專利名稱：Apc基因突變的快速檢測的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)學領域，具體涉及一種與多種腫瘤包括結(jié)直腸癌、肺癌、 胃癌和胰腺癌等診斷相關的APC基因突變的快速檢測。
背景技術(shù)：
大腸腺瘤息肉基因(APC adenomatous polyposis coli))是最早發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌 中的一種抑癌基因，APC基因的突變與遺傳性和散發(fā)性結(jié)腸癌的發(fā)生有著非常密切的關系， 大多數(shù)APC基因突變的結(jié)果是在其下游形成提前的終止密碼，使APC蛋白呈“截短”改變， 從而導致APC蛋白功能的障礙。后來，逐步發(fā)現(xiàn)胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌和食道癌等多種癌 癥有APC基因突變。APC蛋白與其它腫瘤抑制基因一樣，可控制細胞分裂過程中起關鍵作用 的基因的表達。APC基因是一個大片段的基因，開放閱讀框架為8535bp，分為15個外顯子，前面14 個外顯子很短，而第15號外顯子很長，編碼區(qū)為6577bp。APC基因突變?yōu)榛驂A基對組成 或排列順序發(fā)生改變，可分為點突變、缺失和插入突變，APC基因突變大約有95%產(chǎn)生終止 密碼子，編碼蛋白合成提前終止，從而產(chǎn)生截短蛋白(truncated protein) 0 APC基因突變 呈不隨機分布，其中1 2號外顯子無突變，第15號外顯子突變率為58. 3%，而且APC基 因最常見的突變在第15號外顯子中1061和1309號密碼子的5bp缺失是突變的熱點，發(fā)生 率分別為9. 2%和18.5%。APC相關的息肉病不僅發(fā)病率高，而且其發(fā)病的外顯率幾乎高 達100%，一旦攜帶致病基因，幾乎全部的患者均會出現(xiàn)癥狀及臨床表現(xiàn)，在長期的臨床隨 訪中，幾乎100%的息肉病患者會最終發(fā)展至癌變.所以檢測APC基因變化對預防、早期診 斷及早期治療結(jié)直腸癌具有重大意義。同樣APC基因可控制細胞分裂過程中起關鍵作用的 基因的表達，對胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌和食道癌等多種癌癥的預防、早期診斷及早期治療 也有重要的意義?；蛲蛔儥z測可以作為腫瘤分子診斷的一種新方法。惡性腫瘤病人血漿或血清中 存在高水平的循環(huán)DNA，這種DNA來源于惡性腫瘤細胞。新近研究已經(jīng)從癌癥患者血漿或 血清DNA中發(fā)現(xiàn)了幾種腫瘤特異的基因改變，表明這是檢測腫瘤相關基因改變的一條新途 徑。另外，糞便是另一種檢測胃腸道腫瘤突變的材料，F(xiàn)DA已經(jīng)批準了一項糞便中檢測基因 突變(包括APC基因)診斷結(jié)直腸癌的試劑盒，敏感性超過70%，特異性為81%，陽性預測 值為90%，陰性預測值為63%。檢測APC突變還可以了解病人的復發(fā)轉(zhuǎn)移風險。大多數(shù)剛切除結(jié)直腸癌原發(fā)病灶 的患者5年內(nèi)會出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移，病情分期越晚者復發(fā)轉(zhuǎn)移的風險越高。通過血清或血漿中 動態(tài)監(jiān)控APC基因突變，可及早發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者是否復發(fā)。對于有突變的胰腺癌、胃癌和 肺癌等多種癌癥患者，也可檢測是否復發(fā)。目前普遍應用的APC基因突變檢測方法為限制小片段長度多態(tài)性分析法(RFLP 法)和DNA直接測序等。RFLP法是將PCR與限制性酶切相結(jié)合的方法。但是該方法存在 以下缺點RFLP實驗操作繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性，非閉管操作，易于污染，難以滿足臨床檢測要求。DNA直接測序該方法存在以下缺點檢 測周期較長，花費昂貴，非閉管操作，難以避免交叉污染，通量不高。DNA直接測序的靈敏度 較低，雜合突變、膠壓縮、GC富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)， 需要多次重復測序才可能避免假陽性等，因此直接測序方法難適用于臨床檢測。臨床迫切需要開發(fā)一種快速、準確、操作簡便、設備要求低的APC基因突變檢測技 術(shù)，滿足APC突變相關的腫瘤檢測對時效和靈敏性方面的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速、準確、操作簡便和有效避免污染的檢測APC基因 突變的試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中進行APC基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污 染和靈敏度低等問題，尤其是提供了病理組織之外的非創(chuàng)傷性如血清或血漿等檢測。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于特異 性擴增APC基因靶向序列的若干個引物對，所述引物對含有APC基因的第15外顯子或第 14外顯子中至少15個連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸序列，所述第15外顯子具有SEQ ID No 1的連續(xù)核苷酸序列；所述APC14具有SEQ ID No 29的連續(xù)核苷酸序列。優(yōu)選的，連續(xù)核苷酸序列為SEQ ID No :2 27序列之一的正向核苷酸序列或反向 核苷酸序列。優(yōu)選的，所述引物為SEQ ID No 2 27序列之一的正向引物或反向引物。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反應體系，所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 10X ；
dNTPs0. 01 1. 5mM ；
引物序列終濃度為0. 01 2iiM ；
模板DNA0. 01 10ng/y L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 1. 0U/ ii L ；
MgCl2終濃度為0. 5 5mM ；
熒光染料1 3X。
優(yōu)選的，所述PCR反應體系終濃度組成為
PCR緩沖液終濃度1 5X ；
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物序列終濃度為0. 1 0. 5 ii M ；
模板DNA0. 05 1. 5ng/ u L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. 10U/ u L ；
MgCl2終濃度為1 3mM ；
熒光染料1 2X。
優(yōu)選的，所述熒光染料選自EvaGreen飽和性染料、LC Green染料、ResoLight染
料、SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混 合液；所述PCR緩沖液包括Tris *cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；-20°C下pH值在8. 0-9. 0間。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測APC基因外顯子位點突變的方法，其特征在 于所述方法包括以下步驟(1)設計并選取包括含有APC基因的第十五外顯子APC15或第十四外顯子APC14 中至少15個連續(xù)的核苷酸構(gòu)成連續(xù)核苷酸序列構(gòu)成的若干個引物對；(2)提取模板DNA，利用步驟(1)得到的引物對對模板DNA中APC基因進行PCR擴 增；(3)根據(jù)高分辨率熔解曲線法對擴增后的APC基因進行突變位點檢測。優(yōu)選的，所述步驟(2)中模板DNA從選自外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔 道的脫落物、病變組織中提取，進行PCR反應的條件為92 97°C預變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50個循環(huán)。優(yōu)選的，所述步驟(2)和步驟(3)在熒光定量PCR儀上進行，在熒光定量PCR儀上 擴增后，運行溶解曲線進行基因掃描分析，所述高分辨率熔解曲線法的條件為92 97°C 變性lmin ；40°C復性lmin ；然后初始熔解溫度60°C開始程序升溫熔解至95°C，并在溶解過 程中實時檢測熒光信號，30 50次每秒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種PCR反應試劑盒在腫瘤診斷相關的APC基因突變 檢測方面的應用，本試劑盒選用各種組織來源的基因組DNA如血細胞、口腔粘膜細胞和腫 瘤組織，尤其是采用非細胞體系血清或血漿來源的游離DNA片段。本發(fā)明的APC基因，其序列如SEQ No. 28所示，突變發(fā)生在APC基因外顯子15，3， 14序列，如下表； 本發(fā)明的試劑盒包括PCR引物、陰性對照品、PCR反應體系。所述的PCR引物，用 化學合成或PCR擴增獲得的突變位點兩端5-20個序列的模板，以及與之配對的反向序列。優(yōu)選的，所述的PCR引物，下表所示的引物對
最優(yōu)選的，所述的PCR引物為下表所示的引物對 反應體系中可以用陰性對照品來對照，陰性對照品為用常規(guī)方法從正常人組織中 提取獲得的核酸，包括DNA和RNA。組織選自外周血、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及 用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片。所述的PCR反應體系，包括PCR緩沖液、dNTP混合 液、熒光染料、MgCl2、Taq酶、DNA模板。PCR緩沖液，包括Tris C1，氯化鉀，硫酸銨，氯化 鎂；pH 8. 0-9. 0 (20°C )。所述的PCR緩沖液，包括10x緩沖液，終濃度15mM的氯化鎂，終pH 8.7。dNTP 混合液，包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合液。所述的熒 光染料，包括EvaGreen飽和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYT0 9染料。所述的MgC12，可以是 10-30mM MgC12。更優(yōu)選的，所述的 MgC12 為 25mM MgC12。Taq酶，包括濃度5units/ul，反應底物為dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/minat 72°C，存儲緩沖液 10-40mM Tris cl，50_200mM 氯化鉀(KCL)，0-5. OmM 二硫蘇糖醇(DTT)， 0-1. OmM乙二胺四乙酸二鈉鈣(EDTA),0-2. 0% (V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40， 0-2. 0% (V/V)吐溫 20(Tween 20) ,30-70% (v/v)甘油(glycerol)，穩(wěn)定劑(stabilizer) pH 7. 0-10. 0(20°C ) o所述的存儲緩沖液,包括終濃度為20mM Tris cl、100mM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.0. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v) 穩(wěn)定劑的終pH值為9.0。所述的DNA模板，是用常規(guī)方法從患者組織中提取獲得的核酸，包括DNA和RNA。 所述的患者組織選自外周血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及 用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片冰凍切片等。利用試劑盒進行檢測時，包括PCR擴增和 HRM程序，其反應條件(PCR反應條件和HRM的條件)如下表所示 優(yōu)選的PCR反應條件和HRM條件可以如下 本發(fā)明的試劑盒以及模板DNA在本發(fā)明所述的反應條件下在熒光定量PCR儀上進 行序列擴增，然后分析數(shù)據(jù)，運行溶解曲線觀察是否單峰，再運行Genescan自動分析程序， 得到分型的圖譜。所述的熒光定量PCR儀，其特征在于，包括LightCycler 480(羅氏公司， 巴塞爾，瑞士)、ABI 7500FAST(美國應用生物系統(tǒng)公司，紐約，美國)、ABI7900HT FAST(美 國應用生物系統(tǒng)公司，紐約，美國)、Qiagen Rotor-Gene 6000 (德國Qiagen公司，杜塞爾多 夫，德國)、Idaho LightScarmer(美國Idaho公司，愛達荷州，美國)。在使用時，將待測樣本稀釋到同一濃度，同時放入陰性對照，加入本發(fā)明的試劑盒，進行PCR反應，配套的基因 分型軟件即可自動區(qū)分野生型與突變型。在本發(fā)明檢測APC基因突變的試劑盒中，將待測樣本稀釋到同一濃度，同時做陽 性對照和陰性對照，加入試劑盒中相應的試劑，進行一次PCR反應，即可區(qū)分野生型與突變 型，可適用于APC基因第15外顯子的第1061個密碼子和1309個密碼子及第十四外顯子的 第47個密碼子突變的檢測。其中，所述的檢測方法包括以下步驟(1)在血液包括細胞或血清或血漿、分泌物或是組織中提取核酸樣本(2)用上述的試劑盒，以步驟(1)提取的核酸、陰性對照為模板，進行實時定量PCR 檢測(3) PCR反應的條件和HRM條件如下表 分析數(shù)據(jù)，運行溶解曲線觀察是否單峰，再運行Genescan自動分析程序，與陰性 對照參比，判斷樣本DNA中APC基因的各位點是否突變。本發(fā)明提供了一種檢測APC基因突變的試劑盒在腫瘤診斷中的應用，通過檢測待 測樣本中是否存在APC基因特定的突變位點，而判斷該個體發(fā)生癌癥的可能。這將有利于 在臨床上開展癌癥患者的APC基因突變的篩查工作，為癌癥患者的及早診斷和治療提供服 務。所述的腫瘤，包括結(jié)直腸癌、胃癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、皮膚癌、肉瘤、骨肉 瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、腦瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻竇癌、口腔有舌 癌、牙齦癌、甲狀腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮細胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴細胞癌。優(yōu)選的。所 述的腫瘤，包括結(jié)直腸癌，結(jié)腸腺癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌，上皮性卵巢癌，肺癌。本發(fā)明采用高分辨熔解曲線(high-resolution melt,HRM)分析技術(shù)，對APC基因 突變和基因分型，該技術(shù)是一種高效穩(wěn)健的post-PCR技術(shù)，不受突變堿基位點與類型的局 限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品基因型的分 析。這種方法因其操作簡便、快速，使用成本低，結(jié)果準確，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作。在本發(fā)明中，術(shù)語“試劑盒”是指用于PCR反應的混合物，它包括反應所需的緩沖 液(buffer)、dNTP混合液、引物、熒光染料、MgCl2、Taq酶。在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發(fā)合成與核酸鏈相互補的 引物擴增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆 轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進行上述合成。優(yōu)選的引物是單 股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設計用途，但在一般在15 25個核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復合物。 引物不必反應模板的準確序列，但必須充分互補，已與模板雜交并引發(fā)DNA合成。引物設計應遵循以下原則1.引物應在核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。 2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。3.引物長度一般在15 30堿基之間。4.G+C含量在40% 60%之間，Tm值最好接近72°C。5.堿基要隨機分布。6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的 互補。7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。8.引物5'端可以修飾。9.引物3'端不 可修飾。10.引物3'端要避開密碼子的第3位。11.引物3'端不能選擇A，最好選擇T。 12.擴增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。進行引物設計時，可以通過Primer Premier 5，Beacon Designer 7軟件進行設 計，將設計好的序列通過人工合成方法得到。引物合成一般使用亞磷酰胺三酯法將DNA固 定在固相載體上完成DNA鏈的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成 的，相鄰的核苷酸通過3' -5'磷酸二酯鍵連接。其具體步驟可以是1、將預先連接在固 相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5 ‘-羥基的保護基團 DMT，獲得游離的5'-羥基。2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮 唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3'端被活化，5'-羥基仍然被DMT保護，與溶 液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應。3、帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數(shù) 5'-羥基沒有參加反應(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應，這 種短片段可以在純化時分離掉。4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸經(jīng)過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯乙 酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT，重復以上步驟，直到所有要求合成的堿基被接上 去。最后通過氨水高溫處理，連接在CPG上的引物被切下來，通過OPC，PAGE等手段純化引 物。相對于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點是由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的檢測APC基因突變的試劑盒，采用新型突變研 究技術(shù)——高分辨率熔點曲線分析(High Resolution Melting Analysis，HRM)，無需序 列特異性探針，無需測序，也不受突變堿基位點與類型的局限，應用含HRM模塊的熒光定量 PCR儀器分析，參照陰性對照，即可完成對樣品基因型的判斷。本發(fā)明試劑盒靈敏度非常 高，可以使用在各種組織來源的基因組DNA如血細胞、口腔粘膜細胞和腫瘤組織，尤其是采 用非細胞體系血清或血漿來源的游離DNA片段，采用現(xiàn)有技術(shù)中的檢測方法是不可能實現(xiàn) 的。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖1為本發(fā)明實施例不同片段大小的引物進行PCR擴增得到的電泳圖；圖2為本發(fā)明實施例引物驗證的電泳圖；圖3為本發(fā)明實施例陰性對照DNA的電泳鑒定圖；圖4為本發(fā)明實施例陰性對照DNA的測序結(jié)果圖；圖5為本發(fā)明實施例不同活性的酶進行PCR擴增的電泳圖6為本發(fā)明實施例不同熒光染料的溶解曲線圖；圖7-1為本發(fā)明實施例不同MgC12終濃度進行PCR-HRM得到的PCR產(chǎn)物電泳圖； 圖7-2為本發(fā)明實施例不同MgC12終濃度進行PCR-HRM的溶解曲線圖；圖8為本發(fā)明實施例不同模板DNA來源的溶解曲線圖；圖9為本發(fā)明實施例檢測突變的靈敏度實驗溶解曲線圖；圖10為本發(fā)明實施HRM檢測精度分析溶解曲線11為本發(fā)明應用例結(jié)直腸癌患者的石蠟切片模板DNA進行擴增后檢測的溶解 曲線圖。圖12為本發(fā)明應用例結(jié)直腸癌患者的血漿模板DNA進行擴增后檢測的溶解曲線 圖。圖13為本發(fā)明應用例結(jié)直腸癌患者的血清模板DNA進行擴增后檢測的溶解曲線 圖。圖14為本發(fā)明應用例肺癌患者的血清模板DNA進行擴增后檢測的溶解曲線圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明 本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做 進一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。 實施例1引物的設計、合成和驗證本實施例采用Primer 5設計引物，首先優(yōu)化設計引物片段的大小，得到不同片段 大小引物PCR擴增的電泳圖，結(jié)果如圖1和下表所示。圖la為5-10bp的引物PCR擴增的 電泳圖，圖lb為13-16bp的引物PCR擴增的電泳圖，圖lc為18-24bp的引物PCR擴增的電 泳圖，圖1 d為25-28bp的引物PCR擴增的電泳圖，圖1 e為30_37bp的引物PCR擴增的電泳 圖，圖If為39-45bp的引物PCR擴增的電泳圖。由下表或圖1可知，最佳引物為18-24bp
大小的引物。
引物大 小(bp)5-913-1618-2425-2930-3739-45特異性特異性很 差特異性差特異性好特異性較 好特異性 差特異性 很差 根據(jù)上面的大小范圍，設計了以下引物對
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這些序列由上海Invitrogen公司通過亞磷酰胺三酯法合成，然后進行引物驗證。引物驗證采用PAGE電泳鑒定，步驟如下使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺 凝膠進行電泳。取0. 2-0. 50D的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到 飽和，上樣前加熱變性(95°C，2minS)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易 加樣。600V電壓進行電泳，約2-3小時后，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，得到如 圖2所示的電泳圖。在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。實施例2陰性對照DNA的制作陰性對照DNA的提取抽取正常人外周血2. 5ml于枸櫞酸納(1 9)抗凝管中，使 用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因組 DNA 提取試劑盒，按照試 劑盒操作說明，提取DNA。定量使用Nano 1000定量儀，測定DNA濃度，合格指標1，符合0D 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0 要求之間，再將 DNA定量稀釋到10ng/ul左右電泳鑒定結(jié)果如圖3 ；對其進行測序鑒定，將提取的DNA進行PCR擴增后送上海英 濰捷基公司測序，測序結(jié)果顯示所提取的DNA為正常人的，在APC基因上未發(fā)生突變，測序 結(jié)果如圖4，上述鑒定結(jié)果表明，按上述方法所獲得的DNA樣品符合陰性對照的要求。實施例3腫瘤組織DNA的提取樣本采集取新鮮組織塊50 100mg以PBS或生理鹽水清洗干凈，所用組織必須 切至厚度在0. 5cm以下，放入裝有1. 5ml體積RNAlater的凍存管中，充分混勻。(30分鐘內(nèi) 完成)；室溫下放置1-2小時，4°C冰箱過夜，第二天轉(zhuǎn)至-20°C長期保存。DNA 提取使用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因組 DNA提取試劑盒，按照試劑盒操作說明，提取DNA。DNA 純化(若提取的 DNA, 0D 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，沒有在標準范圍內(nèi)，則需要此步驟)加入等體積的氯仿-異戊醇(25 1)，向下翻轉(zhuǎn)離心管 5min以充分混勻，13000rpm離心lOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml離心管；加入1/10體 積的醋酸鈉(PH5. 2，3M)，再加入兩倍上清液體積的無水乙醇，輕輕搖勻，沉淀DNA13000rpm 離心3min，輕輕倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,離心3min，去上清液，倒置 5-10min (倒置時間視DNA塊狀沉淀大小以及DNA干燥的速度決定，注意DNA不可太干燥，否 則DNA將難以被溶解，但離心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸 管吹打使DNA充分溶解。實施例4血液中血漿DNA的提取采樣1、抽取病人外周血l_2ml于枸櫞酸納(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管。2、吸抗凝管中部分的血液至離心管SOOOrpm離心5分鐘，分離血漿和細胞。3、血漿小心移入另一無菌管子，注意不要吸到白細胞，-20度保存(1周)，管身標 示病人名字和編號，注明日期。DNA提取血漿Blood Mini kit試劑盒(德國QIAGEN公司生產(chǎn))進行血液的提 取，提取步驟參見試劑盒的說明書進行，其他涉及產(chǎn)品同樣處理，提取的DNA-20°C保存。實施例5血液中血清DNA的提取抽取病人外周血l-2ml至無抗凝的收集管，8000rpm離心5分鐘，吸取血清移入另 一無菌管子，注意不要吸到白細胞，"20度保存(1周)，管身標示病人名字和編號，注明日期 即可。然后進行DNA提取，可以按照如下步驟血清用Blood Mini kit試劑盒(德國 QIAGEN公司生產(chǎn))進行血液的提取，提取步驟參見試劑盒的說明書進行，其他涉及產(chǎn)品同 樣處理，提取的DNA-20 V保存。實施例6石蠟切片組織DNA的提取刮削5-10 ym厚的切片1-5片(如果標本已暴露空氣中，棄去最初的2_3層)。用 二甲苯脫蠟后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德國QIAGEN公司生產(chǎn))，按照試劑盒的操 作說明提取DNA，其他涉及產(chǎn)品同樣處理，提取的DNA-20°C保存。實施例7PCR、HRM條件的選擇和優(yōu)化1)熱啟動Taq酶的選擇用不同廠家的酶進行實驗，選擇活性比較高的酶，結(jié)果如下表和圖5，圖5中1、2、 3、4 分別為 HotStarTaq 酶、FastStartTaq 酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G 快速熱啟動 DNA聚合酶的酶活性檢測結(jié)果圖，根據(jù)該圖最終確定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活
性最高。 2)選擇合適的熒光染料用不同廠家的染料進行實驗，選擇結(jié)合效果好的染料；實驗結(jié)果如圖6所示，圖6 中 1、2、3、4、5 分別為 Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo 熒光染料的實驗結(jié) 果，據(jù)圖可知最佳染料為Eva Green和LC Green。 3)PCR反應條件的優(yōu)化在退火溫度、Mgcl2濃度兩方面PCR條件進行優(yōu)化調(diào)整，結(jié)果如表 60°C時，MgCl2濃度為2. 0Mm,2. 5mM的實驗圖如圖7_1和圖7_2所示，可以看出，選
14擇退火溫度為60°C，Mgcl2終濃度為2. 5mM時為最佳的條件。4) HRM條件的優(yōu)化從溶解的起始溫度、每秒鐘監(jiān)測熒光的次數(shù)兩方面對HRM條件進行優(yōu)化調(diào)整，結(jié)
果如下表 從上表可知，最佳HRM條件為 5) DNA來源樣本DNA來源選用外周血、口腔拭子、組織以及制成的石蠟切片這些方面，并對這些來 源的DNA進行檢測，檢測結(jié)果如下表和圖8所示 圖8Α D分別為外周血血漿、口腔、組織、石蠟切片的檢測結(jié)果，由圖可知，血清、 血漿、口腔拭子、組織和石蠟切片等提取的DNA均可用于本試劑盒檢測。6)靈敏度實驗實施例1 5獲得的材料和優(yōu)化的條件，確定檢測的靈敏度。實驗中，同時放入陰 性對照樣本、突變樣本、5%突變樣本、10%突變樣本、15%突變樣本。本試劑盒與其它檢 測方法靈敏度比較如圖9和下表所示，經(jīng)實驗確定，試劑盒檢測靈敏度最高可達到1%。其 他檢測方法對照文獻Mutation Research 635(2007) 105-117的檢測方法靈敏度數(shù)據(jù)，如下 表所示，本試劑盒達到目前多種突變檢測方法中最高靈敏度1%。 7)HRM檢測精度分析用實施例1 5獲得的材料和優(yōu)化的條件，確定檢測的精確度。實驗中，用 APC-1309的引物檢測肺癌患者石蠟切片組織，并與直接測序法相比較。本試劑盒和測序檢 測對照的檢測結(jié)果如下表所示，圖10為分型圖。
結(jié)論APC_1309引物檢測40例石蠟組織切片樣本實驗中，本試劑盒檢測出10例 樣本檢測有突變分型，實際測序有9例突變，HRM和測序檢測成功率100%，陽性檢測出率達 測序比較一致性100%，兩種方法檢測一致率為95%。從檢測結(jié)果分析，HRM技術(shù)本試劑盒 檢測突變的準確靈敏度超過測序。應用例1結(jié)直腸癌患者石蠟切片組織標本的基因掃描取結(jié)直腸癌患者的石蠟切片30例，提取DNA作為模板。使用儀器LlightCyClerTM 480熒光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、刮削5-10 u m厚的切片1-5片(如果標本已暴露空氣中，棄去最初的2-3層)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德國QIAGEN公司生產(chǎn))，按照試劑盒的操作 說明提取DNA 采用的PCR反應體系 實時熒光定量PCR過程(LightCyclerTM 480熒光定量PCR儀器分析) 檢測結(jié)果如圖11，圖IlAUlB分別表示APC-1061、APC-1309的檢測結(jié)果；用以上 優(yōu)化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結(jié)果在結(jié)直腸癌病人中檢出APC-1061 突變的有3例(檢出率大約為10% )，APC-1309突變的有7例(檢出率大約為23. 3% )， APC14突變的有1例(檢出率大約為3. 33%)。符合國內(nèi)外研究報道的結(jié)直腸癌中APC基 因突變的幾率。應用例2結(jié)直腸癌患者血漿的基因掃描抽取病人(共20例)外周血l_2ml于枸櫞酸鈉(1 9)抗凝管中，吸取部分血液 至離心管SOOOrpm離心5分鐘，分離血漿和細胞。血漿小心移入另一無菌管子，注意不要吸 到白細胞。提取血漿中的DNA作為模板。使用儀器LightCyclerTM 480熒光定量PCR儀器分析
DNA模板提取1、將抗凝血8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層血漿。2、用Qiagen Blood Mini kit (德國QIAGEN公司生產(chǎn))。按照試劑盒的操作說明 提取血漿DNA。引物序列 采用的PCR反應體系 實時熒光定量PCR過程(LightCyclerTM 480熒光定量PCR儀器分析)
檢測結(jié)果如圖12，圖12A、12B分別表示APC-1061、APC-1309的檢測結(jié)果；用以上 優(yōu)化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結(jié)果在結(jié)直腸癌病人中檢出APC-1061突 變的有2例(檢出率大約為10% )，APC-1309突變的有5例(檢出率大約為25% )，APC14 突變的有1例(檢出率大約為5%)。符合國內(nèi)外研究報道的結(jié)直腸癌中APC基因突變的幾率。應用例3結(jié)直腸癌患者血清的基因掃描抽取病人(20例)外周血l_2ml于枸櫞酸鈉(1 9)抗凝管中，吸取部分血液至 離心管SOOOrpm離心5分鐘，分離血清和細胞。血清小心移入另一無菌管子，注意不要吸到 白細胞。提取血清中的DNA作為模板。使用儀器LightCycler 480熒光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、將抗凝血8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德國QIAGEN公司生產(chǎn))。按照試劑盒的操作說明 提取血清DNA。引物序列 采用的PCR反應體系 實時熒光定量PCR過程(LightCyclerTM 480熒光定量PCR儀器分析) 檢測結(jié)果如圖13，圖13A、13B分別表示APC-1061、APC-1309的檢測結(jié)果；用以上 優(yōu)化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結(jié)果在結(jié)直腸癌病人中檢出APC-1061突 變的有2例(檢出率大約為10% )，APC-1309突變的有4例(檢出率大約為20% )，APC14 突變的有1例(檢出率大約為5%)。應用例4肺癌患者血清的基因掃描抽取病人(30例)外周血l_2ml于非抗凝管中，吸取部分血液至離心管8000rpm 離心5分鐘，分離血清和細胞。血清小心移入另一無菌管子，注意不要吸到白細胞。提取血 清中的DNA作為模板。使用儀器LightCycler 480熒光定量PCR儀器分析DNA模板提取1、將非抗凝血8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上層血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德國QIAGEN公司生產(chǎn))。按照試劑盒的操作說明 提取血清DNA。
引物序列 PCR反應體系 PCR和HRM反應條件 結(jié)果討論檢測結(jié)果如圖14，圖14A、14B分別表示APC-1061、APC-1309的檢測結(jié)果；用以上 優(yōu)化的PCR反應體系和條件對DNA樣本進行檢測，結(jié)果在肺癌病人中檢出APC-1061突變的有2例(檢出率大約為6. 67% )，APC-1309突變的有6例(檢出率大約為20% )，APC14突 變的有1例(檢出率大約為3. 33% )。 上述實例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人是 能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精 神實質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于特異性擴增APC基因靶向序列的若干個引物對，所述引物對含有APC基因的第15外顯子或第14外顯子中至少15個連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸序列，所述第15外顯子具有SEQ ID No1的連續(xù)核苷酸序列；所述APCI4具有SEQ ID No29的連續(xù)核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述連續(xù) 核苷酸序列為SEQ ID No 2 27序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述引物 為SEQ ID No 2 27序列之一的正向引物或反向引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述試劑 盒還包括PCR緩沖液、dNTPs、熒光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反應體系， 所述PCR反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 10 X;dNTPs0. 01 1. 5mM弓丨物序列終濃度為0. 01 2 y M ；模板 DNA0. 01 10ng/ii L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 1. 0U/ ii L ；MgC12終濃度為0. 5 5mM ；熒光染料1 3X。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述PCR 反應體系終濃度組成為PCR緩沖液終濃度1 5X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列終濃度為0. 1 0. 5 y M ；模板 DNA0. 05 1. 5ng/ u L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. 10U/ u L ；MgC12終濃度為1 3mM ；熒光染料1 2X。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述熒光 染料可選自DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、LCGreen PLUS染料、ResoLight染料、 SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR緩沖液包括Tris cl，氯化鉀，硫酸銨，氯化鎂；-20°C下pH值在8. 0-9. 0間。
7.—種檢測APC基因外顯子位點突變的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)設計并選取包括含有APC基因的第十五外顯子APC15或第十四外顯子APC14至少 15個連續(xù)的核苷酸構(gòu)成連續(xù)核苷酸序列構(gòu)成的若干個引物對；(2)提取模板DNA，利用步驟(1)得到的引物對對模板DNA中APC基因進行PCR擴增；(3)根據(jù)高分辨率熔解曲線法對擴增后的APC基因進行突變位點檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中提取模板DNA從選自外周 血細胞、外周血血清或血漿、體液、腔道的脫落物、病變新鮮組織、冰凍病變切片、石蠟病變 切片中提取，進行PCR反應的條件為92 97°C預變性4 15min ；92 97°C變性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50個循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(2)和步驟(3)在熒光定量PCR 儀上進行，在熒光定量PCR儀上擴增后，運行溶解曲線進行基因掃描分析，所述高分辨率熔 解曲線法的條件為92 97°C變性lmin ；40°C復性lmin ；然后初始熔解溫度60°C開始程序 升溫熔解至95°C，并在溶解過程中實時檢測熒光信號，30 50次每秒。
10.一種PCR反應試劑盒在腫瘤診斷相關的APC基因突變檢測方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測APC基因突變的PCR反應試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括用于特異性擴增APC基因靶向序列的若干個引物對，所述引物對含有APC基因的第15外顯子或第14外顯子中至少15個連續(xù)的核苷酸構(gòu)成的連續(xù)核苷酸序列，所述第15外顯子具有SEQ ID No1的連續(xù)核苷酸序列；所述APC14具有SEQ ID No29的連續(xù)核苷酸序列。本發(fā)明的試劑盒采用飽和探針和高分辨率溶解曲線分析技術(shù)，完成對樣品基因型的判斷，從而診斷包括結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌和胃癌等腫瘤。
文檔編號G01N21/64GK101875970SQ20101013420
公開日2010年11月3日 申請日期2010年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月29日
發(fā)明者唐太清, 王弢, 秦勇, 陳菲 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司