專利名稱：：基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的多組分同時(shí)檢測(cè)的均相免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于熒光免疫分析
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：免疫分析法是一種微量生物分析方法，它利用抗原抗體間的高親和性以及作為探針的標(biāo)記物的高度可測(cè)性，能夠?qū)ι矬w內(nèi)微量物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，具有操作簡(jiǎn)單、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域研究的重要手段。免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為放射免疫分析法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、熒光免疫分析法(FIA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)等。RIA靈敏度高但存在放射性污染，已逐漸退出市場(chǎng)。ELISA是目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛的免疫分析方法，但靈敏度較低，一般僅用于定性或半定量分析。CLIA是上個(gè)世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新的免疫分析方法，但成本較高，且靈敏度并未達(dá)到RIA的水平，目前并未廣泛應(yīng)用。常規(guī)熒光免疫分析法(FIA)因無放射性、無酶試劑的不穩(wěn)定性及效期限制，在超微量免疫分析領(lǐng)域引起人們更大的關(guān)注。在FIA領(lǐng)域中，最重要的改進(jìn)之一是發(fā)展了時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)，具有靈敏度高、線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。免疫分析根據(jù)其反應(yīng)系統(tǒng)的物理狀態(tài)的不同可以分為均相免疫分析和非均相免疫分析。在現(xiàn)有的免疫分析方法中，非均相免疫分析法以RIA、ELISA和CLIA應(yīng)用最為廣泛，但非均相免疫分析需要進(jìn)行抗原抗體復(fù)合物與游離抗原抗體的分離步驟，從而提高信噪比和分析的靈敏度，所以操作相對(duì)繁瑣。分離抗原抗體復(fù)合物與游離抗原抗體是關(guān)鍵，也最容易產(chǎn)生誤差。而且由于非均相免疫分析包括了包被(抗原或抗體)、封閉、多次溫育、洗滌以及檢測(cè)等過程，一般需要2小時(shí)以上。均相免疫分析因其具有不需要分離抗原抗體復(fù)合物與游離抗原抗體即可直接以及均相反應(yīng)比固相、半固相反應(yīng)更為簡(jiǎn)便迅速等特點(diǎn)，成為目前免疫分析方法研究中的重要方向。其中均相熒光免疫分析在抗原抗體特性性反應(yīng)完成之后，無需將抗原抗體復(fù)合物與游離的抗原抗體進(jìn)行分離，可以直接進(jìn)行測(cè)定，操作簡(jiǎn)單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，得到了廣泛應(yīng)用。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是一種非輻射的能量轉(zhuǎn)移，其產(chǎn)生需滿足以下4個(gè)條件1)能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的激發(fā)光譜有效重疊；2)能量供體的量子產(chǎn)率較高；3)供體受體間滿足一定的耦極取向；4)供體受體間的距離小于10nm。供體與受體之間發(fā)生FRET將會(huì)使能量供體的熒光強(qiáng)度降低，受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)伴隨它們的熒光壽命的相應(yīng)縮短和延長(zhǎng)。FRET技術(shù)作為一種高效的光學(xué)“分子尺”，在于生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測(cè)等方面有廣泛的應(yīng)用。FRET屬于一種比較簡(jiǎn)便的均相免疫分析法，由于其操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度較快，越來越引起人們的關(guān)注。以FRET為基礎(chǔ)的均相免疫分析法可分為夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法。夾心法就是能量轉(zhuǎn)移的供體和受體分別標(biāo)記同一個(gè)抗原相結(jié)合的兩種抗體，形成D-Abl:Ag:Ab2-A形式的抗原抗體復(fù)合物，使供體和受體之間的距離減小，發(fā)生FRET，從而可以判斷免疫反應(yīng)的發(fā)生。競(jìng)爭(zhēng)法就是能量轉(zhuǎn)移的供體和受體分別標(biāo)記抗原和抗體中的一種。由于抗原、抗體之間的特異性結(jié)合，使供體和受體之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)加入未標(biāo)記的抗原或抗體時(shí)，由于與標(biāo)記的抗原或抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，產(chǎn)生無FRET現(xiàn)象的抗原抗體復(fù)合物，從而可以檢測(cè)抗原或抗體。基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的均相免疫分析方法是由1976年UlIman等人首先提出的，實(shí)現(xiàn)了抗原抗體的均相免疫分析的定量測(cè)定(UllmanEF，SchwarzbergM，RubensteinKE.JBiolChem,1976,251(14):4172_4178)。目前基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的均相免疫測(cè)定已應(yīng)用于檢測(cè)抗原。Ueda等(UedaH,KubotaK,WangY，etal.Biotechniques，1999，27(4):738_742)用琥珀酰亞胺脂和熒光黃-X分別標(biāo)記抗體的重鏈和輕鏈，兩者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗體的特異結(jié)合，使琥珀酰亞胺脂與熒光黃-X靠近，用490nm波長(zhǎng)激發(fā)琥珀酰亞胺脂，檢測(cè)到520nm發(fā)射光減弱，605nm的發(fā)射光增強(qiáng)，隨著抗原量的增加，605nm的熒光亦增強(qiáng)。在檢測(cè)中只能對(duì)一種抗原進(jìn)行定量分析。量子點(diǎn)是一種寬激發(fā)的熒光染料，相對(duì)于有機(jī)染料有很多優(yōu)點(diǎn)，自2001年起就被應(yīng)用于FRET中。首先，激發(fā)量子點(diǎn)的激發(fā)波長(zhǎng)范圍很寬，可以從紫外到遠(yuǎn)紅外區(qū)，因此可以用同一波長(zhǎng)的光激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)，并且可以通過選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)來避免對(duì)受體分子的直接激發(fā)。其次，量子點(diǎn)的大小不同，所發(fā)射的熒光顏色不同，可以通過改變量子點(diǎn)的大小來調(diào)節(jié)量子點(diǎn)的發(fā)射光譜與受體分子吸收光譜的重疊程度，從而可以調(diào)節(jié)FRET的效率。再次，量子點(diǎn)的熒光譜峰狹窄而對(duì)稱，半高峰寬通常為2545nm；量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度可達(dá)有機(jī)熒光染料羅丹明6G的數(shù)十倍，且熒光量子產(chǎn)率較高，對(duì)光漂白有強(qiáng)烈的抵制作用。由于這些獨(dú)特的量子優(yōu)勢(shì)，近來對(duì)其應(yīng)用于FRET的研究更為深入，范圍不斷擴(kuò)展。本發(fā)明致力于利用寬激發(fā)的熒光材料激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬且發(fā)射光譜可調(diào)的特性，建立一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的多組分同時(shí)檢測(cè)的均相免疫分析方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于建立一種多組分同時(shí)檢測(cè)的均相熒光免疫分析方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)在多組分檢測(cè)中存在的步驟繁瑣、靈敏度低等不足，達(dá)到快速、靈敏的檢測(cè)目標(biāo)。FRET技術(shù)主要用于液相反應(yīng)中，將FRET應(yīng)用于免疫分析即可根據(jù)標(biāo)記物熒光信號(hào)的變化達(dá)到檢測(cè)的目的，無需洗滌分離的步驟，即均相免疫分析，從而實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。寬激發(fā)的熒光材料具有激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬且發(fā)射光譜可調(diào)的特性，為多組分同時(shí)檢測(cè)提供了可能性。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的多組分同時(shí)檢測(cè)的均相免疫分析方法，是以高量子產(chǎn)率的熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為能量供體，以兩種或兩種以上寬激發(fā)的熒光染料為能量受體，按下列步驟操作步驟一用同一種所述的能量供體標(biāo)記兩種或兩種以上待測(cè)抗原，用不同的能量受體分別標(biāo)記相應(yīng)的兩種或兩種以上的抗體，或用所述的兩種或兩種以上的能量受體分別標(biāo)記兩種或兩種以上的待測(cè)抗原，用一種所述的能量供體標(biāo)記相應(yīng)的兩種或兩種以上抗體，得到標(biāo)記組分，且所述的作為能量供體和能量受體的熒光物質(zhì)為符合FRET特征的試劑對(duì)；步驟二配制五個(gè)已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測(cè)抗原溶液，令步驟一得到的標(biāo)記組分與該已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測(cè)抗原溶液進(jìn)行均相競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，反應(yīng)過程如下將步驟一得到的標(biāo)記組分與待測(cè)抗原溶液在PH6-8的緩沖液中混合均勻，25°C溫育30分鐘，得到混合體系；步驟三免疫反應(yīng)完成后，以所用能量供體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為激發(fā)光，以所用的不同能量受體的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)混合體系的熒光強(qiáng)度，得到各種能量受體的熒光光譜數(shù)據(jù)；步驟四依據(jù)各種能量受體的熒光光譜數(shù)據(jù)，采用去卷積法參見=EllenR.Goldman,AaronR.Clapp,GeorgeP.Anderson,etal,AnalyticalChemistry,2004(76)684-688，計(jì)算得到所用能量受體的相對(duì)熒光強(qiáng)度；步驟五制作待測(cè)抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行公式擬合，分別得到各種待測(cè)抗原濃度的計(jì)算公式；步驟六令未知濃度的兩種或兩種以上待測(cè)抗原與標(biāo)記組分重復(fù)以上步驟二、步驟三、步驟四，將最終得到的相對(duì)熒光強(qiáng)度代入上述步驟五得到的擬合公式中計(jì)算即得到各待測(cè)抗原的濃度。本發(fā)明方法中作為能量供體的熒光物質(zhì)是熒光素、熒光蛋白或稀土元素；作為能量供體的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是發(fā)光蛋白或魯米諾；作為能量受體的是寬激發(fā)的熒光染料，所述的寬激發(fā)的熒光材料是量子點(diǎn)、雙光子試劑或熒光蛋白。本發(fā)明方法中作為能量供體的稀土元素離子是Tb3+、Dy3+、Sm3+或Eu3+。在本發(fā)明方法所述的混合體系中，所用的能量供體是同一種，所用的能量受體是不同種，所用的能量受體與能量供體能組合成符合FRET特征的試劑對(duì)。本發(fā)明方法所述的待測(cè)的兩種或兩種以上抗原可以是病毒、細(xì)菌、真菌、衣原體、支原體、腫瘤相關(guān)抗原或具有抗原決定簇的物質(zhì)。本發(fā)明將高量子產(chǎn)率的熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)作為能量供體的前提下，將寬激發(fā)的熒光染料作為熒光共振能量轉(zhuǎn)移的受體，因?qū)捈ぐl(fā)的熒光染料熒光壽命很短(一般僅為315ns)，在時(shí)間分辨模式下，寬激發(fā)的熒光染料自身被儀器光源激發(fā)所發(fā)射的熒光信號(hào)被消除，而具有高量子產(chǎn)率的熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)將能量轉(zhuǎn)移至能量受體的熒光信號(hào)就能被記錄，這樣就能解決其寬激發(fā)的問題，并且在時(shí)間分辨模式下能消除背景熒光的影響，大大提高分析方法的靈敏度。本發(fā)明是用于檢測(cè)樣本中兩種或兩種以上待測(cè)抗原濃度的方法，先進(jìn)行抗原抗體的標(biāo)記，當(dāng)抗原標(biāo)記上能量供體時(shí)，抗體標(biāo)記能量受體；當(dāng)抗體標(biāo)記上能量供體時(shí)，抗原標(biāo)記能量受體；在將檢測(cè)待測(cè)樣本與標(biāo)記的抗原抗體相互接觸前后受體的相對(duì)熒光強(qiáng)度的變化，對(duì)待測(cè)樣本中的多種目標(biāo)抗原濃度進(jìn)行定量分析。具體是將兩種或兩種以上的待測(cè)抗原和分別特異識(shí)別這幾種抗原的單克隆抗體分別標(biāo)記熒光特性能夠滿足發(fā)生FRET的能量供受體對(duì)，由于抗原抗體的特異性結(jié)合，將能量供受體的距離拉近，達(dá)到發(fā)生FRET的距離要求以內(nèi)，即1lOnm，而發(fā)生FRET現(xiàn)象。加入幾種待測(cè)抗原后，待測(cè)抗原分別與熒光標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)而減弱了FRET現(xiàn)象，相應(yīng)的能量供體的發(fā)射光增強(qiáng)，而能量受體的發(fā)射光減弱。分別測(cè)定幾種能量受體發(fā)射光熒光強(qiáng)度的變化，可以對(duì)待測(cè)樣本中的多種目標(biāo)抗原濃度進(jìn)行定量分析。本發(fā)明建立了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析(FIA)的方法，有效解決了免疫分析方法中存在的操作步驟繁瑣、靈敏度低等缺點(diǎn)，保證了方法的快速靈敏，實(shí)現(xiàn)了多組分同時(shí)檢測(cè)。圖1為本發(fā)明原理示意圖，圖中1、2代表兩種不同發(fā)射波長(zhǎng)的能量受體，3、4代表兩種待測(cè)抗原，5、6代表與3、4對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，7代表能量供體，8代表發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的過程。該原理示意圖中相同的圖形代表相同的內(nèi)容。圖2是AFP濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3是HCGβ濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線選用稀土元素離子Tb3+為能量供體，寬激發(fā)的熒光材料——兩種量子點(diǎn)為能量受體，以甲胎蛋白(AFP)和人絨毛膜促性腺激素(HCGii)為兩種待測(cè)抗原，闡述具體實(shí)施方式。1.使用的儀器多標(biāo)記分析儀PerkinElmer1420；紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析TU1901)2.使用的試劑氧化鋱購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，購(gòu)自sigma試劑；稀土元素配體BBCAP購(gòu)自sigma試劑；兩種量子點(diǎn)(發(fā)射波長(zhǎng)為分別565nm、655nm)，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，碳酸鹽，磷酸鹽，二甲基亞砜(DMSO)等為分析純。3.條件和步驟由以下三個(gè)步驟組成①稀土元素配體BBCAP標(biāo)記抗原配制溶液稀土元素離子Tb3+溶液稱取50mg氧化鋱，溶于50mL6M的鹽酸溶液中，得到TbCl3溶液，即為Tb3+溶液；偶聯(lián)緩沖液0.05M(pH9.5)NaHCO3緩沖液；活化緩沖液0.OlM(pH7.4)磷酸鹽緩沖液；透析緩沖液0.01Μ(ρΗ8·0)Tris-HCl含0.9%(w/v)NaCl；C存緩沖液0·01Μ(ρΗ8·0)Tris-HCl含0.05%(w/v)NaN3。標(biāo)記方法稱取BBCAP6.Omg，溶于0.5mL偶聯(lián)緩沖液中，加入9.OmgEDC.HCl，冰水浴中攪拌30分鐘，得到BBCAP與EDC·HCl混合液；稱取AFP抗原1.Omg,溶于0.3mL偶聯(lián)緩沖液中，逐滴滴入BBCAP與EDC-HCl混合液中，繼續(xù)冰水浴攪拌20小時(shí)；·4°C透析過夜，換液三次。產(chǎn)物用S印hedex650柱層析(0.01MpH8.OTris-HCl平衡)，取集第一峰，加0.05%NaN3(w/v)于4°C保存；用同樣的方法標(biāo)記HCGβ。②量子點(diǎn)標(biāo)記抗體；以DMSO為溶劑，配制IOmM的SMCC溶液。在125μL量子點(diǎn)溶液中加入14μLSMCC溶液，充分混勻后室溫下反應(yīng)1小時(shí)，得到活化的量子點(diǎn)；·以活化緩沖液為溶劑，分別配制IM的DTT溶液和lmg/mL的AFP單抗溶液。在300μL單抗溶液中加入6.1μLDTT溶液，迅速混勻后室溫下反應(yīng)30分鐘，得到活化的AFP單抗；分別將上述活化的量子點(diǎn)和活化的AFP單抗經(jīng)S印hadex625柱層析純化，再將純化的產(chǎn)物混合，室溫下反應(yīng)1小時(shí)，得到偶聯(lián)反應(yīng)物；用蒸餾水配制IOmM的2_巰基乙醇溶液，在上述偶聯(lián)反應(yīng)物中加入10μL2_巰基乙醇溶液，室溫下反應(yīng)30分鐘，得到偶聯(lián)產(chǎn)物；偶聯(lián)產(chǎn)物用Superdex200柱層析純化(0.OlMpH7.4PBS溶液平衡)，取集第一峰，加0.05%NaN3(w/v)于4°C保存。③進(jìn)行基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的均相時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑準(zhǔn)備稀釋液0·01Μ(ρΗ8·0)Tris-HCl含0.9%(w/v)NaCl,0.2%(w/v)BSA；AFP抗原已知濃度的溶液0·lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、l.Ong/mL；HCGβ抗原已知濃度的溶液0.2ng/mL、0.4ng/mL、0.8ng/mL、1.5ng/mL、2.Ong/mL；AFP-BBCAP1.2μg/mL；HCGβ-BBCAP:2·0μg/mL；QD565-AbAFP0.3μMQD665-AbHCG00.5μM分析方法將AFP-BBCAP、HCGβ-BBCAP分別稀釋500倍，QD565_AbAFP、QD665-Ablirae分別稀釋100倍；在熒光微孔板中每孔加入兩種抗原標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)各30μL，再加入AFP-BBCAP、HCGβ-BBCAP各35μL，最后加入QD565_AbAFP、QD665-Ablirae各35μL，37°C溫育1小時(shí);多標(biāo)記分析儀在時(shí)間分辨模式下分別檢測(cè)565nm和655nm的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如下QD565的熒光強(qiáng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>QD665的熒光強(qiáng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>依據(jù)兩種量子點(diǎn)的熒光光譜數(shù)據(jù)，采用去卷積法參見EllenR.Goldman,AaronR.Clapp,GeorgeP.Anderson,etal,AnalyticalChemistry,2004(76):684_688，計(jì)算得到各種能量受體的相對(duì)熒光強(qiáng)度，制作AFP與HCGi3的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2和圖3。AFP與HCGβ的標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算公式分別為=Y=-1.84Χ+3.52，Y=-0.718Χ+4.23。血清中AFP與HCGβ濃度的測(cè)定將待測(cè)血清按照上述分析方法進(jìn)行操作，測(cè)得565nm和655nm處的熒光強(qiáng)度分別為1356和2237，通過去卷積法計(jì)算得到的相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為2.35和3.85，分別代入AFP與HCGβ的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算得到AFP與HCGβ的濃度分別為0.63ng/mL和0.53ng/mL。用時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)測(cè)得的結(jié)果與上述結(jié)果一致。權(quán)利要求基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的多組分同時(shí)檢測(cè)的均相免疫分析方法，其特征在于，以高量子產(chǎn)率的熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)為能量供體，以兩種或兩種以上寬激發(fā)的熒光染料為能量受體，按下列步驟操作步驟一用同一種所述的能量供體標(biāo)記兩種或兩種以上待測(cè)抗原，用不同的能量受體分別標(biāo)記相應(yīng)的兩種或兩種以上的抗體，或用所述的兩種或兩種以上的能量受體分別標(biāo)記兩種或兩種以上的待測(cè)抗原，用一種所述的能量供體標(biāo)記相應(yīng)的兩種或兩種以上抗體，得到標(biāo)記組分，且所述的作為能量供體和能量受體的熒光物質(zhì)為符合FRET特征的試劑對(duì)；步驟二配制五個(gè)已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測(cè)抗原溶液，令步驟一得到的標(biāo)記組分與該已知濃度梯度的兩種或兩種以上待測(cè)抗原溶液進(jìn)行均相競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，反應(yīng)過程如下將步驟一得到的標(biāo)記組分與待測(cè)抗原溶液在pH6-8的緩沖液中混合均勻，25℃溫育30分鐘，得到混合體系；步驟三免疫反應(yīng)完成后，以所用能量供體的最大激發(fā)波長(zhǎng)為激發(fā)光，以所用的不同能量受體的發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)混合體系的熒光強(qiáng)度，得到各種能量受體的熒光光譜數(shù)據(jù)；步驟四依據(jù)各種能量受體的熒光光譜數(shù)據(jù)，采用去卷積法，計(jì)算得到所用能量受體的相對(duì)熒光強(qiáng)度；步驟五制作待測(cè)抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行公式擬合，分別得到各種待測(cè)抗原濃度的計(jì)算公式；步驟六令未知濃度的兩種或兩種以上待測(cè)抗原與標(biāo)記組分重復(fù)以上步驟二、步驟三、步驟四，將最終得到的相對(duì)熒光強(qiáng)度代入上述步驟五得到的擬合公式中計(jì)算即得到各待測(cè)抗原的濃度。2.按照權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，作為能量供體的熒光物質(zhì)是熒光素、熒光蛋白或稀土元素。3.按照權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，作為能量供體的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是發(fā)光蛋白或魯米諾。4.按照權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，作為能量受體的是寬激發(fā)的熒光染料。5.按照權(quán)利要求4所述的分析方法，其特征在于，所述的寬激發(fā)的熒光材料是量子點(diǎn)、雙光子試劑或熒光蛋白。6.按照權(quán)利要求2所述的分析方法，其特征在于，作為能量供體的稀土元素離子是Tb3+、Dy3+、Sm3+或Eu3+。7.按照權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分析方法，其特征在于，在所述的混合體系中，所用的能量供體是同一種，所用的能量受體是不同種，所用的能量受體與能量供體能組合成符合FRET特征的試劑對(duì)。8.按照權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的待測(cè)的兩種或兩種以上抗原可以是病毒、細(xì)菌、真菌、衣原體、支原體、腫瘤相關(guān)抗原或具有抗原決定簇的物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明提供了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的多組分同時(shí)檢測(cè)的均相免疫分析方法，該方法利用作為能量受體的熒光物質(zhì)的多色性建立了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的均相熒光免疫分析(FIA)的新方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多組分抗原的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明將作為能量供體的熒光物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)以及作為能量受體的熒光物質(zhì)分別標(biāo)記需要檢測(cè)的幾種抗原和相應(yīng)的抗體，抗原抗體的特異性結(jié)合使得能量供體和受體之間距離縮短，從而發(fā)生從能量供體到受體的FRET，根據(jù)受體的熒光強(qiáng)度變化得出樣品中抗原濃度，是一種快速、靈敏、多組分同時(shí)檢測(cè)的均相免疫分析新方法。文檔編號(hào)G01N33/577GK101806802SQ201010160060公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月29日優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日發(fā)明者劉振世,楊海,楊祥良,胡珊,金偉申請(qǐng)人:華中科技大學(xué);武漢百仕康生物科技有限公司