專利名稱：超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)方法，具體地說(shuō)是一種超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢 測(cè)方法。
背景技術(shù)：
免疫層析試紙條檢測(cè)是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏、直觀、價(jià)格低廉，可根據(jù)需要隨時(shí)進(jìn) 行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法。具有其它檢測(cè)方法例如氣相色譜法、高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用色譜 法、液質(zhì)聯(lián)用色譜法、毛細(xì)管電泳等儀器檢測(cè)方法不具備的優(yōu)點(diǎn)。在檢測(cè)技術(shù)中處于重要的 地位，也是對(duì)傳統(tǒng)檢測(cè)和儀器檢測(cè)的良好補(bǔ)充。尤其在科學(xué)技術(shù)發(fā)展，生活水平提高的當(dāng) 代，人類重大疾病，環(huán)境污染，食品安全等問(wèn)題日益受到極大的關(guān)注，免疫層析檢測(cè)技術(shù)更 加具有重要的作用。目前，免疫層析產(chǎn)品主要為膠體金免疫層析試紙條，其最早應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，在早 孕檢測(cè)中應(yīng)用取得了極大的成功；隨后在各個(gè)領(lǐng)域迅速被擴(kuò)大應(yīng)用。在毒品檢測(cè)、環(huán)境檢 測(cè)、食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到了迅速的推廣和應(yīng)用?，F(xiàn)有免疫層析檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)是由于食 品安全檢測(cè)、農(nóng)藥、獸藥殘留檢測(cè)限度要求極度苛刻；同時(shí)食品類物質(zhì)如肉類、禽類、果蔬、 谷物等成分復(fù)雜，前處理難度大；膠體金免疫層析檢測(cè)靈敏度往往無(wú)法滿足人們的要求。因 此發(fā)明一種靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)便、直觀、價(jià)格低廉的免疫層析檢測(cè)方法是十分重要的。量子點(diǎn)是近20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的半導(dǎo)體納米晶材料，它具有如下特點(diǎn)1、不同粒 徑大小的量子點(diǎn)具有不同的顏色，激發(fā)量子點(diǎn)的波長(zhǎng)范圍很寬，且連續(xù)分布，可以用同一波 長(zhǎng)的光激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)而獲得多種顏色標(biāo)記，是一類理想的熒光探針。2、被激發(fā)的 量子點(diǎn)所發(fā)射的熒光譜峰狹窄而對(duì)稱，同時(shí)使用不同光譜特征的量子點(diǎn)發(fā)射光譜不出現(xiàn)交 疊；使生物分子的定量檢測(cè)和多組分檢測(cè)變得容易。3、量子點(diǎn)探針的熒光強(qiáng)度比最常用的 羅丹明6G染料高20倍；穩(wěn)定性是羅丹明6G的100倍以上；可以經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，不易發(fā) 生熒光淬滅，光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易分解。由于半導(dǎo)體納米晶材料具有這些優(yōu)良性能使得它為檢測(cè)與診斷提供了有力工具。 近年來(lái)從細(xì)胞標(biāo)記應(yīng)用已逐漸開(kāi)始向多個(gè)領(lǐng)域的檢測(cè)與診斷方向發(fā)展。由于量子點(diǎn)一般 粒徑微小，只有I-IOnm左右，單個(gè)量子點(diǎn)發(fā)光強(qiáng)度有限，單個(gè)量子點(diǎn)與抗體相偶聯(lián)，在實(shí)際 應(yīng)用中靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此想要得到更高的發(fā)光強(qiáng)度，不僅是要提高單個(gè)量子點(diǎn)的熒光 量子產(chǎn)率，更重要的是將多個(gè)量子點(diǎn)形成尺寸較大的微球，使得每個(gè)球體上具有大量的量 子點(diǎn)；同時(shí)不能造成熒光強(qiáng)度的猝滅。將量子點(diǎn)包裹成球通常的做法是用反相微乳液法或 Stsber發(fā)明的Steber法，將多個(gè)量子點(diǎn)包裹進(jìn)二氧化硅納米粒子中。應(yīng)用這種方法得到 的硅包量子點(diǎn)微球因?yàn)殪o電排斥只能包裹少量量子點(diǎn)，同時(shí)因?yàn)榉磻?yīng)中試劑的作用，造成 熒光強(qiáng)度很大的猝滅，無(wú)法得到較高的靈敏度。中國(guó)專禾Ij200610024086. 7,200810045548. 2,200810041133. 8,200810227473. X、 200810186010. 3都不同程度的涉及量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測(cè)方法，由于選用的都為單個(gè) 量子點(diǎn)或者核殼型量子點(diǎn)，即使應(yīng)用包裹技術(shù)，靈敏度也受到很大的限制。
為了提供一種靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)便、直觀、價(jià)格低廉、應(yīng)用廣泛的免疫層析檢測(cè)方 法，發(fā)明一種超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，對(duì)于人類重大疾病，環(huán)境污 染，食品安全的檢測(cè)是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏度高、檢測(cè)簡(jiǎn)便、直觀、價(jià)格低廉、應(yīng)用廣泛的超靈 敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)制備氨基化二氧化硅納米粒子A、由表面活性劑、油相、水相、助劑配制反相微乳液體系；在氨水為催化劑的情況 下水解正硅酸乙酯制備小粒徑二氧化硅納米粒子；B、大粒徑的二氧化硅納米粒子可用st6ber法在乙醇/水溶液中用氨水催化TEOS 合成；C、將二氧化硅納米粒子用硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行氨基化改性；得氨基化二氧化硅納米粒 子；(2)將氨基化二氧化硅納米粒子與抗體在縮合劑的作用下37°C孵育l-10h，高速 離心1-4次除去未結(jié)合抗體與縮合劑；(3)將離心后的沉淀物復(fù)溶，加入縮合劑及羧基化水溶性量子點(diǎn)，37°C下孵育 1-I0h，高速離心除去游離的量子點(diǎn)與縮合劑；制得二氧化硅/量子點(diǎn)復(fù)合微球探針，用稀 釋液復(fù)溶，放入冰箱4°c條件下保存?zhèn)溆茫?4)將劃有二抗與包被抗原或相應(yīng)抗體的硝酸纖維素膜、吸水墊、噴有量子點(diǎn)微球 探針的玻璃纖維素膜、玻纖膜或聚酯膜樣品墊組裝在背板上，組建免疫層析試紙條體系；(5)對(duì)于檢測(cè)靈敏度要求高的檢測(cè)物，增加量子點(diǎn)微球探針與樣品的孵育步驟，增 加反應(yīng)時(shí)間移取量子點(diǎn)微球探針于可拆卸96孔板小孔中，冷凍干燥或低溫真空干燥后密 閉保存，在檢測(cè)時(shí)滴加樣品處理液于小孔中進(jìn)行復(fù)溶，靜置反應(yīng)2-10分鐘；吸取；加入沒(méi)有 結(jié)合墊的免疫層析試紙條中檢測(cè)；(6)可半定量與定量檢測(cè)A、半定量檢測(cè)滴加樣品后于紫外燈下觀測(cè)條帶顯色情況；B、定量檢測(cè)制作具有激發(fā)光源、信號(hào)采集、光信號(hào)數(shù)字轉(zhuǎn)換部件與軟件的定量檢 測(cè)平臺(tái)。步驟(1)制備氨基化二氧化硅納米粒子A與C兩個(gè)步驟結(jié)合的方法也可另選用一 步法二氧化硅納米粒子在反相微乳液中制備結(jié)束以后，直接在體系中加入氨基化硅烷 偶聯(lián)劑氨基化修飾。步驟(2)所述縮合劑為1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺、N-羥基琥珀酰 亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺的一種或幾種混合。步驟(3)所述量子點(diǎn)是水溶性表面具有羧基的量子點(diǎn)或核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的一種； 可以直接在水相中合成，或者油相合成后進(jìn)行水相改性。
步驟(3)所述稀釋液為含牛血清白蛋白、蔗糖、疊氮鈉、聚乙二醇20000、吐溫-20 等物質(zhì)的緩沖溶液。量子點(diǎn)微球探針可噴在玻璃纖維素膜上作為結(jié)合墊組裝在試劑條上；直接移取一 定量探針于96孔板小孔中，干燥密封保存，檢測(cè)時(shí)用樣品或樣品處理液復(fù)溶并孵育。超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法檢測(cè)物質(zhì)為大分子物質(zhì)時(shí)，采 用雙抗體夾心法等，檢測(cè)線的組成物為檢測(cè)物的另一抗體；檢測(cè)物質(zhì)為小分子物質(zhì)時(shí)，采用 競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)線的組成物為檢測(cè)物的包被抗原。免疫層析試紙條檢測(cè)線為1條_3條；多殘留檢測(cè)，每種殘留物對(duì)應(yīng)抗體分別用不 同熒光顏色的量子點(diǎn)微球進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明的要點(diǎn)是應(yīng)用氨基化二氧化硅納米粒子為核心，先用少量偶聯(lián)劑偶聯(lián)將 抗體共價(jià)連接于其上，然后在離心純化以后，將大量羧基化量子點(diǎn)共價(jià)偶聯(lián)于氨基化二氧 化硅納米粒子表面以及已與二氧化硅納米粒子結(jié)合的抗體之上，在一個(gè)微球上附著有大量 的量子點(diǎn)，極大的提高了量子點(diǎn)微球探針的熒光強(qiáng)度，從而極大的提高了免疫層析的靈敏 度。此外，為了得到靈敏度更高的產(chǎn)品，改進(jìn)了免疫層析方法，靈敏度得到進(jìn)一步的提升。本 發(fā)明可用于疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢測(cè)、違禁藥品檢測(cè)、食品安全分析等方面的單殘留 或多殘留快速、高靈敏度半定量檢測(cè)，配備一些其他設(shè)備還可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。具體檢測(cè)方法包括以下幾個(gè)步驟(1)在表面活性劑，油相，水相，助劑組成的反相微乳液體系中，用氨水水解正硅酸 乙酯(TEOS)制備二氧化硅納米粒子，此二氧化硅納米粒子粒徑為10-200nm。制備更大粒 徑的均一二氧化硅納米粒子可用s tSber發(fā)明的s tsber法，在乙醇/水溶液中用氨水催化 TEOS得到200-1000nm的二氧化硅納米粒子。(2)然后將二氧化硅納米粒子用硅烷偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、 3-(2_氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(AEAPS)，或結(jié)合3-(三羥基硅基)丙甲基磷酸酯 (THPMP)進(jìn)行氨基化改性。(3)將氨基化二氧化硅納米粒子與適量抗體在少量縮合劑1-乙基_ (3- 二甲基氨 基丙基)碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺的一種或幾種混合使用的 作用下，37°C下孵育l-10h，使氨基化二氧化硅納米粒子與抗體結(jié)合，高速離心1-4次除去 未結(jié)合抗體與縮合劑。(4)將離心后的沉淀物復(fù)溶，再加入較多量的縮合劑以及油相改性或水相直接合 成的羧基化水溶性量子點(diǎn)，繼續(xù)37°C下孵育l-10h，然后高速離心除去游離的量子點(diǎn)與縮 合劑等雜質(zhì)。然后，將二氧化硅/量子點(diǎn)復(fù)合微球探針用含有BSA、蔗糖、疊氮鈉、聚乙二醇 20000、吐溫-20等物質(zhì)的緩沖溶液復(fù)溶后4°C冰箱保存待用。(5)當(dāng)檢測(cè)物質(zhì)為蛋白、病毒、致病菌等大分子物質(zhì)時(shí)，可采用雙抗體夾心法，NC 膜上的檢測(cè)線組成為檢測(cè)物的另一抗體，檢測(cè)線有線則樣品為陽(yáng)性，反之則為陰性；如果檢 測(cè)物質(zhì)為毒品、抗生素、農(nóng)藥殘留等小分子物質(zhì)時(shí)，采用競(jìng)爭(zhēng)法，NC膜上的檢測(cè)線組成為檢 測(cè)物的包被抗原，檢測(cè)線無(wú)線則樣品為陽(yáng)性，反之則為陰性。不論哪種方法，只要質(zhì)控線無(wú) 色檢測(cè)結(jié)果均無(wú)效。(6)可用兩種方法組建免疫層析體系一，將劃有二抗質(zhì)控線與包被抗原或抗 體、檢測(cè)線的NC膜、吸水墊、噴有量子點(diǎn)微球探針的玻璃纖維素膜，以及玻纖膜或聚酯膜樣品墊組裝在特制背板上，構(gòu)成免疫層析體系，如圖3所示。檢測(cè)時(shí)只需在樣品墊上直接 滴加尿液、唾液、牛奶等單一樣品；或者滴加肉類、谷類、果蔬等復(fù)雜樣品的處理液后，層析 5-15min觀察結(jié)果。二，將劃有二抗質(zhì)控線與包被抗原、抗體、檢測(cè)線的NC膜、吸水墊、以及 玻纖膜或聚酯膜樣品墊組裝在特制背板上，組裝試劑條體系，如圖4所示。使用時(shí)，吸取一 定量的量子點(diǎn)探針于可拆卸96孔板的小孔中，冷凍干燥或低溫真空干燥，密封保存。檢測(cè) 時(shí)，移取一定量簡(jiǎn)單樣品或者復(fù)雜樣品處理液于小孔中，使得干燥物溶解并混合，靜置反應(yīng) 2-10min后，吸取一定量滴于試紙條樣品墊上，層析5-15min觀察檢測(cè)結(jié)果。后一種方法比 前一種方法靈敏度提高2-10倍。(7)本檢測(cè)體系除了單殘留檢測(cè)以外，還可進(jìn)行多殘留檢測(cè)。當(dāng)進(jìn)行多殘留檢測(cè) 時(shí)，不同顏色的量子點(diǎn)復(fù)合微球分別標(biāo)記不同的抗體，NC膜上除了以二抗作為質(zhì)控線外， 相應(yīng)每種檢測(cè)物的包被抗原或檢測(cè)物抗體分別作為各自的檢測(cè)線。同樣，可以選擇兩種方 法其一，將各自的量子點(diǎn)微球探針取合適的量分別噴于玻璃纖維素膜上作為結(jié)合墊，并列 固定在NC膜與樣品墊之間；或者選擇靈敏度更高的方法二，組裝成無(wú)結(jié)合墊試紙條層析系 統(tǒng)，分別吸取一定量的熒光微球探針加于不同96孔板小孔中，真空或冷凍干燥之后封閉保 存，當(dāng)檢測(cè)時(shí)加入一定量樣品或樣品處理液復(fù)溶干燥物，并將所有干燥物與定量樣品或樣 品處理液混合，靜置2-lOmin以后，吸取一定量液體滴于樣品墊上進(jìn)行檢測(cè)。如果體系為檢 測(cè)大分子物質(zhì)的雙抗體夾心法，檢測(cè)線都出線，則殘留物都為陽(yáng)性；如果都不出線，則殘留 物均為陰性；一條檢測(cè)線出線一條檢測(cè)線不出線，則出線者為陽(yáng)性，不出線者為陰性。如果 體系為檢測(cè)小分子物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)法，結(jié)果恰好相反。不管哪種方法，如質(zhì)控線不出線則檢測(cè)結(jié) 果一律無(wú)效。(8)此檢測(cè)試紙條除了可半定量檢測(cè)以外，還可以增加一些其他相應(yīng)設(shè)備進(jìn)行定 量檢測(cè)。簡(jiǎn)單配合暗箱式紫外燈、照相機(jī)(或攝像頭)、以及Photoshop (美國(guó)Adobe公司) 與Scion Image (美國(guó)Scion公司)軟件進(jìn)行分析，就可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。如果想實(shí)現(xiàn)更高精 度，更自動(dòng)化的定量檢測(cè)，還可以紫外LED為激發(fā)光源，CMOS傳感器為信號(hào)采集部件，以及 光信號(hào)與數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)換軟件的專業(yè)檢測(cè)體系。本發(fā)明以粒徑較大的氨基化二氧化硅納米粒子為核心，依次偶聯(lián)少量的抗體與大 量的羧基化量子點(diǎn)，形成粒徑較大且表面共價(jià)結(jié)合大量量子點(diǎn)的高強(qiáng)度熒光微球探針，以 此微球?yàn)樘结橀_(kāi)發(fā)出的免疫層析試紙條產(chǎn)品與膠體金免疫層析以及單量子點(diǎn)作為探針的 免疫層析方法相比靈敏度大大提升。借助簡(jiǎn)單儀器與軟件還可進(jìn)行定量檢測(cè)，如果需要更 精密高效的定量檢測(cè)結(jié)果還可開(kāi)發(fā)相關(guān)配套產(chǎn)品。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于傳染性疾病檢測(cè)、腫瘤早期診斷等疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品 檢測(cè)、違禁藥品測(cè)試、食品中農(nóng)藥殘留、致病菌安全分析等方面的單殘留或多殘留高靈敏度 快速半定量檢測(cè)，配合其他設(shè)施可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、直觀。2、檢測(cè)結(jié)果靈敏度高。3、免疫層析試紙條價(jià)格低廉。4、既可做半定量檢測(cè)，又可做定量檢測(cè)。5、可廣泛應(yīng)用于傳染性疾病檢測(cè)、腫瘤早期診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、毒品檢測(cè)、違禁藥品測(cè)試、食品中農(nóng)藥殘留、致病菌安全分析等領(lǐng)域。


圖1為單個(gè)量子點(diǎn)探針與二氧化硅/量子點(diǎn)微球探針靈敏度比較圖。圖2為二氧化硅/量子點(diǎn)熒光微球探針制備圖。圖3為方法一組建的量子點(diǎn)微球免疫層析示意圖。圖4為方法二組建的更為靈敏的量子點(diǎn)微球免疫層析示意圖。圖5為量子點(diǎn)微球免疫層析多殘留檢測(cè)示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一氨基化二氧化硅的制備分別稱取8. 85ml Triton X_100、37. 5ml環(huán)己烷、9ml正 己醇和適量水組成反相微乳液體系，在磁力攪拌下分別加入0. 5ml TE0S，0. 3ml氨水，反應(yīng) 24h之后，加入0. Iml APTES與0. 05ml THPMP繼續(xù)反應(yīng)12h，丙酮破乳，高速離心純化后干 燥。經(jīng)過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡表征，粒徑為115nm。水相合成CdTe量子點(diǎn)在氮?dú)怙柡偷?44mL濃度為2 X l(T2mol/LCdCl2 ·2. 5Η20溶 液(114. 2mg)中加入104. 4uL巰基丙酸，用lmol/LNaOH調(diào)溶液的pH在9. 2左右。注入新 鮮制備的NaHTe。劇烈攪拌下用N2脫氧20min，然后迅速加入上述新制備的碲氫化鈉溶液 注入反應(yīng)體系，最終使得Cd2+ Te2" MPA為1 0.5 2. 4，100°C下氮?dú)獗Ｗo(hù)回流不同 時(shí)間得到綠色、黃色、紅色的碲化鎘量子點(diǎn)。量子點(diǎn)熒光微球探針的制備稱取0.02g氨基化二氧化硅納米粒子，用IOml 0. 01mol/L PBS (pH = 7. 4)溶液溶解，用 0. 12ml EDC 與 0. 15ml NHS 活化 lOmin，然后加入 150ml抗鏈霉素單克隆抗體，37°C下?lián)u床振蕩2h，高速離心未結(jié)合的抗體以及其他雜質(zhì)。隨 后將沉淀物復(fù)溶，加入Iml EDC與1. 3ml NHS,同樣活化lOmin，然后加入3ml CdTe量子點(diǎn)， 繼續(xù)37°C下?lián)u床振蕩2h。然后14000r/min高速離心除去游離的CdTe量子點(diǎn)以及雜質(zhì)。將 沉淀物用含有BSA、蔗糖、PEG20000、吐溫_80、疊氮鈉等物質(zhì)的PBS (pH = 8. 0)復(fù)溶，4°C冰 箱保存。在特制背板上，依次貼上用劃膜儀劃有羊抗鼠質(zhì)控線，鏈霉素-OVA檢測(cè)線的NC 膜、吸水墊、噴有抗鏈霉素單克隆抗體的結(jié)合墊、樣品墊，然后用切條機(jī)切成4mm寬小條。經(jīng) 過(guò)系列調(diào)試，最終檢測(cè)限可達(dá)到0. 3ng/ml。為了得到更高靈敏度，本實(shí)施例對(duì)傳統(tǒng)的免疫層析方法做了一些修改，在特制背 板上，依次貼上用劃膜儀劃有羊抗鼠質(zhì)控線，鏈霉素-OVA檢測(cè)線的NC膜、吸水墊、樣品墊； 量子點(diǎn)微球探針不直接噴于結(jié)合墊上，而是吸取一定量于可拆卸96孔板的小孔中，冷凍干 燥后密封保存，當(dāng)檢測(cè)時(shí)吸取一定量樣品加入小孔中溶解干燥物，并靜置5min，然后吸取一 定量滴加與層析試紙條的樣品墊處，檢測(cè)限可達(dá)0. lng/ml。實(shí)施例二 氨基化二氧化硅的制備在乙醇/水混合體系中，加入2ml正硅酸乙酯與2ml氨 水，磁力攪拌12h，得到二氧化硅納米粒子，高速離心除去雜質(zhì)，在以甲苯溶液中，加入ImlAPTES，90°C下，回流12h，得到氨基化二氧化硅納米粒子，粒徑為231nm。合成CdTe/ZnSe量子點(diǎn)在高溫有機(jī)相中合成油溶性CdTe/CdSe核殼型量子點(diǎn)，然 后用MPA進(jìn)行配體交換，將油溶性量子點(diǎn)轉(zhuǎn)移至水相。得到羧基包覆的水溶性CdTe/CdSe 量子點(diǎn)。按照實(shí)施例一中的方法制備得到綠色抗青霉素單克隆抗體二氧化硅/量子點(diǎn)微 球探針和紅色的抗氯霉素單克隆抗體二氧化硅/量子點(diǎn)微球探針。分別噴于結(jié)合墊上，將 兩個(gè)結(jié)合墊并列排布在NC膜與樣品墊之間。NC膜上，靠近吸水墊處為羊抗小鼠二抗組成的 質(zhì)控線，然后依次為青霉素OVA與氯霉素-OVA組成的兩條檢測(cè)線。將試紙條組裝好以后， 用切條機(jī)切成4mm寬小條，組裝外殼連同小片干燥劑封閉包裝。檢測(cè)時(shí)，質(zhì)控線不論樣品為陰性或陽(yáng)性，質(zhì)控線均顯色為黃色，否則檢測(cè)無(wú)效。當(dāng) 檢測(cè)線分別出現(xiàn)紅色與綠色，則均為陰性，如果均不出線，則都為陽(yáng)性。如果出現(xiàn)綠色線而 紅色線未出，則青霉素為陰性而氯霉素為陽(yáng)性，反之，則青霉素為陽(yáng)性而氯霉素為陰性。實(shí)施例三氨基化二氧化硅納米粒子與水溶性量子點(diǎn)的制備同實(shí)施例一。按照實(shí)施例一的方法，制備偶聯(lián)有抗甲胎蛋白單克隆抗體的二氧化硅/紅色量子 點(diǎn)微球探針。在特制背板上，依次貼上NC膜(用劃膜儀劃有羊抗鼠質(zhì)控線，抗甲胎蛋白多克隆 抗體檢測(cè)線)、吸水墊、噴有抗甲胎蛋白單克隆抗體的二氧化硅/紅色量子點(diǎn)微球探針的結(jié) 合墊、樣品墊，然后用切條機(jī)切成4mm寬小條。半定量檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)檢測(cè)線出現(xiàn)紅色線條為陽(yáng)性，否則為陰性，如果質(zhì)控線不顯紅 色，則檢測(cè)無(wú)效。定量檢測(cè)時(shí)，配置一系列甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、 40ng/ml、60ng/ml，然后分別滴加到層析系統(tǒng)中，15分鐘后于反射式紫外暗箱中用奧林巴斯 相機(jī)拍照，然后將照片導(dǎo)入電腦中，用photoshop軟件處理為灰度，然后用Scion Image軟 件將條帶轉(zhuǎn)換為峰值信號(hào)，分別將各峰面積對(duì)應(yīng)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到峰面積與濃度對(duì)應(yīng) 公式，將檢測(cè)樣品同樣處理，可得到峰面積，根據(jù)公式可以得知樣品中甲胎蛋白含量。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、改進(jìn) 等，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)制備氨基化二氧化硅納米粒子A、由表面活性劑、油相、水相、助劑配制反相微乳液體系；在氨水為催化劑的情況下水解正硅酸乙酯制備小粒徑二氧化硅納米粒子；B、大粒徑的二氧化硅納米粒子可用法在乙醇/水溶液中用氨水催化TEOS合成；C、將二氧化硅納米粒子用硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行氨基化改性；得氨基化二氧化硅納米粒子；(2)將氨基化二氧化硅納米粒子與抗體在縮合劑的作用下37℃孵育1 10h，高速離心1 4次除去未結(jié)合抗體與縮合劑；(3)將離心后的沉淀物復(fù)溶，加入縮合劑及羧基化水溶性量子點(diǎn)，37℃下孵育1 10h，高速離心除去游離的量子點(diǎn)與縮合劑；制得二氧化硅/量子點(diǎn)復(fù)合微球探針，用稀釋液復(fù)溶，放入冰箱4℃條件下保存?zhèn)溆茫?4)將劃有二抗與包被抗原的硝酸纖維素膜、吸水墊、噴有量子點(diǎn)微球探針的玻璃纖維素膜、玻纖膜或聚酯膜樣品墊組裝在背板上，組建免疫層析試紙條體系；(5)對(duì)于檢測(cè)靈敏度要求高的檢測(cè)物，增加量子點(diǎn)微球探針與樣品的孵育步驟，增加反應(yīng)時(shí)間移取量子點(diǎn)微球探針于96孔板小孔中，冷凍干燥或低溫真空干燥后密閉保存，在檢測(cè)時(shí)滴加樣品處理液于小孔中進(jìn)行復(fù)溶，靜置反應(yīng)2 10分鐘；吸??；加入沒(méi)有結(jié)合墊的免疫層析試紙條中檢測(cè)；(6)半定量與定量檢測(cè)A、半定量檢測(cè)滴加樣品后于紫外燈下觀測(cè)條帶顯色情況；B、定量檢測(cè)制作具有激發(fā)光源、信號(hào)采集、光信號(hào)數(shù)字轉(zhuǎn)換部件與軟件的定量檢測(cè)平臺(tái)。FSA00000166477000011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(1)制備氨基化二氧化硅納米粒子A與C兩個(gè)步驟結(jié)合的方法也可另選用一步法二氧化硅納米粒子在反相微乳液中制備結(jié)束以后，直接在體系中加入氨基化硅烷偶聯(lián) 劑氨基化修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(2)所述縮合劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、 N-羥基硫代琥珀酰亞胺的一種或幾種混合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(3)所述量子點(diǎn)是水溶性表面具有羧基的量子點(diǎn)或核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的一種；可以 直接在水相中合成，或者油相合成后進(jìn)行水相改性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在 于步驟(3)所述稀釋液為含牛血清白蛋白、蔗糖、疊氮鈉、聚乙二醇20000、吐溫-20等物 質(zhì)的緩沖溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在 于量子點(diǎn)微球探針可噴在玻璃纖維素膜上作為結(jié)合墊組裝在試劑條上；也可直接移取一 定量探針于可拆卸96孔板單個(gè)孔中，干燥密封保存，檢測(cè)時(shí)用樣品或樣品處理液復(fù)溶并孵育。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在于A、檢測(cè)物質(zhì)為大分子物質(zhì)時(shí)，采用雙抗體夾心法，檢測(cè)線的組成物為檢測(cè)物的另一抗體；B、檢測(cè)物質(zhì)為小分子物質(zhì)時(shí)，采用競(jìng)爭(zhēng)法，檢測(cè)線的組成物為檢測(cè)物的包被抗原。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法，其特征在 于免疫層析試紙條檢測(cè)線為1條_3條；多殘留檢測(cè)，每種殘留物對(duì)應(yīng)抗體分別用不同熒 光顏色的量子點(diǎn)微球進(jìn)行標(biāo)記。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)方法，一種超靈敏量子點(diǎn)微球免疫層析試紙條快速檢測(cè)方法?，F(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是由于樣品檢測(cè)限度要求高；樣品成分復(fù)雜，前處理難度大；檢測(cè)靈敏度無(wú)法滿足人們的要求。本發(fā)明方法為制備二氧化硅納米粒子；將氨基化二氧化硅納米粒子與抗體在縮合劑的作用下37℃孵育1-10h，高速離心1-4次除去未結(jié)合抗體與縮合劑；將離心后的沉淀物復(fù)溶，加入縮合劑及羧基化水溶性量子點(diǎn)，高速離心除去游離的量子點(diǎn)與縮合劑；制得二氧化硅/量子點(diǎn)復(fù)合微球探針；組建免疫層析試紙條體系。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、直觀；靈敏度高；價(jià)格低廉；可做半定量檢測(cè)、定量檢測(cè)；應(yīng)用廣泛。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101893623SQ201010206479
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者王元鳳, 白亞龍, 魏新林 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)