究肝癌的發(fā)生或發(fā)展機制或發(fā)明肝癌治療劑的目標蛋白。即，本發(fā)明第一個方面所述肝癌預(yù)后標記物符合開發(fā)肝癌的治療劑的重要前提，并因此該使用該標記物來篩選肝癌治療劑的方法也涵蓋在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。作為本發(fā)明的第六個方面的一個實例，提供了篩選肝癌的治療劑的方法，所述方法包括檢測測試化合物是否能促進或抑制本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物的表達的步驟。作為篩選治療劑的方法，可以使用例如RT-PCR、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、RNA酶保護實驗、northern印記、DNA微陣列、SAGE [基因表達系列分析；Velculescu等，Science 270 :484-7]、MPSS[大規(guī)模平行標記測序；Brenner 等，PNAS. USA. 97，1665-1670]等。除了以上方法外，如有必要可以使用本領(lǐng)域的各種已知方法。同時，作為本發(fā)明的第六個方面的另一個實例，提供了篩選肝癌的治療劑的方法，所述方法包括步驟1，將測試化合物與本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白結(jié)合；和步驟2，檢測該測試化合物能否促進或抑制所述蛋白的生理學(xué)活性。作為篩選治療劑的方法，例如，可以使用將本發(fā)明的第一個方面的用于肝癌早期診斷的蛋白標記物固定到親和柱上并將其與樣本接觸來純化樣品的方法[Pandya等，Virus Res 87 135-143，2002]，使用酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白質(zhì)印跡的方法，高通量篩選的方法[Aviezer 等，J Biomol Screen 6 :171-7,2001]等。除了以上方法外，如有必要可以使用本領(lǐng)域的各種已知方法。在本發(fā)明的第六個方面中，作為用于篩選的測試化合物，可以使用例如組織提取物、基因文庫的表達產(chǎn)物、合成化合物、合成多肽、天然化合物等，但是用于篩選的測試化合物并不限于這些。本發(fā)明第七個方面涉及特異性識別由本發(fā)明第一個方面的肝癌預(yù)后標記物編碼的蛋白的抗體。特異性識別本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物的抗體是特異性檢測肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平或存在模式的代表性物質(zhì)，因而能夠有效地用于評估肝癌預(yù)后。此外，根據(jù)情況，所述抗體可以特異性促進或抑制在肝癌的發(fā)生或發(fā)展中起重要作用的蛋白的活性，因而能夠用作用于肝癌的治療劑。由于已經(jīng)找到本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物，通過使用本領(lǐng)域廣泛知曉的技術(shù)能夠容易地進行所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的多克隆抗體、單克隆抗體以及重組抗體的制備。通過本領(lǐng)域廣泛知曉的將本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白注射進動物體內(nèi)，并從動物身上采血以獲得包含抗體的血清的方法，能夠制備多克隆抗體。 這些多克隆抗體能夠從各種動物宿主中制備，例如山羊、兔、綿羊、猴、馬、豬、牛、狗等，且制備方法是本領(lǐng)域公知的。單克隆抗體可以通過使用雜交瘤方法[Kohler和Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6 :511-519]或噬菌體抗體文庫技術(shù)[Clackson 等，Nature, 352 624-628，1991 ；Marks 等，J. Mol. Biol.，222 :58，1-597，1991]等本領(lǐng)域廣泛知曉的方法來制備。通常，雜交瘤方法使用從免疫學(xué)上適合的宿主動物例如小鼠獲得的細胞和作為另一群體的癌癥或骨髓瘤細胞系，所述動物已注入本發(fā)明的第一個方面的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白抗原。從兩個群體中所獲得的組織通過如聚乙二醇等本領(lǐng)域廣泛知曉的方法來融合，然后以標準組織培養(yǎng)方法來使抗體生成細胞增殖。根據(jù)有限稀釋技術(shù)通過亞克隆獲得同質(zhì)細胞群后，按照已知技術(shù)在體內(nèi)或體外大量地培養(yǎng)能夠產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤。噬菌體抗體文庫方法是這樣一種制備單克隆抗體的方法獲得所需抗體的基因，在噬菌體表面上以融合蛋白的形式表達該基因，從而在體外產(chǎn)生抗體文庫，并從該文庫中分離單克隆抗體。通過以上方法制備的單克隆抗體可以通過使用例如凝膠電泳、透析、鹽沉淀、離子交換層析、親和層析等已知方法來分離。本發(fā)明第七個方面的抗體除了包含兩條全長輕鏈和兩條全長重鏈的完美形狀之外，還包含抗體分子的功能片段。所述抗體分子的功能片段是指具有抗原結(jié)合功能的片段， 包括 Fab、F(ab' )、F(ab' ) 2、Fv 等等。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供了一種肝癌預(yù)后標記物；一種用于評估肝癌預(yù)后的組合物，該組合物包含能夠檢測到所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平的變化的物質(zhì)；一種用于評估肝癌預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含所述用于評估肝癌預(yù)后的組合物；一種使用所述肝癌預(yù)后標記物進行肝癌預(yù)后評估的方法；以及一種使用所述肝癌預(yù)后標記物篩選肝癌治療劑的方法。所述肝癌預(yù)后標記物能夠有效地用于肝癌患者中的簡單且正確的預(yù)后評估。此外，所述標記物的生理學(xué)功能可直接與肝癌的發(fā)生或發(fā)展有關(guān)。因而，該標記物能夠有效用于肝癌的發(fā)生或發(fā)展機制的研究，或用作開發(fā)肝癌治療劑的靶標。上述肝癌預(yù)后標記物是那些更顯著的、臨床高度有用的、且能夠更準確地預(yù)測肝癌預(yù)后評估的標記物，這是因為它們是通過對取自空前的多位患者的肝癌組織進行統(tǒng)計學(xué)分析而發(fā)現(xiàn)的。


圖1至圖10是通過測定所述肝癌預(yù)后標記物在復(fù)發(fā)、總生存和無病生存方面示出的 Kaplan-Meier 曲線。
具體實施例方式下面會通過實施方式詳細闡述本發(fā)明；然而，描述所述實施方式僅僅是為了幫助理解本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1 :RNA的提取和cDNA的合成獲得取自120位已診斷為肝癌已經(jīng)發(fā)生并且肝癌的發(fā)展已經(jīng)得到確認的肝癌患者的肝癌組織和相鄰的正常組織。根據(jù)下面的方法提取各份組織的RNA并進行cDNA的合成。根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用RNeasy Minikit Oliagen，德國)從肝癌組織和相鄰的正常組織中提取總RNA。使用Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies，美國)對獲得的 RNA提取物中的總RNA稱量。在提取的步驟中進行DNase I的處理以從RNA提取物中除去污染的基因組DNA。含有4yg總RNA的樣品與2μ1的ΙμΜ的d(T)18引物(Genotech， Korea)在70°C溫育7分鐘并在冰上冷卻5分鐘。單獨制備酶混合物[通過添加2 μ 1 0. IM的 DTT (Duchefa，Netherlands)、2 μ 1 的 IOX 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、5 μ 1 2mM 的 dNTP、l μ 1 200U/ μ 1的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和1 μ 1的40U/ μ 1 RNA酶抑制劑(Enzynomics，Korea)至總體積為 11 μ 1]。將該酶混合物添加至含有RNA的樣品中后，將其在42°C溫育90分鐘，然后在80°C 溫育10分鐘來使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。通過添加焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水使上述樣品的終體積為400 μ 1。實施例2 定量實時RCR根據(jù)產(chǎn)品手冊，使用PRISM 7900ΗΤ (Applied Biosystems，美國)對實施例1中獲得的每一個cDNA樣品的下面兩個基因標記物實施定量實時RCR擴增CBS(胱硫醚 β-合酶；NCBI GI :209862802 ； SEQ ID NO 79)；禾口NNMT (煙酰胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶；NCBI GI :62953139 ；SEQ ID NO 80)。所述定量實時RCR分析在10μ 1的總體積中進行，所述總體積包括5μ 1的 ZXiTaqman 基因表達主引物(master mix) (Applied Biosystems，USA)、5 μ M 正向和反向引物各1μ 1、1μ 1的ΙμΜ探針(Genotech，Korea)和2 μ 1的cDNA (在對照組中為等量的水)。 擴增以下述循環(huán)進行95°C解離10分鐘的步驟，然后是95°C解離15秒的步驟，和60°C合成 1分鐘的步驟。引物和探針序列使用Primer Express 3. 0 (Applied Biosystems，美國)設(shè)計，且所有探針序列在5'端標有FAM，3'端標有TAMRA。下面表1中的下列引物和探針是用于每種標記物的。表權(quán)利要求
1.一種肝癌預(yù)后標記物，所述標記物包括選自由下列基因組成的組的一個基因或至少兩個基因的組合CBS (胱硫醚 β -合酶；NCBI GI :209862802 ；SEQ ID NO 79)；NNMT (煙酰胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶；NCBI GI :62953139 ；SEQ ID NO 80)；TKT (轉(zhuǎn)酮醇酶；NCBI GI :205277461 ；SEQ ID NO 81)；AIFMl (凋亡誘導(dǎo)因子 1，線粒體；NCBI GI :22202627 ；SEQ ID NO 82)；AKTKRAC-α 絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶；NCBI GI =62241010 ；SEQ ID NO 83)；ATG3(自噬相關(guān)蛋白 3 ；NCBI GI :34147490 ；SEQ ID NO 84)；ATG5(自噬相關(guān)蛋白 5 ；NCBI GI :92859692 ；SEQ ID NO 85)；ATG7(自噬相關(guān)蛋白 7 ；NCBI GI :222144225 ；SEQ ID NO 86)；ATG12(自噬相關(guān)蛋白 12 ；NCBI GI :38261968 ；SEQ ID NO 87)；BAX(凋亡調(diào)節(jié)因子 BAX ;NCBI GI :34335114 ；SEQ ID NO 88)；BCL2(凋亡調(diào)節(jié)因子 Bcl-2 ；NCBI GI :72198188 ；SEQ ID NO 89)；BCL2L1(凋亡調(diào)節(jié)因子 Bcl-X ；NCBI GI :20336333 ；SEQ ID NO 90)；BNIP3(BCL2/腺病毒 ElB 19kDa 蛋白-相互作用蛋白 3 ;NCBI GI :7669480 ；SEQ ID NO:91)；CASP8(半胱天冬酶 8 ；NCBI GI :122056470 ；SEQ ID NO 92)； CSElL(Exportin-2 ；NCBI GI:29029558 ；SEQ ID NO 93)； DIABLO (Diablo 同源物，線粒體；NCBI GI :218505810 ；SEQ ID NO 94)； DRAM (損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控蛋白；NCBI GI :110825977 ；SEQ ID NO 95)； E2F1 (轉(zhuǎn)錄因子 E2F1 ；NCBI GI :168480109 ；SEQ ID NO 96)； FAS(腫瘤壞死因子受體超家族成員6 ；NCBI GI =23510419 ；SEQ ID NO 97)； FRAPl (FKBP12-雷怕霉素復(fù)合物相關(guān)蛋白；NCBI GI :206725550 ；SEQ ID NO 98)； LAMPl (溶酶體相關(guān)膜糖蛋白 1 ；NCBI GI :112380627 ；SEQ ID NO 99)； LC3 [MAP1LC3A](微管結(jié)合蛋白 1A/1B 輕鏈 3A ；NCBI GI :31563519 ；SEQ ID NO :100)； PRKAAl (5 ‘ -AMP 激活的蛋白激酶催化亞基 α-1 ;NCBI GI :94557300 ；SEQ ID NO: 101)；PTEN (磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3-磷酸酶和雙特異性的蛋白磷酸酶PTEN ;NCBI GI 110224474 ； SEQ ID NO :102)；ULKl (絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶 ULKl ；NCBI GI =225637564 ；SEQ ID NO :103)；和 XIAP (含桿狀病毒 IAP 重復(fù)序列的蛋白 4 ；NCBI GI :32528298 ；SEQ ID NO :104)。
2.一種用于評估肝癌預(yù)后的組合物，所述組合物包含用于特異性檢測權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的物質(zhì)。
3.一種用于評估肝癌預(yù)后的組合物，所述組合物包含用于特異性檢測權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求2所述的用于評估肝癌預(yù)后的組合物，其中，所述用于特異性檢測所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的物質(zhì)是檢測所述預(yù)后標記物的mRNA的 RT-PCR所用的引物。
5.如權(quán)利要求3所述的用于評估肝癌預(yù)后的組合物，其中，所述用于特異性檢測所述肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的物質(zhì)是特異性識別所述蛋白的抗體。
6.一種用于評估肝癌預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求2和5中任一項所述的用于評估肝癌預(yù)后的組合物。
7.一種評估肝癌預(yù)后的方法，所述方法包括步驟1，用權(quán)利要求2或4所述的用于評估肝癌預(yù)后的組合物處理取自被試肝癌患者的生物學(xué)樣本；和步驟2，通過將步驟1的處理結(jié)果與基準比較從而檢測權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物的表達水平和/或表達模式的差異。
8.一種評估肝癌預(yù)后的方法，所述方法包括步驟1，用權(quán)利要求3或5所述的用于評估肝癌預(yù)后的組合物處理取自肝癌患者的生物學(xué)樣本；和步驟2，通過將步驟1的處理結(jié)果與基準比較從而檢測權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的存在水平和/或存在模式的差異。
9.一種篩選肝癌治療劑的方法，所述方法包括檢測測試化合物是否促進或抑制權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物的表達的步驟。
10.一種篩選肝癌治療劑的方法，所述方法包括步驟1，將測試化合物與權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白結(jié)合；和步驟2，檢測所述測試化合物是否促進或抑制所述蛋白的生理學(xué)活性。
11.一種特異性識別權(quán)利要求1所述的肝癌預(yù)后標記物所編碼的蛋白的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及肝癌預(yù)后標記物；用于評估肝癌預(yù)后的組合物，該組合物包含能夠檢測到所述肝癌預(yù)后標記物的表達水平的變化的物質(zhì)；用于評估肝癌預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含所述用于評估肝癌預(yù)后的組合物；使用所述肝癌預(yù)后標記物進行肝癌預(yù)后評估的方法；和使用肝癌預(yù)后標記物篩選肝癌治療劑的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102428184SQ201080021390
公開日2012年4月25日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月17日
發(fā)明者樸真永, 洪錫珠, 金種旻 申請人:Cbs 生物科學(xué)有限公司, 沈瑛澤