專利名稱：：一種基于金包裹四氧化三鐵納米顆粒的免疫親和固相萃取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基于金包裹四氧化三鐵納米顆粒的免疫親和固相萃取方法。
背景技術(shù)：
：睪酮是一種重要的合成代謝雄性激素類固醇藥物，屬于一種興奮劑。服用睪酮后，可提高運(yùn)動(dòng)員的肌肉攜氧能力，可以提高運(yùn)動(dòng)耐力和成績(jī)。因此，睪酮被國(guó)際奧委會(huì)和國(guó)際反興奮劑組織明令禁止。表睪酮是睪酮的對(duì)映異構(gòu)體，雖然服用表睪酮沒有直接的生理作用，但是仍然可以通過改變體內(nèi)"睪酮含量/表睪酮含量"的比例，從而掩蔽睪酮的服用；因此，也需要檢測(cè)運(yùn)動(dòng)員體內(nèi)睪酮和表睪酮的量從而得到"睪酮/表睪酮"含量的值，并綜合結(jié)果進(jìn)行判斷。另外，建立適合于表睪酮濫用藥物的方便、快速、特異性強(qiáng)和靈敏度高的方法對(duì)于研究該藥物在人體內(nèi)的代謝過程有重要的意義。在實(shí)際檢測(cè)中，待測(cè)樣品的雜質(zhì)較多，影響了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，但現(xiàn)有的前處理步驟均比較繁雜，耗時(shí)耗力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從樣品中免疫親和萃取抗原物質(zhì)的方法。本發(fā)明所提供的從樣品中免疫親和萃取抗原物質(zhì)的方法，包括如下步驟1)將金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物與樣品混合，進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，得到含有所述偶聯(lián)物與抗原物質(zhì)的結(jié)合物的溶液；所述抗體與所述抗原物質(zhì)能夠相互結(jié)合；2)用磁鐵將所述結(jié)合物從含有所述結(jié)合物的溶液中分離出來，得到所述結(jié)合物；3)將所述抗原物質(zhì)從所述結(jié)合物中洗脫下來，得到所述抗原物質(zhì)。上述過程中，所述結(jié)合反應(yīng)的溫度為20°C-371:，具體可為25t:，所述結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間為0.5小時(shí)-1.5小時(shí)，具體可為1小時(shí)。上述過程中，所述洗脫中使用的洗脫液是甲醇；所述抗原物質(zhì)為表睪酮；所述樣品為尿液或離體血液。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)樣品中抗原物質(zhì)的方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)樣品中抗原物質(zhì)的方法，包括如下步驟1)按照上述從樣品中免疫親和萃取抗原物質(zhì)的方法從待測(cè)樣品中免疫親和萃取得到抗原物質(zhì)；2)對(duì)步驟1)得到的抗原物質(zhì)用高效液相色譜法進(jìn)行定量檢測(cè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明所提供的金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物，是抗體片段與金包裹四氧化三鐵納米顆粒偶聯(lián)形成的偶聯(lián)物；所述偶聯(lián)是通過抗體片段中的游離巰基與金包裹四氧化三鐵納米顆粒中的金自組裝實(shí)現(xiàn)的；所述抗體片段是抗體的重鏈之間的二硫鍵被切割還原為游離巰基后得到的抗體片段；所述抗體由重鏈和輕鏈組成。上述金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物按照包括如下步驟的方法制備將金包裹四氧化三鐵納米顆粒與含有足量抗體片段的溶液混合，反應(yīng)，得到金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體片段的偶聯(lián)物；所述反應(yīng)的溫度為2°C-6t:，優(yōu)選為4°C;所述反應(yīng)的時(shí)間為10小時(shí)-20小時(shí)，優(yōu)選為15小時(shí)；所述抗體片段是按照如下方法制備的將EDTA*21120、所述抗體的溶液和巰基乙胺混合，切割還原反應(yīng)，得到所述抗體片段；所述切割還原反應(yīng)的溫度為35°C-401:，優(yōu)選為37t:，所述切割還原反應(yīng)的時(shí)間為80分鐘-100分鐘，優(yōu)選為90分鐘;所述EDTA21120、所述抗體和所述巰基乙胺的配比為2mgEDTA2H20:14mg抗體llmg巰基乙胺。上述偶聯(lián)物中，所述抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物的方法。本發(fā)明所提供的制備金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物的方法，包括如下步驟將金包裹四氧化三鐵納米顆粒與含有足量抗體片段的溶液混合，反應(yīng)，得到金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體片段的偶聯(lián)物；所述抗體片段是抗體的重鏈之間的二硫鍵被切割還原為游離巰基后得到的抗體片段；所述抗體由重鏈和輕鏈組成；所述反應(yīng)的溫度為2°C_61:，優(yōu)選為4°C;所述反應(yīng)的時(shí)間為10小時(shí)-20小時(shí)，優(yōu)選為15小時(shí)；所述抗體片段是按照如下方法制備的將EDTA*21120、所述抗體的溶液和巰基乙胺混合，切割還原反應(yīng)，得到所述抗體片段；所述切割還原反應(yīng)的溫度為35°C_401:，優(yōu)選為37t:，所述切割還原反應(yīng)的時(shí)間為80分鐘-100分鐘，優(yōu)選為90分鐘;所述EDTA21120、所述抗體和所述巰基乙胺的配比為2mgEDTA2H20:14mg抗體llmg巰基乙胺；上述偶聯(lián)物制備方法中，所述抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的。保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的表睪酮的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。金包裹四氧化三鐵納米顆粒在免疫親和萃取中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述的金包裹四氧化三鐵納米顆粒是按照如下方法制備得到的將Fe304顆粒與HAuCl4溶液混合，并使Fe304顆粒均勻分散于HAuCl4溶液中，再向其中加入還原劑，反應(yīng)，得到金包裹四氧化三鐵納米顆粒；述？6304顆粒與金的摩爾比為2:1;所述還原劑為葡萄糖H20或葡萄糖；所述還原劑過量。所述反應(yīng)的溫度為85t:，所述反應(yīng)的時(shí)間為l-2h。所述金包裹四氧化三鐵納米顆粒的制備方法包括如下步驟在所述反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至25°C，離心，收集沉淀顆粒，即得到金包裹四氧化三鐵納米顆粒。所述金包裹四氧化三鐵納米顆粒的制備方法包括如下步驟在所述收集沉淀顆粒后，用水洗滌所述沉淀顆粒至上層清液的pH值中性。本發(fā)明的免疫親和萃取方法是以金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒與表睪酮單克隆抗體偶聯(lián)物為載體，對(duì)樣品中的表睪酮小分子化合物進(jìn)行純化與富集；克服其他前處理方法過程繁雜、耗時(shí)、污染環(huán)境等缺點(diǎn)，提高復(fù)雜體系中目標(biāo)分析物的檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明中檢測(cè)樣品中小分子物質(zhì)含量的方法，是以上述免疫親和萃取為前處理手段，再與高效液相色譜技術(shù)聯(lián)用，以測(cè)定表睪酮等小分子化合物；具體可包括如下步驟1)表睪酮單克隆抗體的制備與純化；2)金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒的合成；3)表睪酮的單克隆抗體偶聯(lián)到納米顆粒的表面；4)使用偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)摻雜尿樣中表睪酮的純化與富集；5)運(yùn)用高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器將純化和富集得到的表睪酮化合物進(jìn)行定量測(cè)定。本發(fā)明所提供的對(duì)樣品進(jìn)行免疫親和萃取小分子物質(zhì)的方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、特異性高；實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明方法從尿液中萃取表睪酮，表睪酮的檢出限(LOD)(至少3倍信噪比)為6ng/mL，表睪酮的定量下限(LOQ)(至少10倍信噪比)為20ng/mL;對(duì)于20mL濃度為l，O.5和0.2ng/mL表睪酮摻雜的PBS溶液，回收率結(jié)果從92%到103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于6%，實(shí)現(xiàn)了從大體積溶液中檢測(cè)低濃度物質(zhì)，進(jìn)一步證明本發(fā)明方法的靈敏度高，能夠富集低濃度樣品。另外，本發(fā)明方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、有效、成本低廉、環(huán)境友好。用本發(fā)明方法對(duì)尿液中的表睪酮進(jìn)行富集，經(jīng)過基于金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒為載體的免疫富集過程，背景物質(zhì)的干擾基本上消除，不會(huì)對(duì)表睪酮的檢測(cè)帶來負(fù)面影響。本發(fā)明的應(yīng)用前景廣闊，根據(jù)需要可以將檢測(cè)范圍擴(kuò)展到血液樣本，而且只要能夠獲得檢測(cè)對(duì)象的抗體，就能將抗體片斷偶聯(lián)到金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒表面，從而制備出免疫親和固相萃取材料，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)對(duì)象化合物的純化、富集與檢測(cè)。并且還可以根據(jù)需要將離線檢測(cè)方法轉(zhuǎn)變?yōu)樵诰€檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高自動(dòng)化的程度。圖1為透射電子顯微鏡結(jié)果(A)Fe304納米顆粒；(B)Fe304@Au納米顆粒。圖2為傅立葉變換紅外光譜圖(A)Fe304納米顆粒；(B)Fe304@Au納米顆粒。圖3為抗體的MALDI-TOF質(zhì)譜圖(A)完整抗體分子的分子量質(zhì)譜圖；(B)抗體片段的分子量質(zhì)譜圖。圖4為基于偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒為載體的免疫親和固相萃取前處理方法示意圖。圖5為經(jīng)免疫親和固相萃取前處理方法處理前后的摻雜尿樣的液相色譜圖。圖中6標(biāo)有ET的為表睪酮化合物(Epitestosterone)。圖6為表睪酮的液相色譜_電噴霧質(zhì)譜圖。圖7為表睪酮濃度對(duì)峰面積擬合的液相色譜標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。圖8為Fe304@Au納米顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9為抗體片段與Fe304@Au磁性納米顆粒的偶聯(lián)物的制備示意圖。圖10為用磁鐵將抗體片段與Fe304@Au磁性納米顆粒的偶聯(lián)物與表睪酮結(jié)合物從溶液中分離的示意圖。圖11為Fe304標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紅外圖譜。圖12為表睪酮合成圖。圖13為表睪酮半抗原合成。圖14為表睪酮完全抗原合成。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)驗(yàn)試劑與原料表睪酮和XAD-2樹脂從Sigma-Aldrich公司購(gòu)買。FeNH4(S04)212H20，F(xiàn)e(NH4)2(S04)26H20與氯金酸(HAuCl44H20)都從國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司購(gòu)買(上海，中國(guó))。曲拉通x-ioo購(gòu)買自北京化學(xué)試劑公司(北京，中國(guó))。巰基乙胺鹽酸鹽(純度98%)購(gòu)買自AcrosOrganics公司。色譜純的乙腈和甲醇是從FisherScientific公司(FairLawn市，新澤西州，美國(guó))購(gòu)買。若無特別說明，在實(shí)驗(yàn)過程中使用的純凈水均由Milli-Q水純化系統(tǒng)(Millipore公司，Molsheim市，法國(guó))制備而成。其余未提到的試劑均是分析純的，并且使用時(shí)無需進(jìn)一步的純化。所有試劑在進(jìn)入液相色譜檢測(cè)前都用0.22微米的濾膜過濾。0.01M磷酸緩沖溶液(PBS，pH7.4)的配制方法將8.0g的NaCl、2.9g的Na2HP0412H20、0.2g的KH2P04和0.2g的KC1溶解到1L去離子水后制備而成的。80mL人體尿液收集自一位27歲健康的男性志愿者，經(jīng)過志愿者本人的同意。這些尿液用20gXAD-2樹脂處理，在去除雜質(zhì)后得到了空白尿液樣本。1iig/mL表睪酮(ET)的儲(chǔ)備液由甲醇配制并保存在_20°C的冰箱內(nèi)。儀器.高效液相色譜(HPLC)分析儀購(gòu)自島津公司(東京，日本)。該儀器使用了島津ProminenceLC-20A色譜分析系統(tǒng)，此系統(tǒng)由LC-20AT四級(jí)泵、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器和DGU-20As脫氣裝置組成。數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理由島津LCsolution軟件(version1.23)完成。透射電子顯微鏡(TEM)購(gòu)自日本JEOL公司出廠的JEM-200CX透射電子顯微儀。傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)和紫外_可見光分光光度計(jì)分別由Vector22光度計(jì)(Bruker，德國(guó))和CARYIEUV-vis分光光度計(jì)(Varian，Australia)記錄?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)AutoflexIII型號(hào)儀器購(gòu)自德國(guó)BrukerDaltonics公司。AvantiJ-25離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)BeckmanCoulter公司。Microcon預(yù)-100超濾膜購(gòu)自Millipore公司。透析袋由華美科技有限公司提供(北京，中國(guó))。釹鐵硼強(qiáng)磁鐵的直徑是29rnm，厚度為6mm。實(shí)施例1、金包裹四氧化三鐵納米顆粒(Fe304@Au)的制備和金包裹四氧化三鐵納米顆粒(Fe304@Au)與抗體偶聯(lián)物的制備先用共沉淀法合成前體四氧化三鐵，然后用氧化還原法在四氧化三鐵表面還原上一層金。—、金包裹四氧化三鐵納米顆粒(Fe304@Au)的制備(—)制備Fe304納米顆粒l失離子{諸備？夜4f0.0128molFeNH4(S04)212H20禾口0.0064molFe(NH4)2(S04)26H20溶解在lOOmL0.4M硫酸水溶液中得至U的；FeNH4(S04)212H20和Fe(NH4)2(S04)26H20的摩爾比為2:1。配制250mL1M的NaOH水溶液，在該溶液中均勻滴加0.1M的曲拉通X-100水溶液至曲拉通X-100在NaOH水溶液中的最終濃度為0.01M。將該溶液轉(zhuǎn)移到500mL三口圓底燒瓶中，水浴中加熱至85°C，同時(shí)用非磁性的機(jī)械攪拌器有力地?cái)嚢?，同時(shí)用滴管緩慢滴加完25mL的鐵離子儲(chǔ)備液，然后保持在85t:繼續(xù)攪拌30分鐘，此后便得到了黑色的Fe304顆粒的懸濁液。停止并撤去加熱和攪拌(但要保持氮?dú)夥諊?，讓Fe3(^顆粒自然沉積在容器底部。待反應(yīng)溶液溫度降到室溫后進(jìn)行離心，棄去上層清液，保留沉淀顆粒并先后用大量去離子水和無水乙醇洗滌，然后放入7(TC烘箱中烘干3小時(shí)，備用。(二)制備金包裹四氧化三鐵納米顆粒(Fe304@Au):氯金酸的水溶液將O.412g氯金酸(HAuCl4*4H20)溶于lOOmL水中，得到Au(III)溶液。1、在lOOmL錐形瓶中將Fe304顆粒與0.01M氯金酸的水溶液混合(其中，F(xiàn)e304與氯金酸的投料摩爾比為2:1)，超聲15分鐘以加速Fe3(^顆粒分散。2、向步驟1的體系中緩慢滴加還原劑葡萄糖0.55g(含純葡萄糖0.5g)，在水浴(85°C)中加熱1小時(shí)并伴有輕微攪拌；期間，隨著？6304顆粒逐漸被金顆粒包裹，顆粒顏色由黑色變?yōu)榧t褐色。3、加熱1小時(shí)后，停止加熱，撤去水浴，自然冷卻至室溫；然后離心分離，得到沉淀顆粒，而上層清液是完全透明的。4、用純凈水洗滌沉淀顆粒至上層清液的pH值中性，然后在7(TC烘箱中烘干，即得到金包裹Fe304顆粒。Fe304@Au納米顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖如圖8所示。(三)金包裹四氧化三鐵納米顆粒(Fe304@Au)及Fe304納米顆粒的驗(yàn)證1、透射電子顯微鏡(TEM):將Fe304納米顆粒和Fe304@Au納米顆粒先分別在水中超聲波分散10分鐘。然后分別取兩種樣本溶液滴在兩個(gè)預(yù)先準(zhǔn)備好的覆蓋有碳的銅網(wǎng)格片上，在室溫下將溶液蒸發(fā)干后再做TEM分析。TEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，F(xiàn)e304磁性納米顆粒的大小是13±lnm(圖1A)。在合成Fe304磁性納米顆粒的實(shí)驗(yàn)過程中加入了曲拉通x-ioo，使得磁性顆粒能夠很好的分散在溶液中，不容易發(fā)生自身聚合。Fe304@Au磁性納米顆粒的大小是50士5nm(圖IB)。2、紅外光譜表征傅立葉變換紅外光譜表征用溴化鉀壓片的方法做的紅外檢測(cè)，屬于中紅外范圍。Fe304和Fe304@Au磁性納米顆粒用傅立葉變換紅外光譜表征圖譜如圖2所示，A表示？6304納米顆粒的紅外譜圖，B表示Fe30^Au納米顆粒的紅外譜圖。紅外光譜圖結(jié)果顯示，隨著金在四氧化三鐵表面的包裹，F(xiàn)e-O鍵的伸縮振動(dòng)頻率從579cm—1遷移到586cm—、在636cm—1和586cm—1處新出現(xiàn)的紅外峰表明Fe304納米顆粒已經(jīng)成功地被金包裹。Fe304標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)的傅立葉變換紅外光譜表征圖譜如圖ll所示，表明本發(fā)明得到的FeA顆粒是正確的。將圖2A與FeA的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖相比，不同之處主要是在峰的強(qiáng)度上有所差異以及峰的波數(shù)不能完全吻合。前者主要的原因是在測(cè)定紅外數(shù)據(jù)的操作過程中，加入Fe304顆粒的量無法完全一致，所以在峰強(qiáng)度上出現(xiàn)差異。后者是因?yàn)槊看螠y(cè)定的譜圖結(jié)果，在波數(shù)的數(shù)值上很難做到完全相同，儀器本身的誤差在10%。？6304顆粒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的譜圖里，三個(gè)峰都與圖2A的對(duì)映峰都比較接近，是儀器本身存在的誤差所致，所以兩個(gè)譜圖的結(jié)果能夠?qū)τ?，即提供的?biāo)準(zhǔn)譜圖能夠證明實(shí)驗(yàn)合成的就是Fe^顆粒。在Fe30,Au磁性納米顆粒中殘留的Fe304顆粒由于表面沒有金的包裹，因而不會(huì)影響抗體片斷在Fe30^Au磁性納米顆粒表面的偶聯(lián)。因?yàn)榭贵w片段在顆粒上的偶聯(lián)需要有金表面的支持，沒有金的Fe304顆粒自然無法將抗體片段固定在其表面上，所以Fe3(^顆粒不會(huì)吸附抗體片段，即非特異性吸附很弱。二、Fe304@Au磁性納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物及其制備1、表睪酮單克隆抗體的制備(1)表睪酮的合成如圖12所示表睪酮苯甲酸酯的合成將2.9g睪酮、5.2g三苯基磷和2.4g苯甲酸溶于100mL苯中，作為A液。4.Og偶氮二甲酸二異丙脂溶于20mL苯中，并在攪拌下緩慢加入A液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)。將反應(yīng)液置于通風(fēng)櫥內(nèi)過夜揮干溶劑苯，得到黃色粘稠狀產(chǎn)物約20mL。以石油醚乙酸乙酯=17:5作為洗脫劑，硅膠柱純化產(chǎn)物。目標(biāo)產(chǎn)物比移值Rf=0.5，同時(shí)在其上下各少量存在一個(gè)雜質(zhì)點(diǎn)。表睪酮的合成向3.Og表睪酮苯甲酸酯中加入1.5g的NaOH和25mL的甲醇，室溫?cái)嚢柽^夜。薄層色譜顯示原料點(diǎn)減小，產(chǎn)物表睪酮點(diǎn)出現(xiàn)。向反應(yīng)體系中加入水，用乙酸乙酯萃取4次。有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥過夜。濾去干燥劑并旋蒸去除大部分溶劑，有黃色固體析出。乙酸乙酯重結(jié)晶得到淺黃色固體，紅外燈下烘干產(chǎn)物，得到l.lg表睪酮。薄層色譜顯示產(chǎn)物純度很高。(2)表睪酮全抗原的合成ET-3-半抗原的合成如圖13所示，將0.2g表睪酮和0.2g鹽酸羧甲基羥胺置于40mL乙醇中，加入5%NaOH4mL，ll(TC加熱回流15小時(shí)。薄層色譜顯示幾乎無表睪酮剩余(乙酸乙酯為展開劑)。減壓旋蒸去除大部分乙醇，加入5mL水，用乙醚萃取三次，除去未反應(yīng)的原料表睪酮和雜質(zhì)。向水相中加入1MHC1至酸性，此時(shí)有大量白色沉淀生成。加乙醚溶解沉淀，萃取三次。醚層用水萃取洗滌三次至中性。向醚層中加無水硫酸鈉干燥8小時(shí)。濾去干燥劑，旋蒸去除大部分溶劑乙醚，得到黃色油狀物140mg(產(chǎn)率二56%)。表睪酮3位全抗原(ET-3-BSA)的合成如圖14所示，將34mgET-3-半抗原、14mgNHS和23mgEDC共溶于2.3mLDMSO中，常溫下攪拌2小時(shí)，作為A液。將0.1M的NaHC03用1MHC1調(diào)至pH=7.0。161mg的BSA溶于10mL上述溶液中作為B液，將A液攪拌著加入B液中。室溫下緩慢攪拌反應(yīng)2小時(shí)，攪拌中盡量避免盡量氣泡產(chǎn)生(n(ET-3-h即ten):n(NHS):n(EDC):n(Protein)=40:50:50:1)。反應(yīng)完的溶液裝入透析袋，依次用PBS9透析24小時(shí)，去離子水透析48小時(shí)。凍干后于_201:下保存。(3)單克隆抗體的制備雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的主要步驟包括免疫動(dòng)物(對(duì)Balb/c小鼠的免疫)，細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)，陽性細(xì)胞的篩選，雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量制備幾個(gè)步驟。(3).1免疫動(dòng)物用高壓滅菌的生理鹽水(0.9%)溶解ET-3-BSA，配成濃度為280iig/mL的溶液。與等量的福氏完全佐劑充分乳化成油包水的乳濁液，注入5只Balb/c小鼠腹腔內(nèi)，每只0.5mL(70yg)。第14天進(jìn)行第二次免疫，將全抗?jié)舛葴p半，用140yg/mL的ET-3-BSA生理鹽水溶液與等量福氏不完全佐劑乳化，在脊柱兩側(cè)對(duì)小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每只0.4mL(28yg)。第24天進(jìn)行第三次免疫。試劑及用量與第二次相同，注射部位為四肢上方的皮下。10天后取小鼠尾血，離心、取上清用ELISA測(cè)效價(jià)(包被抗原ET-3-BSA5iig/mL)，5只小鼠血清效價(jià)均在4以上，待用。整個(gè)免疫期間，小鼠生長(zhǎng)健康。(3).2細(xì)胞融合飼養(yǎng)細(xì)胞的鋪制最常使用的飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠腹腔細(xì)胞。它能釋放出一種非種屬特異性生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；此外，其中的巨噬細(xì)胞還有清除死亡細(xì)胞的作用。在融合的前兩天，進(jìn)行飼養(yǎng)細(xì)胞的鋪制。取昆明鼠一只，頸椎脫位處死后，浸泡于75%酒精中15分鐘對(duì)其皮毛進(jìn)行消毒。將小鼠置于培養(yǎng)皿上，腹部朝上，用無菌剪刀在其腹部剪一小口，剝離腹部皮膚，暴露腹膜，75%酒精消毒腹膜，晾干。用滅菌的滴管向腹膜內(nèi)注入匿EM完全培養(yǎng)基約5mL，用針柄輕柔腹部，培養(yǎng)基顏色由粉紅變成桔黃色，吸出并置于50mL離心管中，反復(fù)幾次至培養(yǎng)基不變色。1000rpm離心5分鐘，棄去上清，將細(xì)胞沉淀懸于40mLHAT培養(yǎng)液中，混勻后滴加至4塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100i！L，37°CC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用。骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備(1)骨髓瘤細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng)從液氮罐中(-19(TC)取出一安培瓶冷凍的骨髓瘤細(xì)胞，立即放入3『C水浴中并不斷攪動(dòng)以防止細(xì)胞內(nèi)的水分結(jié)晶而傷害細(xì)胞。溶化后逐滴加入完全培養(yǎng)基約3mL，1000rpm離心5分鐘，徹底棄去上清液(內(nèi)含匿SO)，加入約2mL完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹起，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入10%DMEM完全培養(yǎng)基至5mL左右，置于37t:(A培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。骨髓瘤細(xì)胞在含10%小牛血清的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯變化時(shí)換液(1-2天)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，鋪滿瓶底時(shí)按l:3稀釋傳代(2-4天傳一代)。融合前48小時(shí)傳代，融合當(dāng)天選取生長(zhǎng)旺盛、渾圓透亮、形態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞4-6瓶，其它凍存。(2)骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備在細(xì)胞融合當(dāng)天將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0細(xì)胞吹下，置于50mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清，用不完全培養(yǎng)基清洗兩次，最后將細(xì)胞懸于40mL不完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞計(jì)數(shù)為107個(gè)數(shù)量級(jí)。免疫脾細(xì)胞懸液的制備(1)脾臟加強(qiáng)免疫融合前三天，選取兩只免疫的Balb/c小鼠進(jìn)行脾臟加強(qiáng)免疫。將濃度為150iig/mL的ET-3-BSA生理鹽水溶液不經(jīng)乳化直接注入小鼠腹腔內(nèi)，每只0.2mL(30iig)。(2)免疫脾細(xì)胞懸液的制備融合當(dāng)天，取脾臟加強(qiáng)免疫的兩只小鼠，取其眼血(各lmL左右)。離心后的上清分裝、凍存，作為陽性對(duì)照。處死小鼠，在超凈臺(tái)中消毒并剖開腹部，小心取出已腫大的脾臟，置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)的不銹鋼網(wǎng)上，立即加入不完全培養(yǎng)基。將脾臟剪碎并用針柄碾壓，使脾細(xì)胞經(jīng)過網(wǎng)孔濾入培養(yǎng)皿中，提取液置于50mL離心管中。離心，洗滌2次后懸于40mL不完全培養(yǎng)基中。細(xì)胞計(jì)數(shù)為10810個(gè)數(shù)量級(jí)。細(xì)胞融合將1(f個(gè)Sp2/0細(xì)胞和1()8個(gè)脾細(xì)胞混合于50mL離心管中，加入不完全培養(yǎng)基至40mL。輕輕攪勻后，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用手指彈擊管底，使兩種細(xì)胞混勻成糊狀。將離心管置于37t:已滅菌的水中。向裝有0.4mL聚乙二1500(PEG1500)的已滅菌的離心管中加入等量不完全培養(yǎng)基，不斷抽吸使液體達(dá)到粉紅色。用吸管吸取50%的PEG1500溶液，插入離心管底部。左手慢慢旋管，右手輕輕攪動(dòng)細(xì)胞沉淀，同時(shí)緩慢滴加PEG1500，1分鐘內(nèi)加完，水浴中靜置1.5分鐘進(jìn)行融合。靜置完畢后，立即加入5mL不完全培養(yǎng)基，使PEG1500稀釋而停止作用，滴加方法為前1分鐘加入lmL，后1分鐘加完剩下的4mL。補(bǔ)加不完全培養(yǎng)基20mL，300rpm離心3分鐘，棄上清。加入HAT培養(yǎng)液輕輕攪動(dòng)，使細(xì)胞懸浮。補(bǔ)加HAT至40mL，混勻，滴加到鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的4塊96孔培養(yǎng)板中，每孔100yL，以HAT為培養(yǎng)液，37°CC02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3).3雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG1500處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，其中包括未融合的骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞，骨髓瘤細(xì)胞自身融合的共核體，脾細(xì)胞自身融合的共核體以及骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞融合的異核體。每2-3天換一半HAT培養(yǎng)液，幾天后骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞陸續(xù)死亡，而融合的雜交瘤細(xì)胞成簇的生長(zhǎng)，形成小的細(xì)胞集落。此時(shí)，換成HT培養(yǎng)基培養(yǎng)至兩星期左右，可觀察到明顯的集落，這時(shí)吸取培養(yǎng)基進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)，以確定含有分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽性細(xì)胞的篩選在融合細(xì)胞培養(yǎng)至兩周左右時(shí)，選擇細(xì)胞集落明顯、培養(yǎng)基顏色變化大的孔用ELISA法進(jìn)行陽性測(cè)試。測(cè)試時(shí)吸取100i!L培養(yǎng)基作為待測(cè)物檢測(cè)。對(duì)于首次測(cè)得的陽性孔，隔天吸取上層培養(yǎng)基檢測(cè)，三次測(cè)定陽性穩(wěn)定后最終確定陽性細(xì)胞。ELISA過程如下(1)用CBS配制濃度為10iig/mL的ET-3-BSA包被液，每孔100yL，4。C放置15小時(shí)。棄去包被液，用PBST洗滌3次，每孔200iiL，每次放置3分鐘，甩去，拍干。(2)用1%的明膠溶液封閉，每孔200iiL，37t:下溫育2小時(shí)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每孔200iiL，每次放置3分鐘，甩去，拍干。(3)加入100iiL待測(cè)培養(yǎng)基，并用稀釋100倍的兔血清作為陰性對(duì)照，免疫小鼠的眼血作為陽性對(duì)照，37t:溫育1小時(shí)。棄去培養(yǎng)基反應(yīng)液，用PBST洗滌3次，每孔200iiL，每次放置3分鐘，甩去，拍干。(4)加入5000倍稀釋的標(biāo)記二抗，每孔100iiL，37t:下溫育1小時(shí)。棄去二抗溶液，用PBST洗滌3次，去離子水洗滌2次，每孔200iiL，每次放置3分鐘，甩去，拍干。(5)加入底物溶液，每孔100iiL，閉光顯色15分鐘。加入2M硫酸終止顯色。酶標(biāo)儀上450nm讀數(shù)。雜交瘤細(xì)胞的克隆化選擇陽性穩(wěn)定三次以上的單克隆5株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。一孔擴(kuò)至一排，最終保留兩株單克隆1E5、3D7以及幾株多克隆細(xì)胞。經(jīng)檢驗(yàn)1E5和3D7所有孔全部為陽性，進(jìn)一步證明是單克隆。當(dāng)一排細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，鋪滿孔底時(shí)轉(zhuǎn)至鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)基逐步由HT換為含20%血清的培養(yǎng)基。(3).4雜交瘤細(xì)胞的凍存在培養(yǎng)瓶中分別培養(yǎng)兩株單克隆和多克隆細(xì)胞，培養(yǎng)基血清含量緩慢由20%降至17.5%，最后降至15%。分批凍存于液氮中。方法如下(l)棄去并吸干培養(yǎng)基，用少量不完全培養(yǎng)基輕輕洗去漂浮的死細(xì)胞，棄去；(2)加入3mL左右不完全培養(yǎng)基，用彎頭滴管將細(xì)胞完全吹下；(3)將含有細(xì)胞的不完全培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至7mL離心管中，膠布封口，1000rpm以下離心3-5分鐘，棄去培養(yǎng)基；(4)沉淀中加入1.8mL凍存液，反復(fù)吹吸溶解后，轉(zhuǎn)至安培瓶中。(5)安培瓶外包上棉花，置于-7(TC凍存；(6)過夜后取出，凍存于-19(TC液氮中。該分泌抗表睪酮的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7已于2010年1月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo.3592，分類命名為鼠源雜交瘤細(xì)胞株，細(xì)胞株名稱為ET-3D7。(3).5單克隆抗體的大量制備抗表睪酮的單克隆抗體的制備方法將已經(jīng)建立的雜交瘤細(xì)胞CGMCCNo.3592置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于37t:和5%C02孵箱中培養(yǎng)，每隔2d換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞濃度大于105mg/ml時(shí)停止換液，持續(xù)培養(yǎng)到細(xì)胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清，1500rpm，離心10分鐘，上清含有高水平的單克隆抗體，-2(TC保存?zhèn)溆?。所述?xì)胞培養(yǎng)基為向DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清，使胎牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為15-20%(體積百分含量)，所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。還可以按照如下方法制備在抗體大量制備前幾天，向健康Balb/c小鼠腹腔中注入石蠟油。將一定數(shù)量的單克隆細(xì)胞用無菌PBS溶液吹下，1000rpm以下離心3_5分鐘，細(xì)胞沉淀溶解于0.5mLPBS中，注入小鼠腹腔內(nèi)。單克隆細(xì)胞注入小鼠7-10天后，小鼠腹部可見明顯脹大，取其腹水。具體方法如下用左手固定小鼠，用75%酒精消毒其腹部，再于小鼠下方放置一支試管，將滅菌的16號(hào)注射針頭剌入小鼠下腹部，讓腹水滴入試管內(nèi)，當(dāng)腹水停滴時(shí)，輕輕移動(dòng)針頭，并輕柔其腹部，使腹水繼續(xù)滴出。一次可得到約l-3mL腹水。1000rpm離心5分鐘，吸取上層透明清液，凍于_20°C2、制備Half-IgG抗體片段抗體為表睪酮的單克隆抗體，是由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的。用方法I將抗體分子切割還原將2mg的EDTA2H20固體加入含有14mg抗體的PBS緩沖溶液中，再向緩沖溶液中加入11mg巰基乙胺固體，在37t:下反應(yīng)90分鐘；然后，將反應(yīng)混合物在4t:下對(duì)0.01MPBS緩沖溶液(pH7.4)透析15小時(shí)；最后，未反應(yīng)完全的完整抗體分子用MicroconYM-100超濾去除，得到抗體片段溶液(溶質(zhì)是抗體片段，溶劑是PBS緩沖溶液)。完整抗體分子和抗體片段(half-IgG)的分子量由MALDI-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定(圖3)。圖3表明，質(zhì)譜的結(jié)果顯示，完整的抗體分子和抗體片斷的分子量分別是147798±443g/mol和73816±221g/mol。利用如下方法II和方法III將抗體分子切割還原，結(jié)果與方法I無顯著差異。方法II:除反應(yīng)溫度為35t:、反應(yīng)時(shí)間為100分鐘外，其余均與方法I相同。方法III:除反應(yīng)溫度為4(TC、反應(yīng)時(shí)間為80分鐘外，其余均與方法I相同。3、制備抗體片段與Fe304@Au磁性納米顆粒的偶聯(lián)物偶聯(lián)物的制備如圖9所示。方法I:將金包裹四氧化三鐵納米顆粒(Fe304@Au)加入含有足量表睪酮單克隆抗體片段的PBS緩沖溶液中，在4t:冰箱中輕微攪拌過夜(15小時(shí))；反應(yīng)結(jié)束后，使用磁鐵將磁性顆粒從溶液中分離出來；根據(jù)反應(yīng)前后上清液的紫外吸光度結(jié)果，得出約lmg的抗體片段偶聯(lián)到10mg的Fe304@Au顆粒上。反應(yīng)前上清液為PBS溶液，不含抗體；反應(yīng)后上清液為含有抗體的PBS溶液，可以用紫外可見分光光度儀測(cè)定抗體的濃度；傳統(tǒng)的S印harose4B載體材料的抗體偶聯(lián)效率lgS印harose4B凝膠膨脹后體積約有3.5mL，每mL可偶聯(lián)約5_10mg抗體。若以8mg抗體計(jì)算，故lg凝膠約需要3.5X8=28mg抗體，即10mg凝膠能偶聯(lián)0.28mg抗體。本發(fā)明中，10mgFe304@Au顆粒能夠偶聯(lián)lmg抗體，是傳統(tǒng)方法的lmg/O.28mg=3.57倍，所以比傳統(tǒng)的S印harose4B載體材料的抗體偶聯(lián)效率高了3倍以上。表明，本發(fā)明的以金包裹四氧化三鐵磁性顆粒為載體的免疫親和富集材料的抗體偶聯(lián)效率要優(yōu)于傳統(tǒng)的S印harose4B載體材料的抗體偶聯(lián)效率?？贵w片斷在金表面的偶聯(lián)是通過抗體片斷上的巰基與金作用實(shí)現(xiàn)的?？贵w分子重鏈之間的二硫鍵被巰基乙胺切割還原后得到抗體片段，并暴露出游離的巰基基團(tuán)，得到帶游離巰基的抗體片斷，然后通過游離巰基的自組裝反應(yīng)，抗體片斷能夠穩(wěn)固定向地偶聯(lián)到金包裹四氧化三鐵納米顆粒表面。抗體片斷在富集材料上的偶聯(lián)不僅不會(huì)損失抗體的免疫活性，而且還能進(jìn)一步提高抗體在富集材料上的偶聯(lián)密度，從而提高抗體的偶聯(lián)率。因?yàn)榕悸?lián)的抗體是抗體的片段，只有完整抗體的1/2，那么在單位材料上偶聯(lián)的抗體數(shù)目為完整抗體的兩倍。利用如下方法II和方法III制備金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物，結(jié)果與方法I無顯著差異。方法II:除反應(yīng)溫度為2t:、反應(yīng)時(shí)間為20小時(shí)外，其余均與方法I相同。方法III:除反應(yīng)溫度為6t:、反應(yīng)時(shí)間為10小時(shí)外，其余均與方法I相同。實(shí)施例2、用Fe304@Au磁性納米顆粒從樣品溶液中萃取表睪酮并檢測(cè)表睪酮含量(—)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備向PBS緩沖液中添加表睪酮，使表睪酮在PBS緩沖液中的濃度分別為20ng/mL、50ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，即得到各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2、從標(biāo)準(zhǔn)品溶液中萃取表睪酮萃取過程的示意圖如圖4所示。將表睪酮抗體片段與金包裹四氧化三鐵納米顆粒的偶聯(lián)物加入到各標(biāo)準(zhǔn)品溶液中(偶聯(lián)物的量為10mg，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的量為lmL)，在室溫(25°C)下結(jié)合反應(yīng)1小時(shí)，得到偶聯(lián)物與抗體片段的結(jié)合物；用磁鐵將結(jié)合物從溶液中分離出來(將磁鐵置于容器的一側(cè)，結(jié)合物在磁鐵的作用下吸附在靠近磁鐵的容器壁上，如圖10所示)，將瓶子里的上清液倒掉，剩余吸在瓶壁上的結(jié)合物；用水洗滌回收結(jié)合物3次，之后再用甲醇將表睪酮從結(jié)合物上洗脫下來(甲醇通過改變抗原和抗體之間的溶液環(huán)境，將抗原從抗體上洗脫下來。用高純氮?dú)獯蹈珊斜聿G酮的甲醇洗脫液，再在室溫下重新用液相色譜的流動(dòng)相定容至lmL，待進(jìn)行高效液相色譜分析檢測(cè)。上述過程中，在磁鐵和Fe304@Au納米顆粒的相互作用下，結(jié)合物(Fe304@Au納米顆粒與抗體片段的偶聯(lián)物與表睪酮形成的結(jié)合物)很容易從溶液中分離出來，因此這種Fe304@Au納米顆粒載體材料能夠滿足免疫親和固相萃取的需要。Fe304@Au磁性納米顆粒至少能夠重復(fù)使用IO次以上。3、高效液相色譜的方法檢測(cè)萃取樣品中的表睪酮的量色譜柱:C18反相色譜柱(Gemini公司)，Phenomenex牌，柱長(zhǎng)250mm，內(nèi)徑4.6mm，柱填料為d8填料，柱填料粒徑為5ym，110A孔徑。配有一個(gè)Q的預(yù)柱(預(yù)柱的柱長(zhǎng)為4mm，內(nèi)徑為3.0mm)。柱溫25。C;自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量201;洗脫液(流動(dòng)相)為乙腈與乙酸水溶液的等體積混合物；乙酸水溶液中乙酸與水的體積比為1:1000。流速為lml/min;檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)244nm;高效液相色譜的分離在室溫下進(jìn)行。每份溶液平行測(cè)定3次。記錄每份溶液對(duì)應(yīng)的表睪酮的峰面積值。表睪酮標(biāo)準(zhǔn)品為表睪酮(純品，淡黃色固體顆粒)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄上的編號(hào)是E5878-100MG。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是通過表睪酮的液相色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)濃度之間的線性關(guān)系擬合而得。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中表睪酮的濃度值，縱坐標(biāo)為高效液相色譜檢測(cè)的峰面積值。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程為Y=53.2XX+837。用如下兩種方法從標(biāo)準(zhǔn)品溶液中萃取表睪酮，其余均與上述相同，結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線無顯著差異。方法II:從標(biāo)準(zhǔn)品溶液中萃取表睪酮的步驟中，除結(jié)合反應(yīng)的溫度為2(TC，時(shí)間為1.5小時(shí)外，其余均與實(shí)驗(yàn)2中所述相同。方法III:從標(biāo)準(zhǔn)品溶液中萃取表睪酮的步驟中，除結(jié)合反應(yīng)的溫度為37t:，時(shí)間為0.5小時(shí)外，其余均與實(shí)驗(yàn)2中所述相同。用甲醇進(jìn)行洗脫，目的是將抗原_抗體復(fù)合物解離，以獲得抗原的溶液。對(duì)洗脫劑的要求是非鹽類物質(zhì)、不能對(duì)抗體有強(qiáng)殺傷性、揮發(fā)性強(qiáng)而且不會(huì)對(duì)液相色譜的色譜柱有害的物質(zhì)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，甲醇的洗脫效果好。(二)對(duì)添加表睪酮的尿液的檢測(cè)1、添加表睪酮的尿液的制備lg/mL的表睪酮甲醇儲(chǔ)備液將表睪酮溶于甲醇中，濃度為lg/mL。用不含表睪酮的尿液分別稀釋lyg/mL的表睪酮甲醇儲(chǔ)備液，至表睪酮的濃度分別為50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，得到不同濃度的摻雜尿液樣本。142、從添加表睪酮的尿液中萃取表睪酮方法與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同。3、高效液相色譜的方法檢測(cè)萃取樣品中的表睪酮的量方法與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同。4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到萃取物中表睪酮的量表睪酮的濃度是將檢測(cè)得到的峰面積數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程得出的。實(shí)驗(yàn)組1:表睪酮濃度為50ng/mL的表睪酮摻雜尿液樣本，按照上述步驟1_4的方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組2:表睪酮濃度為100ng/mL的表睪酮摻雜尿液樣本，按照上述步驟1_4的方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組3:表睪酮濃度為200ng/mL的表睪酮摻雜尿液樣本，按照上述步驟1_4的方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照組1:表睪酮濃度為100ng/mL的表睪酮摻雜尿液樣本，不經(jīng)過任何前處理，直接進(jìn)行高效液相色譜分析(即直接進(jìn)行上述步驟3和4)。對(duì)照組2(空白對(duì)照組)表睪酮濃度為100ng/mL的表睪酮摻雜尿液樣本，經(jīng)未偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒免疫萃取處理后，進(jìn)行高效液相色譜分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果如表1和圖5所示。圖5中，(a)對(duì)照組1的液相色譜圖；(b)實(shí)驗(yàn)組2的液相色譜圖；(c)對(duì)照組2的液相色譜圖。對(duì)照組1的結(jié)果液相色譜圖的背景信號(hào)很高，這是由尿液中的雜質(zhì)引起的。表明，如果不進(jìn)任何前處理步驟，直接測(cè)定摻雜尿液中的表睪酮分子是很困難的。實(shí)驗(yàn)組2的結(jié)果液相色譜圖的背景干擾信號(hào)被消除，表明，用偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)待測(cè)尿液樣本進(jìn)行免疫富集前處理，表睪酮分子被特異性富集。對(duì)照組2的結(jié)果使用未偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)摻雜尿液做前處理，未檢測(cè)到表睪酮。表明表睪酮分子沒有被特異性的富集。同時(shí)，上述實(shí)驗(yàn)還證明，沒有偶聯(lián)抗體的Fe304@Au納米顆粒對(duì)表睪酮沒有非特異性吸附，不會(huì)對(duì)表睪酮的定量分析造成干擾。實(shí)驗(yàn)還證明，偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)摻雜尿液中表睪酮的免疫富集的特異性很高。表1.以金包裹四氧化三鐵磁性顆粒為載體的免疫親和萃取實(shí)驗(yàn)對(duì)表睪酮摻雜尿液的回收率測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>將實(shí)驗(yàn)組2收集的表睪酮洗脫峰進(jìn)行液相色譜_電噴霧質(zhì)譜(LC-ESI-MS)分析。質(zhì)譜儀器使用BrukerEsquire-LC離子阱檢測(cè)器(購(gòu)自Billerica市，馬里蘭州，美國(guó))的正離子模式。40psi的高純氮?dú)庾鳛殪F化氣。電噴霧源的具體條件如下毛細(xì)管電壓為-4000V;末端盤電壓為-3500V;毛細(xì)管出口電壓為104V;氮?dú)飧稍餁獾臏囟仍O(shè)在30(TC，流速設(shè)在每分鐘12.0L。流動(dòng)相為乙腈與乙酸水溶液的等體積混合物；乙酸水溶液中乙酸與水的體積比為l:1000。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果一致。結(jié)果如圖6所示。質(zhì)譜的結(jié)果顯示，由于在流動(dòng)相中加入乙酸進(jìn)行酸化，因此在正離子模式下，表睪酮的分子離子峰[M+H]+的質(zhì)荷比m/z為289，而表睪酮的鈉離子加成的質(zhì)譜峰[M+Na]+的質(zhì)荷比m/z為311，但前者的峰強(qiáng)度高于后者。上述高效液相色譜實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)表明偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)摻雜尿液免疫富集得到的物質(zhì)就是表睪酮。因此，基于金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒的免疫親和固相萃取方法是很有潛力的樣品前處理方法。(三)對(duì)添加表睪酮的PBS緩沖液的檢測(cè)為了考察磁性顆粒的富集性能，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。1、添加表睪酮的PBS緩沖液的制備向PBS緩沖液中添加表睪酮，使表睪酮在PBS緩沖液中的濃度分別為lng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL，即得到添加表睪酮的PBS緩沖液。2、從添加表睪酮的PBS緩沖液中萃取表睪酮方法與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同，不同的是偶聯(lián)有表睪酮抗體片段的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒的量為lOmg，添加表睪酮的PBS緩沖液的量為20mL。3、高效液相色譜的方法檢測(cè)萃取樣品中的表睪酮的量方法與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同，不同的是，在氮?dú)獯蹈珊?，用流?dòng)相溶液定容到0.2mL后進(jìn)入高效液相色譜測(cè)定。4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到萃取物中表睪酮的量表睪酮的濃度是將檢測(cè)得到的峰面積數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程得出的。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。結(jié)果如表2所示。表2.以金包裹四氧化三鐵磁性顆粒為載體的免疫親和萃取實(shí)驗(yàn)對(duì)大體積低濃度的富集的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如圖7所示，液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸系數(shù)R2為0.995，定量范圍在20-200ng/mL之間，而且精確性好(因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線上每個(gè)濃度點(diǎn)的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于1.5%，偏差極低，精確度很好)。表睪酮的檢出限(L0D)(至少3倍信噪比)為6ng/mL。表睪酮的定量下限(LOQ)(至少10倍信噪比)為20ng/mL。50，100和200ng/mL表睪酮摻雜尿液的回收率為92%至109%(見表l)。此外，使用偶聯(lián)有表睪酮的單克隆抗體的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)大體積、低濃度(低于6ng/mL)的表睪酮PBS溶液進(jìn)行免疫親和萃取實(shí)驗(yàn)，富集的對(duì)象是20mL濃度為l，O.5和0.2ng/mL表睪酮摻雜的PBS溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，回收率結(jié)果從92%到103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于6%。表3結(jié)果表明，經(jīng)過免疫富集萃取前處理步驟，表睪酮的檢出限可以提高100倍，即提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。綜上結(jié)果表明，本發(fā)明的用偶聯(lián)有表睪酮抗體片段的金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行免疫親和萃取的方法能夠富集低濃度樣品。以紫外檢測(cè)器為例，用它檢測(cè)表睪酮的檢出限LOD為6ng/mL，但使用了有100倍富集效果的磁性顆粒，LOD可降低100倍至0.06ng/mL，說明該方法的富集效率高，提高了檢測(cè)靈敏度，表3就說明了這個(gè)結(jié)論。表3.使用免疫富集前處理方法前后的定量下限和檢出限的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>權(quán)利要求一種從樣品中免疫親和萃取抗原物質(zhì)的方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求5-7中任一所述偶聯(lián)物與樣品混合，進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，得到含有所述偶聯(lián)物與抗原物質(zhì)的結(jié)合物的溶液；所述抗體與所述抗原物質(zhì)能夠相互結(jié)合；2)用磁鐵將所述結(jié)合物從含有所述結(jié)合物的溶液中分離出來，得到所述結(jié)合物；3)將所述抗原物質(zhì)從所述結(jié)合物中洗脫下來，得到所述抗原物質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述結(jié)合反應(yīng)的溫度為20°C_371:，優(yōu)選為25t:，所述結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間為0.5小時(shí)-l.5小時(shí)，優(yōu)選為1小時(shí)。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述洗脫中使用的洗脫液是甲醇；所述抗原物質(zhì)為表睪酮；所述樣品為尿液或離體血液。4.一種檢測(cè)樣品中抗原物質(zhì)的方法，包括如下步驟1)按照權(quán)利要求1-3中任一所述方法從待測(cè)樣品中免疫親和萃取得到抗原物質(zhì)；2)對(duì)步驟1)得到的抗原物質(zhì)用高效液相色譜法進(jìn)行定量檢測(cè)。5.金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物，是抗體片段與金包裹四氧化三鐵納米顆粒偶聯(lián)形成的偶聯(lián)物；所述偶聯(lián)是通過抗體片段中的游離巰基與金包裹四氧化三鐵納米顆粒中的金自組裝實(shí)現(xiàn)的；所述抗體片段是抗體的重鏈之間的二硫鍵被切割還原為游離巰基后得到的抗體片段；所述抗體由重鏈和輕鏈組成。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物按照包括如下步驟的方法制備將金包裹四氧化三鐵納米顆粒與含有足量抗體片段的溶液混合，反應(yīng)，得到金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體片段的偶聯(lián)物；所述反應(yīng)的溫度為2°C_61:，優(yōu)選為4°C;所述反應(yīng)的時(shí)間為10小時(shí)-20小時(shí)，優(yōu)選為15小時(shí);所述抗體片段是按照如下方法制備的將EDTA21120、所述抗體的溶液和巰基乙胺混合，切割還原反應(yīng)，得到所述抗體片段；所述切割還原反應(yīng)的溫度為35°C_401:，優(yōu)選為37t:，所述切割還原反應(yīng)的時(shí)間為80分鐘-100分鐘，優(yōu)選為90分鐘;所述EDTA'2H20、所述抗體和所述巰基乙胺的配比為2mgEDTA'2H20:14mg抗體llmg巰基乙胺。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的偶聯(lián)物，其特征在于所述抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的。8.—種制備金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體的偶聯(lián)物的方法，包括如下步驟將金包裹四氧化三鐵納米顆粒與含有足量抗體片段的溶液混合，反應(yīng)，得到金包裹四氧化三鐵納米顆粒與抗體片段的偶聯(lián)物；所述抗體片段是抗體的重鏈之間的二硫鍵被切割還原為游離巰基后得到的抗體片段；所述抗體由重鏈和輕鏈組成；所述反應(yīng)的溫度為2°C_61:，優(yōu)選為4°C;所述反應(yīng)的時(shí)間為10小時(shí)-20小時(shí)，優(yōu)選為15小時(shí);所述抗體片段是按照如下方法制備的將EDTA2&0、所述抗體的溶液和巰基乙胺混合，切割還原反應(yīng)，得到所述抗體片段；所述切割還原反應(yīng)的溫度為35°C_401:，優(yōu)選為37t:，所述切割還原反應(yīng)的時(shí)間為80分鐘-100分鐘，優(yōu)選為90分鐘;所述EDTA'2H20、所述抗體和所述巰基乙胺的配比為2mgEDTA'2H20:14mg抗體llmg巰基乙胺；9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述抗體是由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的。10.保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7;和由保藏編號(hào)為CGMCCNo.3592的鼠源雜交瘤細(xì)胞株ET-3D7分泌得到的表睪酮的單克隆抗體。11.金包裹四氧化三鐵納米顆粒在免疫親和萃取中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于金包裹四氧化三鐵納米顆粒的免疫親和固相萃取方法。該方法包括如下步驟1)將偶聯(lián)物與樣品混合，進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，得到含有所述偶聯(lián)物與抗原物質(zhì)的結(jié)合物的溶液；所述抗體與所述抗原物質(zhì)能夠相互結(jié)合；2)用磁鐵將所述結(jié)合物從含有所述結(jié)合物的溶液中分離出來，得到所述結(jié)合物；3)將所述抗原物質(zhì)從所述結(jié)合物中洗脫下來，得到所述抗原物質(zhì)。本發(fā)明的應(yīng)用前景廣闊，根據(jù)需要可以將檢測(cè)范圍擴(kuò)展到血液樣本，而且只要能夠獲得檢測(cè)對(duì)象的抗體，就能將抗體片段偶聯(lián)到金包裹四氧化三鐵磁性納米顆粒表面，從而制備出免疫親和固相萃取材料，實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)對(duì)象化合物的純化、富集與檢測(cè)。并且還可以根據(jù)需要將離線檢測(cè)方法轉(zhuǎn)變?yōu)樵诰€檢測(cè)方法，進(jìn)一步提高自動(dòng)化的程度。文檔編號(hào)G01N33/64GK101776691SQ20101011074公開日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年2月9日優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日發(fā)明者崔毅然,張新祥,邱爽,陳泓序申請(qǐng)人:北京大學(xué)