專(zhuān)利名稱(chēng)：Hepcidin作為鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑的用途的制作方法
HEPCIDIN作為鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑的用途本發(fā)明涉及鐵穩(wěn)態(tài)(iron homeostasis)疾病的診斷和治療。鐵是幾乎每個(gè)有機(jī)體生長(zhǎng)和生存所需的必需元素。在哺乳動(dòng)物中，對(duì)鐵平衡的調(diào) 節(jié)主要是在十二指腸對(duì)膳食中的鐵吸收的水平。吸收后，三價(jià)鐵被結(jié)合于循環(huán)中的轉(zhuǎn)鐵蛋 白并被轉(zhuǎn)運(yùn)到組織中，包括紅系前體細(xì)胞，其中它被轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用所攝取。 網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬細(xì)胞在從衰老紅細(xì)胞的血紅蛋白的降解再利用鐵中起著主要作用，而肝細(xì)胞 含有有機(jī)體大多數(shù)的以鐵蛋白聚合物形式的鐵儲(chǔ)存。在過(guò)去的五年里，從對(duì)造成嚴(yán)重鐵障 礙的人類(lèi)和小鼠的遺傳性缺陷的研究中獲得了關(guān)于參與鐵吸收和鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的蛋白的重 要信息(綜述見(jiàn)ANDREWS，Nat. Rev. Genet.，1，208-217，2000)。對(duì)于鐵缺乏，可以很好地 理解已確認(rèn)的基因缺陷的病理生理結(jié)果，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ斐闪酥苯訁⑴c鐵吸收途徑的蛋白 功能的缺失。這些蛋白包括鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMTl (也稱(chēng)為Nramp2或DCT1) (FLEMING等，Nat. Genet. ,16,383-386,1997 ；GUNSHIN 等，Nature,388,482-488,1997), ferroportin(也稱(chēng) 為 IREGl 或 MTP1) (DONOVAN 等，Nature，403，776-781，2000)以及結(jié)合于 ferroportin 的銅 氧化酶，即銅藍(lán)蛋白(HARRIS, Proc. Natl. Acad. Sci. USA，96，10812-10817，1999 ；Y0SHIDA 等，Nat. Genet.，9，267-272，1995)以及ha印hastin(VULPE等，Nat. Genet.，21，195-199， 1999)。相反，雖然一些與遺傳性鐵負(fù)荷過(guò)量相關(guān)的疾病已經(jīng)鑒定出各種蛋白，但對(duì)于 它們?cè)诳刂畦F穩(wěn)態(tài)上的功能作用仍了解的很少。在人類(lèi)，遺傳性血色病(hereditary hemochromatosis, HH)是一種常見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病，它是因?yàn)閷?duì)膳食中的鐵的過(guò)量 吸收而引起，造成了鐵在血漿和多個(gè)器官的負(fù)荷過(guò)量，包括特別是胰腺、肝臟和皮膚，并因 為鐵的沉積造成了對(duì)這些器官和組織的損傷。血色病的原因通常是HLA連鎖的血色病基因(稱(chēng)為HFE)的突變，該基因定位于染 色體6p，且大多數(shù)患者是HFE的C282Y突變的純合子(FEDER等，Nat. Genet.，13，399-408， 1996)。另外，不同的HH家系中也含有其他的突變位點(diǎn)在兩個(gè)HH非HLA連鎖的家系中已 經(jīng)報(bào)告了 7p上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2基因(TFR3)的無(wú)義突變(CAMASCHELLA等，Nat. Genet.， 25，14-15，2000)以及最近將幼年性血色病的位點(diǎn)定位于染色體臂lq(HFE2)。最后，盡管已 經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間知道鐵吸收的調(diào)節(jié)是反應(yīng)于體內(nèi)鐵儲(chǔ)備水平和紅細(xì)胞生成所需要的鐵量(R0Y 等，F(xiàn)EBS Lett.，484，271-274，2000)，但是仍然需要繼續(xù)確定調(diào)控腸細(xì)胞調(diào)節(jié)鐵吸收的信 號(hào)的分子本質(zhì)。最近已經(jīng)報(bào)告了小鼠編碼轉(zhuǎn)錄因子USF2的基因斷裂以及它對(duì)肝葡萄糖依賴(lài)的基 因調(diào)控的影響(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)。本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)驚奇地觀察到，Usf2-/-miCe出現(xiàn)了多內(nèi)臟的鐵負(fù)荷過(guò)量，在基 因敲除動(dòng)物中只有脾臟的鐵含量顯著地低于對(duì)照組。這些鐵代謝異常類(lèi)似于在遺傳性血色 病中所觀察到的。然而，在這些病理變化中沒(méi)有先前已鑒定的基因改變的參與，例如已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)的HFE或TFR2。因此，本發(fā)明人將來(lái)自Usf2-/_小鼠和野生型小鼠的肝臟進(jìn)行抑制減數(shù) 雜交以尋找新的候選基因，這些基因可以解釋在Usf2-/_小鼠中所發(fā)現(xiàn)的鐵穩(wěn)態(tài)異常。它 允許進(jìn)行編碼h印cidin肽的cDNA的分離。
最近從人血的超濾液和從尿中純化到!fepCidin(也被稱(chēng)為L(zhǎng)EAP-1，即肝表達(dá) 的抗微生物肽)，發(fā)現(xiàn)它是一種有著抗微生物活性的二硫鍵合的肽(disulfide-bonded peptide) (KRAUSE 等，F(xiàn)EBS Lett. ,480,147-150,2000 ；PARK 等，J. Biol. Chem.，276， 7806-7810,2001)。該蛋白在肝臟內(nèi)以前肽(prop印tide)形式被合成，該前肽包括83個(gè) 氨基酸并被轉(zhuǎn)化為有著20，22或25個(gè)氨基酸的成熟肽((PARK等，J. Biol. Chem.，276， 7806-7810，2001 ；PIGEON 等，J. Biol. Chem.，276，7811-7819，2001)。最近報(bào)道 hepcidin 在 試驗(yàn)性或自發(fā)性鐵負(fù)荷過(guò)量小鼠的肝臟內(nèi)被高水平合成(PIGEON等，J. Biol. Chem.，276， 7811-7819,2001)。盡管這種過(guò)度表達(dá)和鐵負(fù)荷過(guò)量的關(guān)系仍有疑問(wèn)，但是它提示這可能是 慢性鐵負(fù)荷過(guò)量相關(guān)炎癥的結(jié)果。相反，本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在Usf2-/_小鼠中h印cidin表達(dá)的完全缺乏導(dǎo)致了 進(jìn)行性組織鐵負(fù)荷過(guò)量。進(jìn)一步的，他們已經(jīng)獲得了有著轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因在 組合的肝特異性啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)h印cidin，并發(fā)現(xiàn)上述的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是嚴(yán)重貧血的。這些發(fā)現(xiàn)允許計(jì)劃鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控的新方法，特別是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道對(duì)膳食中的鐵的攝 取，或調(diào)節(jié)經(jīng)胎盤(pán)屏障的母胎鐵轉(zhuǎn)運(yùn)，以及調(diào)節(jié)網(wǎng)狀內(nèi)皮巨噬細(xì)胞的鐵的再循環(huán)。因此，本發(fā)明建議使用一種多肽，它包括20個(gè)氨基酸序列，并在2，5，6，8，9，14，17 和18位點(diǎn)有半胱氨酸，以及和以下序列有著至少50%相同性或60%相似性，優(yōu)選的至少 60%相同性或至少70%相似性lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No.1)或使用一種編碼上述多肽的核酸，以制備用于減少鐵負(fù)荷過(guò)量的藥物。根據(jù)本發(fā)明，使用的優(yōu)選的多肽或核酸是人類(lèi)hepcidin的成熟形式，例如有著 SEQ ID No. 1的20個(gè)氨基酸多肽，或有著以下序列的22個(gè)氨基酸多肽Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No.2)或者是有著以下序列的25個(gè)氨基酸多肽Asp Thr His Phe Pro lie Cys lie Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr(SEQ ID No. 3)或編碼上述多肽的核酸。也可以使用上述h印cidin成熟形式的前體，也就是proh印cidin和 preprohepcidin及編碼上述前體的核酸。根據(jù)本發(fā)明，其他適合使用的多肽或核酸的實(shí)例 是脊椎動(dòng)物的，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物的、人類(lèi)hepcidin成熟形式的同源物或它們的前體物、 或編碼上述多肽的核酸。已知脊椎動(dòng)物的人類(lèi)h印cidin成熟形式的同源物，包括例如大鼠 hepcidin、小鼠 hepcidin，魚(yú)尊 hepcidin。也可以使用包括h印cidin成熟形式的序列的嵌合多肽，以及最終，所有的所述 pro-或所述pr印ro-序列的部分。本發(fā)明也包括使用上述多肽的功能等價(jià)物。這里的功能等價(jià)物定義為肽異構(gòu)體， 或其他有著與hepcidin成熟形式相同的功能活性的化合物。這些功能等價(jià)物的實(shí)施例包 括被塑造成模仿任何一種有著SEQ IDNo. 1,SEQ ID No. 2，或SEQ ID No. 3的多肽的三維結(jié) 構(gòu)的化合物。特別注意到上述多肽的衍生物有著穩(wěn)定性和生物半衰期的改善。這些衍生物的經(jīng)典實(shí)例是例如“retro-inverso”肽，其中氨基酸序列是反向的，以及用D-氨基酸取代 L-氨基酸。所有的這些多肽和核酸都可以通過(guò)已知的經(jīng)典方法獲得。例如，可以從血漿或從 尿液中獲得20個(gè)氨基酸和25個(gè)氨基酸形式的h印cidin，如KRAUSE等或PARK等所描述的。 同樣的，可以通過(guò)培養(yǎng)表達(dá)h印cidin的細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集上述多肽來(lái)獲得。根據(jù)特別的實(shí)施方案，上述細(xì)胞是用編碼上述的任何一種多肽的核酸轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞。也可以使用化學(xué)合成，特別是對(duì)肽衍生物。例如可以利用能與編碼hepcidin的核酸選擇性雜交的合適引物從脊椎動(dòng)物的基 因組或cDNA庫(kù)中獲得上述的核酸。也可以通過(guò)多核苷酸合成的經(jīng)典技術(shù)獲得核酸。本發(fā)明也提供了篩選能減少鐵吸收的h印cidin的功能等價(jià)物的方法。例如，利用動(dòng)物很容易篩選出有著hepcidin調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)功能的功能等 價(jià)物，特別是非人類(lèi)的缺失hepcidin的哺乳動(dòng)物，例如有著hepcidin表達(dá)缺失造成鐵負(fù)荷 過(guò)量的基因敲除小鼠。具體而言，一種篩選能減少鐵吸收的h印cidin的功能等價(jià)物的方法包括以下步 驟-將化合物施用于缺失hepcidin表達(dá)的基因敲除動(dòng)物以測(cè)定其減少鐵吸收的能 力；-確定上述化合物對(duì)上述動(dòng)物的鐵負(fù)荷過(guò)量的作用。根據(jù)本發(fā)明獲得的藥物可以有效地預(yù)防和/或治療-所有形式的血色?。?繼發(fā)性鐵負(fù)荷過(guò)量，繼發(fā)于例如遺傳性和/或先天性貧血如地中海貧血；以及與此相關(guān)的疾病。后者的疾病包括例如肝癌、心肌病或糖尿病。根據(jù)另一方面，本發(fā)明也提供了 h印cidin表達(dá)或h印cidin活性的抑制劑在制備 用于通過(guò)增加腸道對(duì)膳食中的鐵的攝取和/或增加巨噬細(xì)胞對(duì)鐵的再利用來(lái)增加鐵吸收 的藥物中的用途。上述藥物能用于治療貧血或貧血相關(guān)疾病。這些疾病特別包括與在例如 感染或炎癥狀態(tài)下發(fā)生的急性或慢性疾病相關(guān)貧血，例如骨關(guān)節(jié)病如類(lèi)風(fēng)濕多關(guān)節(jié)炎或惡 性腫瘤，特別是與炎性綜合征相關(guān)時(shí)。Hepcidin表達(dá)的抑制劑包括例如反義RNA或DNA分子、或核酶。Hepcidin活性的抑制劑包括例如抗h印cidin抗體，特別是直接對(duì)抗h印cidin成 熟形式的抗體。本發(fā)明也提供了篩選其他的hepcidin活性抑制劑的方法，例如用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特 別是轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，例如有著表達(dá)h印cidin轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，且上述表達(dá)在 上述動(dòng)物中誘導(dǎo)貧血。例如，一種篩選能增加鐵吸收的hepcidin活性抑制劑的方法包括以下步驟-將化合物施用于具有表達(dá)h印cidin的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以測(cè)定其通過(guò)抑制 hepcidin活性增加鐵吸收的能力；-確定上述化合物對(duì)上述動(dòng)物的貧血的作用。根據(jù)本發(fā)明獲得的藥物可以通過(guò)各種途徑給藥，這依賴(lài)于它們的特性。
例如，h印cidin多肽或它們的功能等價(jià)物，以及h印cidin抑制劑如抗h印cidin抗 體可以單獨(dú)或與合適的載體或賦形劑混合后給藥。它們可以全身或局部使用。優(yōu)選的給藥 途徑是腸外途徑，包括例如肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)注射。也可以使用口服途徑，條件是該藥物是以適合口服給藥的形式存在，能避免胃腸 的酶類(lèi)以保護(hù)活性成分。如上所述，也可以使用核酸分子例如編碼上述任一 h印cidin多肽的核酸，使得能 在治療對(duì)象的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)上述多肽，或使用能轉(zhuǎn)錄為反義RNA的核酸以抑制治療對(duì)象細(xì)胞 內(nèi)h印cidin的表達(dá)。在這種情況下，通過(guò)經(jīng)典的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將上述核酸分子引入目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。典型地，上述核酸分子被放置在合適的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。啟動(dòng)子的選擇依 賴(lài)于藥物的使用目的和/或目標(biāo)器官或組織。因此可以選擇任何一種組成型或誘導(dǎo)型的和 /或任何一種遍在的或組織特異性的啟動(dòng)子。因此獲得的能直接轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的表達(dá)框可以是裸DNA，或放置于一合適的載體中， 例如病毒載體，如腺病毒載體。轉(zhuǎn)移方法和/或載體的選擇依賴(lài)于目標(biāo)器官或組織，和/或需要的是否是短時(shí)間 的表達(dá)(暫時(shí)表達(dá))或穩(wěn)定表達(dá)?？梢泽w外對(duì)取自治療對(duì)象的細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，然后將上述細(xì)胞重新移植入上述 對(duì)象中，或可以通過(guò)將核酸直接施用到上述對(duì)象內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。本發(fā)明也提供了經(jīng)遺傳學(xué)修飾的非人類(lèi)的動(dòng)物，其中遺傳學(xué)修飾造成h印cidin 表達(dá)的異常。本發(fā)明也包括生物學(xué)材料，例如來(lái)自上述遺傳學(xué)修飾的動(dòng)物的細(xì)胞、組織和器官。這特別包括不表達(dá)h印cidin的基因敲除動(dòng)物，優(yōu)選的基因敲除哺乳動(dòng)物，以及特 別包括小鼠。Ifepcidin的表達(dá)缺失在上述動(dòng)物中誘導(dǎo)了鐵負(fù)荷過(guò)量。但不包括VALLET等 (J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)闡述的已知的敲除小鼠，其中編碼轉(zhuǎn)錄因子USF2 的基因是失活的?？梢酝ㄟ^(guò)完全或部分滅活h印cidin基因以獲得本發(fā)明的基因敲除動(dòng)物，上述滅 活造成hepcidin產(chǎn)物的缺失或其功能的缺失。H印cidin基因的滅活可以靶向-編碼h印cidin的序列，造成上述蛋白產(chǎn)物的缺失，或其功能的缺失，和/或-至少一種控制h印cidin表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，造成h印cidin產(chǎn)物的缺乏，或 h印cidin產(chǎn)量的急劇減少。本發(fā)明的有著hepcidin表達(dá)異常的其他遺傳學(xué)修飾動(dòng)物是有著表達(dá)hepcidin轉(zhuǎn) 基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，以及特別是轉(zhuǎn)基因小鼠。合適的制備轉(zhuǎn)基因或敲除動(dòng)物的方法在本領(lǐng)域是熟知的，例如在H0GAN等編，小 鼠胚胎處理，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)出版社，1994 ;C. PINKERT編，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)，科學(xué)出版 社，1994 ；A. L. JOYNER編，基因打靶實(shí)踐方法，牛津大學(xué)出版社，1995 ；G. M. M0NASTERSKY和 J.M. ROBL編，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物科學(xué)的策略，ASM出版社，1995 ；Lee M. SILVER編，小鼠的遺傳學(xué) 概念和應(yīng)用，牛津大學(xué)出版社，1995。不表達(dá)功能性h印cidin的基因敲除動(dòng)物，以及有著表達(dá)h印cidin的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以被用作為研究鐵穩(wěn)態(tài)機(jī)制的模型。它們可以被同上所述的使用以篩選有著與 hepcidin在鐵吸收上同樣作用的化合物，或篩選能抑制hepcidin對(duì)鐵吸收作用的化合物。本發(fā)明也提供了診斷性方法以確定是否鐵吸收的異常和h印cidin的突變或不正 常的h印cidin的產(chǎn)生相關(guān)。例如本發(fā)明提供了 -一種檢測(cè)不正常的h印cidin的產(chǎn)生是否造成了鐵吸收異常的方法，其中上述方 法包括在取自有著上述異常的對(duì)象的生物學(xué)樣品中確定hepcidin的量；-一種檢測(cè)鐵吸收異常是否與生產(chǎn)功能性h印cidin不正常的突變相關(guān)，其中上述 方法包括在來(lái)自有著上述異常的對(duì)象的核酸樣品中測(cè)定hepcidin基因的突變。適合于測(cè)定h印cidin量的生物學(xué)樣品包括例如血、尿、或羊水樣品、或組織活檢， 特別是肝活檢或胎盤(pán)活檢。適合于測(cè)定生產(chǎn)功能性h印cidin不正常的突變的核酸樣品包括RNA、cDNA或基因 組 DNA。生物學(xué)樣品中的h印cidin的量容易被熟知的方法所測(cè)定，例如，HPLC色譜法、質(zhì) 量分光光度法、或利用抗hepcidin抗體的免疫測(cè)定?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)先前從測(cè)試樣品的DNA樣本中分離得到的上述基因或它的部分基因 的測(cè)序，以及與從無(wú)鐵穩(wěn)態(tài)異常的一個(gè)或幾個(gè)對(duì)象中獲得的相應(yīng)的野生型序列進(jìn)行比較， 很容易測(cè)定h印cidin基因的突變。本發(fā)明將被以下的附加描述進(jìn)一步地闡述，這些描述指的是實(shí)施例，它們闡述了 基因敲除動(dòng)物的h印cidin產(chǎn)生缺失或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的h印cidin過(guò)量生成的作用。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí) 到給定的這些實(shí)施例只是本發(fā)明的闡述的一種方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何的限制。實(shí)施例1 :h印cidin表達(dá)缺失的基因敲除動(dòng)物的特點(diǎn)材料和方法Usf2-/_小鼠的繁殖和基因分型以往已經(jīng)描述了 Usf2 基因的裂解(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949， 1997)。突變的等位基因包括小鼠USF2基因的7號(hào)外顯子的無(wú)啟動(dòng)子IRESiBgeo盒。所有 研究的小鼠有著混合的遺傳學(xué)背景，包括來(lái)自C57BL/6和129/Sv株。用每公斤體重含有 280mg三價(jià)碳酸鐵的標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室小鼠食品(A03，UAR, France)喂養(yǎng)小鼠。在2. 5個(gè)月到 19個(gè)月殺死小鼠。利用單次PCR反應(yīng)進(jìn)行小鼠尾部DNA的基因分型以確定野生型(WT)和 USF2基因敲除等位基因。將基因組DNA(0.5-1 μ g)用于包含有3種引物的50 μ 1反應(yīng)物 中野生型USF2等位基因用以下引物進(jìn)行擴(kuò)增-正向(退火于內(nèi)含子6)GCGAAGCCCTGGGTTCAATC(SEQ ID No. 4)禾口-反向(退火于內(nèi)含子7)GGGGTCCACCACTTCAAGAGG(SEQ ID No. 5)。用以下引物擴(kuò)增基因敲除的USF2基因_ 正向GCGAAGCCCTGGGTTCAATC(SEQ ID No. 6)禾口-反向(退火于目標(biāo)構(gòu)建體的Neo選擇標(biāo)記物)
GAATTCTCTAGAGCGGCCGGAC(SEQ ID No. 7)按照以下進(jìn)行PCR :37個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)包括94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 40 秒)以及最初的變性步驟94°C 4分鐘，和終末的延伸步驟72°C 5分鐘，反應(yīng)體系為20mM Tris-HCKpH 8. 4), 50mM KC1,0. 05% ff-I,2mM MgCl2, 5%甘油，0. 04%溴酚藍(lán)，0. 2mM 各種 dNTP，0. 2μΜ每種引物，2單位Taq多聚酶(Gibco)。在含有溴乙錠的1.5_2.0%瓊脂糖凝 膠上分析反應(yīng)產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)該小鼠基因分型的PCR方法得到了與先前報(bào)道的Southern印跡 法相同的結(jié)果(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)。校正減數(shù)雜交(SSH)生成減數(shù)文庫(kù)如前描述制備總RNA (CH0MCZYNSKI 和 SACCHI，Anal. Biochem.，162，156-159， 1987)。用寡(dT)纖維素(Boehringer Mannheim Biochemica)分離聚腺苷酸 RNA。根據(jù) 生產(chǎn)商對(duì)所有步驟的說(shuō)明利用PCR-select cDNA減數(shù)試劑盒(Clontech)，在3個(gè)5月齡 的純合子USF2缺失小鼠(“驅(qū)動(dòng)物(driver) ”)的混合的肝RNA和1個(gè)5月齡的野生型小 鼠(“測(cè)試物(tester)")的肝RNA之間進(jìn)行SSH。簡(jiǎn)要的，將14ng連接的測(cè)試物和420ng 非連接的驅(qū)動(dòng)物cDNA，變性并重新退火。在減數(shù)雜交后，通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增Ιμ cDNA。利 用AdvanTAgeTM PCR克隆試劑盒(Clontech)將減數(shù)cDNA文庫(kù)克隆于pT-Adv載體。在用 Advantage cDNA多聚酶混合物(Clontech)進(jìn)行第二次PCR(15個(gè)循環(huán))后，將減數(shù)的PCR cDNA混合物在72°C與1單位Taq DNA多聚酶(Gibco BRL)進(jìn)一步孵育10分鐘以使克隆效 率最大化，以及用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化。利用Cell-Porator (Gibco BRL)通過(guò)電穿孔將連接混合物引入到Electromax細(xì)菌株DHlOB (Gibco BRL)中。將文庫(kù)鋪 板于22x 22cm的瓊脂板，其中含有青霉素(100 μ g/ml) ,40 μ 1 X-gal (40mg/ml)及40 μ 1 IPTG(0. 1Μ)。將細(xì)菌在37°C中增長(zhǎng)直到可見(jiàn)菌落，并保存在4°C直到能清楚地分別出藍(lán)/ 白菌株。反向Northern高密度印跡和篩選收集總共400個(gè)菌落，重懸于30 μ 1水中，在100°C加熱10分鐘，然后在冰中放置 5分鐘并離心5分鐘。用3 μ 1清亮的上清液和以下的引物進(jìn)行PCR _ 正向5，-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3，(SEQ ID No. 8)，和-反向5，-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3，(SEQ ID No. 9)。在Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia)上印跡 PCR 產(chǎn)物。用 32P_dCTP-標(biāo)記的 雙鏈 cDNA((RTS RadPrime DNA Labeling System, Gibco)將印跡在 72°C雜交過(guò)夜，如上 所述該雙鏈cDNA用2 μ g來(lái)自野生型或Usf2-/-小鼠肝的多腺苷RNA合成。在68°C用2X SSC/0. 1 % SDS洗滌印跡4次20分鐘，以及用0. 2X SSC/0. 1 % SDS洗滌印跡2次20分鐘。逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR總共20 μ 1的2 μ g總RNA (或減數(shù)文庫(kù)的polyA RNA)，以及0. 25mM每種dNTP， 200ng隨機(jī)六核甘酸引物，20單位RNAsin (Promega)，IOmM DTT和200單位M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Gibco)合成雙鏈cDNA。在加熱循環(huán)器中將RNA在70°C變性10分鐘后，在42°C將反應(yīng)進(jìn) 行1小時(shí)，后將逆轉(zhuǎn)錄酶在96°C滅活6分鐘。在反應(yīng)終末，加入80 μ 1 IOmM Tris-HCl (ρΗ 8. 0)和 0. ImM EDTA (ρΗ 8. 0)。用 5 μ 1 逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)混合物以及 50 μ 1 20mM Tris-HCl (ρΗ8. 4), 50mM KCl, 2mM MgCl2,0. 05% (v/v) W_l，0. 2mM 每種 dNTP，Ipmol 正向和反向特異性引 物(列下)，Ipmol正向和反向?qū)φ盏摩?-actin引物和2單位Taq多聚酶(Gibco)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR條件是25個(gè)循環(huán)，其中包括94°C變性20秒，50°C退火20秒，以及72°C引物延 伸20秒。PCR后，用電泳將擴(kuò)增產(chǎn)物(171bp的HEPCl或HEPC2及250bp的β -actin)在 .5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離。
0093]引物序列如下
0094]*HEPC1
0095]_ 正向
0096]5，-CCTATCTCCATCAACAGATG-3，(SEQ ID No. 10)禾口
0097]-反向
0098]5，-AACAGATACCACACTGGGAA-3，(SEQ ID No. 11)；
0099]*HEPC2
0100]-正向
0101]5，-CCTATCTCCAGCAACAGATG-3，(SEQ ID No. 12)禾口
0102]-反向
0103]5，-AACAGATACCACAGGAGGGT-3，(SEQ ID No. 13)；
0104]* β -actin
0105]_ 正向
0106]5，-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3，(SEQ ID No. 14)and
0107]-反向
0108]5，-TTTGATGTCACGCACGATTT-3，(SEQ ID No. 15).
0109]用于擴(kuò)增DMTl的引物如下
0110]*無(wú)IRE的DMTl異構(gòu)體
0111]_ 正向
0112]5，-TCCTGGACTGTGGACGCT-3，(SEQ ID No. 16)禾口
0113]-反向
0114]5，-GGTGTTCAGAAGATAGAGTTCAGG-3，(SEQ ID No. 17)； * 有 IRE 的 DMTl -正向
5，-TGTTTGATTGCATTGGGTCTG-3，(SEQ ID No. 18)禾口 -反向
5，-CGCTCAGCAGGACTTTCGAG-3，(SEQ ID No. 19)；
0115]
0116]
0117]
0118]
0119]
0120]*14S標(biāo)準(zhǔn)化
-正向
5，-CAGGACCAAGACCCCTGGA-3，(SEQ ID No. 20)和
0123]_ 反向
0124]5，-ATCTTCATCCCAGAGCGA-3，(SEQ ID No. 21) Northern 印跡
用于擴(kuò)增用于檢測(cè)特異性mRNAs的探針的引物是
0121] 0122]
0125]
0126]
9
* 小鼠血色病(HFE) cDNA 的擴(kuò)增(1080bp)-正向:5，-ATGAGCCTATCAGCTGGGCT-3，(SEQ ID No. 22)禾口-反向5，-TCACTCACAGTCTGTTAAGA-3，(SEQ ID No. 23)；*小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR) cDNA的擴(kuò)增(285bp)-正向:5，-GAAATCCCTGTCTGTTATAC-3，(SEQ ID No. 24)禾口_ 反向:5，-GGCAAAGCTGAAAGCATTTC-3，(SEQ ID No. 25)；*小鼠轉(zhuǎn)鐵蛋白2 (TFR2) cDNA的擴(kuò)增(333bp)-正向:5，-TACAGCTCGGAGCGGAACG-3，(SEQ ID No. 26)禾口-反向5，-TTACAATCTCAGGCACCTCC-3，(SEQ ID No. 27)；*小鼠銅藍(lán)蛋白cDNA的擴(kuò)增(350bp)-正向5，-ACTTATTTCAGTTGACACGG-3，(SEQ ID No. 28)禾口-反向5，-GCAGCACATACACATACTGT-3，(SEQ ID No. 29)；*小鼠血色素加氧酶1 (Hmoxl) cDNA的擴(kuò)增(258 bp)-正向:5，-ATGGAGCGTCCACAGCCCG-3，(SEQ ID No. 30)禾口-反向:5，-CCTTCGGTGCAGCTCCTCAG-3，(SEQ ID No. 31)。利用Taq聚合酶和肝總cDNA擴(kuò)增每個(gè)片段，及用瓊脂糖凝膠純化(QIAquick PCR 純化試劑盒，Qiagen)，并將它克隆于TA載體(AdvanTAge克隆試劑盒，Clontech)。根據(jù)方 案選擇重組質(zhì)粒并在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增和純化(QIApr印Spin Minipr印，Qiagen)。用EcoRI降解后，將每種cDNA從載體中純化出來(lái)，并在瓊脂糖凝膠上 跑帶。用于檢測(cè)HEPClmRNA的探針是制備于抑制減數(shù)雜交分離的pT-Adv/HEPCl的EcoRI降 解物。將每種來(lái)源的20微克RNA在含福爾馬林的緩沖液中變性，并在1 %瓊脂糖，2. 2M福 爾馬林凝膠中進(jìn)行電泳。按以往描述的方法(VALLET等，J.Biol. Chem.，272，21944-21949， 1997)進(jìn)行Northern印跡。將每個(gè)條帶剝離，并用核糖體18S cDNA重新探試以核查獲得 RNAs的完整性和數(shù)量。Southern ￡口跡按以往描述的方法(VALLET等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)進(jìn)行 Southern印跡。用以下的引物擴(kuò)增1437堿基對(duì)的小鼠基因組DNA片段以制備HEPCl探針。_ 正向:5，-GAGCAGCACCACCTATCTCCA-3，(SEQ ID No. 32)禾口
_ 反向:5，-AACAGATACCACAGGAGGGT-3，(SEQ ID No. 33)。用PvuII降解后，從瓊脂糖凝膠中純化出545堿基對(duì)片段并將其用作為Southern 印跡的探針。該HEPCl顯示出了與同源的HEPC2區(qū)域的95%相同性。小鼠的血液學(xué)分析在殺死小鼠之前，通過(guò)眶后靜脈切開(kāi)取血，并收集在肝素化管(capiject T-MLH， Temmo 醫(yī)藥公司)中。用MaxM coulter自動(dòng)分析儀測(cè)定血細(xì)胞數(shù)目和紅細(xì)胞參數(shù)。鐵的測(cè)定和組織學(xué)按以往Torrance 和 Bothwell (1968)描述的，利用 IL 實(shí)驗(yàn) (Instrumentation Laboratory)進(jìn)行部分或整個(gè)組織的鐵水平的定量化。對(duì)于組織學(xué)，利用標(biāo)準(zhǔn)方法將組織固 定在4%福爾馬林中，石臘包埋，放置于玻片上，普魯士藍(lán)染色以及核紅復(fù)染。MMUsf2-/_小鼠肝臟和胰腺的大量鐵負(fù)荷過(guò)量所有的Usf2-/_小鼠在三個(gè)月后都表現(xiàn)出了肝臟致密的褐色色素沉著以及胰腺 較多或較少的顯著的青銅色色素沉著。這個(gè)表型性狀是血色病的特點(diǎn)，是鐵吸收異常的遺 傳性疾病。我們決定分析Usf2-/_小鼠的鐵狀況。首先是評(píng)價(jià)鐵累積的水平，對(duì)保持標(biāo)準(zhǔn) 飲食的野生型和Usf2-/_小鼠的肝臟和胰腺進(jìn)行Perls’普魯士藍(lán)染色。結(jié)果顯示在

圖1(A到D)圖例肝臟切片來(lái)自(A)8個(gè)月大的野生型小鼠(χ 50) ； (B) 8個(gè)月大的Usf2-/_同 窩出生的小鼠；(C) 19個(gè)月大的Usf2-/_小鼠(xlO)。(D)中的胰腺切片來(lái)自8個(gè)月大的 Usf2-/_小鼠(xl2，5)。C中的箭頭指的是肝細(xì)胞核中的鐵。D中的箭頭指的是整個(gè)外分泌 組織中散在的胰島(islet of Langerhans)。對(duì)照小鼠肝中顯示出很少量的或沒(méi)有陽(yáng)性的鐵染色(圖1A)，而Usf2-/-小鼠肝細(xì) 胞中顯示出鐵的聚集(圖1B-C)。這種鐵的沉積主要于門(mén)脈周?chē)母渭?xì)胞以及被染色的肝 細(xì)胞數(shù)目隨著年齡增加而增加。到了 19個(gè)月的年齡，如圖IC所示，鐵的累積是相當(dāng)多的，而 且整個(gè)肝實(shí)質(zhì)被均勻染色。此外，在一些肝細(xì)胞(圖1B)上檢測(cè)到核中嚴(yán)重的鐵累積。對(duì) 于胰腺，得到了相似的結(jié)果，也就是，對(duì)照組織中沒(méi)有染色，而在Usf2-/_小鼠(圖1D)的外 分泌胰腺中有著嚴(yán)重的鐵累積。為了更準(zhǔn)確地定量動(dòng)物生命中的鐵負(fù)荷過(guò)量，測(cè)定了從2. 5到19個(gè)月年齡小鼠的 肝臟和胰腺的鐵的水平。結(jié)果顯示于圖1(E和F)圖例在對(duì)照組(野生型和雜合子小鼠，▲)和Usf2-/_小鼠(□)中測(cè)定了年齡 相關(guān)的肝的(E)和胰腺的(F)非血色素鐵濃度(每克干組織的鐵的微克數(shù))。如圖IE所示，鐵累積在出生后60和100天之間的小鼠肝中，并達(dá)到一平臺(tái)，幾乎 是野生小鼠鐵濃度的10倍。在胰腺(圖1F)中，鐵的累積更為嚴(yán)重，Usf2-/_小鼠的鐵水 平比野生型小鼠最大高20倍。也測(cè)定了腎臟和心臟的鐵的聚集，它們相應(yīng)有著2倍和4倍 的累積。最后，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照小鼠比較，Usf2-/_小鼠的血清有著1.7倍高的鐵水平(對(duì)照組 3. 550士259 μ g 鐵/1 [η = 15]對(duì)Usf2_/_ 小鼠 6. 274士514 μ g 鐵/1 [η = 13]Ρ < 0. 0001)， 但是這種增加沒(méi)有顯示出年齡相關(guān)性。Usf2-/_小鼠血清鐵水平的增加與1.6倍增加的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(對(duì)照組1 士9%飽和度[η = 6]對(duì)Usf2-/_小鼠95士9%飽和度[η = 6]P < 0.0004)相關(guān)。最后，在直到目前為止分析最老的雌性小鼠中(19個(gè)月)，鐵負(fù)荷過(guò)量是 彌漫性的，測(cè)定的所有組織包括肌肉，子宮，肺和垂體(沒(méi)有顯示)都有著鐵水平的增加。Usf 2-/-小鼠脾臟可抵抗自然的鐵沉積結(jié)果顯示在圖2:圖2的圖例(A)在對(duì)照組(野生型和雜合子小鼠，▲)和Usf2-/_小鼠(口)中測(cè)定了年齡相 關(guān)的脾的非血色素鐵濃度(每克干組織的鐵的微克數(shù))。脾的切片來(lái)自代表性的(B)8個(gè) 月大的野生型小鼠(x20)和(C)8個(gè)月大的Usf2-/_同窩出生的小鼠(x20)，用Perl’染色 鐵。RP，紅髓；WP，白髓。與所有其他測(cè)試的組織不同，在野生型小鼠的脾中觀察到年齡相關(guān)的鐵的累積， 如示(圖2A)。觀察到與Perls’普魯士藍(lán)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)的顆粒，它們主要分布在紅髓的細(xì)胞之 間(圖2B)。我們發(fā)現(xiàn)這種累積在小鼠之間有著很大的差異，提示它可能依賴(lài)于每個(gè)動(dòng)物 的雜種品系背景(129/Sv χ C57BL/6)。在C57BL/6小鼠中以往已經(jīng)報(bào)道了這種自然的鐵 儲(chǔ)存，并發(fā)現(xiàn)主要發(fā)生在脾的巨噬細(xì)胞(VENINGA等，Lab. Anim.，23，16-20，1989)。奇怪的 是，在Usf2-/_小鼠的脾中，鐵的水平仍是非常低的(圖2A)，以及完全沒(méi)有Perls’普魯士 藍(lán)染色(圖2C)。Usf2-/_小鼠的紅細(xì)胞參數(shù)不受影響為了除外Usf2-/_小鼠的鐵累積的增加可能是因?yàn)榧t細(xì)胞生成障礙性貧血的可 能，測(cè)定了不同年齡的對(duì)照和Usf2-/_小鼠的紅細(xì)胞參數(shù)。紅細(xì)胞數(shù)目值(RBC，106/ml)， 血紅蛋白濃度(Hb，g/dl)和平均紅細(xì)胞體積(MCB，fl)都是正常的RBC，Hb和MCB相應(yīng)地 分別為野生型 10. 3士0. 3，16. 73士0. 49 和 48. 27士0. 67 (η = 3) ；Usf2_/_ 小鼠 10. 0士0. 3， 15. 67 士 0. 06 和 48. 63 士 1. 36 (η = 3)。因此，有意思的是，在Usf2-/_小鼠中觀察到的鐵的異常，包括脾臟對(duì)鐵累積的抵 抗和正常的血液學(xué)參數(shù)，明顯地類(lèi)似于HFE-/-小鼠的表型(LEVY等，Blood，94，9-ll，1999 ； ZHOU 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95，2492-2497，1998)，一種遺傳性血色病的小鼠模型。Usf2-/-肝的HFE和TFR2基因的表達(dá)沒(méi)有改變因此USF2是轉(zhuǎn)錄因子，因此檢測(cè)了 USF2是否參與了編碼鐵代謝相關(guān)蛋白的基因 的調(diào)節(jié)。因?yàn)镠FE-/-小鼠和Usf2-/_模型的相似性，首先測(cè)定了 HFE基因的表達(dá)。同時(shí) 也關(guān)注了編碼轉(zhuǎn)鐵蛋白受體_2的基因，最近報(bào)道在HH中存在它的突變(CAMASCHELLA等， Nat. Genet.，25，14-15，2000)。結(jié)果顯示在圖3。圖3的圖例將20微克來(lái)自野生型小鼠和Usf 2-/-小鼠(從3到11個(gè)月大)的總的肝RNAs進(jìn) 行電泳并印跡。用32P標(biāo)記的HFE㈧和RTf2(B)的探針(PCR制成，如材料和方法中所述) 雜交印跡。如圖3A的Northern印跡所述，Usf2_/_小鼠肝的HFE mRNA豐度與野生型小鼠的 豐度相當(dāng)。與野生型小鼠比較，Northern印跡分析也表明Usf2-/_小鼠肝的RTf2基因的表達(dá)也沒(méi)有改變(圖3B)。也測(cè)定了 Usf2-/-小鼠的銅藍(lán)蛋白、血色素加氧酶I和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體mRNA水平， 因?yàn)橐呀?jīng)報(bào)道在破壞鐵平衡的疾病中這些mRNA豐度有所改變(綜述見(jiàn)ANDREWS等，Nutr. Rev.，57，114-123，1999)。再次發(fā)現(xiàn)Usf2_/_小鼠的這些mRNA水平與對(duì)照小鼠是相似的。最后，分析了 DMTl基因(也稱(chēng)為Nramp2)的表達(dá)，一種主要的跨膜鐵攝取蛋白，它 主動(dòng)地將還原的膳食中的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)到腸的腸細(xì)胞中。利用RT-PCR (7Usf2-/-對(duì)6對(duì)照小鼠)， 通過(guò)半定量分析了十二指腸的DMTl基因的表達(dá)。在兩組小鼠之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué) 差異(沒(méi)有顯示)。減數(shù)cDNA文庫(kù)分析確證h印cidin為血色病假定的候選基因?yàn)榱舜_定出Usf2-/_小鼠中表達(dá)水平被改變的基因，建立了 Usf2-/_(驅(qū)動(dòng)者)和 野生型(測(cè)試者)小鼠肝之間的減數(shù)cDNA文庫(kù)(DIATCHENKO, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,6025-6030,1996)。在分析的400個(gè)克隆中，利用反向Northern印跡(沒(méi)有顯示)分析 發(fā)現(xiàn)Usf2-/_小鼠肝的一些克隆被下調(diào)。這些克隆中的一個(gè)克隆含有編碼最近認(rèn)識(shí)的肽 h印cidin的全長(zhǎng)cDNA(KRAUSE等，F(xiàn)EBS Lett.，480，147-150，2000 ；PARK 等，J. Biol. Chem.， 276，7806-7810，2001 ；PIGEON 等，J. Biol. Chem.，276，7811-7819，2001)。小鼠Usf2和h印cidin基因在第7號(hào)染色體上的組合小鼠基因組含有兩個(gè)緊密相關(guān)的hepcidin基因，它們共同定位于相同的小鼠 基因組克隆(Genbank clone, accession number AC020841)。這兩個(gè)基因被 PIGEON 等 (J. Biol. Chem.，276，7811-7819，2001)稱(chēng)為 HEPCl 和 HEPC2。有趣的是，基因組 CT7-8N15 克隆也發(fā)現(xiàn)HEPCl基因在小鼠第7號(hào)染色體上的位置與Usf2基因位置非常接近。PIGEON 等報(bào)告HEPCl是直接定位于Usf2基因的下游(PIGEON等，J. Biol. Chem.，276，7811-7819， 2001)。通過(guò)分析另一個(gè)基因組克隆，RP23-22G9 (Genbank，accession number AC087143)發(fā) 現(xiàn)Usf2基因的部分(包括外顯子8，9和10)也是重復(fù)的，事實(shí)上，HEPCl位于縮短的Usf2 基因的下游。Usf2和h印cidin基因的基因組組合顯示在圖4中。圖4的圖例基因位點(diǎn)區(qū)域的圖示(沒(méi)有標(biāo)尺)包括Usf2和h印cidin基因。靶等位基因表示 為插入外顯子 7 的 betageo 盒(VALLET 等，J. Biol. Chem.，272，21944-21949，1997)。數(shù)據(jù) 來(lái)自基因組RP23-22G9克隆(基因庫(kù))。至今為止，沒(méi)有得到關(guān)于兩個(gè)h印cidin基因之間 的定位和距離的數(shù)據(jù)。圖右側(cè)的Southern印跡來(lái)自用BglII降解和用HEPCl探針雜交的 野生型、雜合子和純合子小鼠的尾部DNA。無(wú)論基因表型如何，都發(fā)現(xiàn)了兩條預(yù)期大小的條 帶，12. 4千堿基對(duì)和5. 1千堿基對(duì)。用USF2探針發(fā)現(xiàn)了相同的條帶。HEPC2基因定位了功能完全的Usf2基因的下游，而HEPCl位于部分Usf2基因的下 游。目前，沒(méi)有得到關(guān)于HEPCl和HEPC2的5，-3，的相對(duì)定位和兩者之間距離的信息。因?yàn)閁sf2基因和h印cidin基因位置相近，因此驗(yàn)證目標(biāo)Usf2等位基因的外顯子 7的重組事件是否可以剔除或縮短HEPCl和HEPC2基因。為了證實(shí)這個(gè)假說(shuō)，利用HEPCl探 針(圖4)對(duì)來(lái)自野生型，Usf2+/_或Usf2-/_小鼠的基因組尾部DNA進(jìn)行Southern印跡。 用BglII降解基因組DNA。依照對(duì)AC087143位點(diǎn)的分析，預(yù)計(jì)該降解能生成兩個(gè)5. 1和12. 4 千堿基對(duì)片段，它們相應(yīng)地含有HEPCl和HEPC2基因。因?yàn)镠EPCl和HEPC2雜交區(qū)域之間的緊密相似性(大于95% )，預(yù)計(jì)HEPCl探針都能發(fā)現(xiàn)這兩條帶。結(jié)果如圖4中Southern 印跡所示。從來(lái)自Usf2-/_小鼠的DNA中觀察到了同樣的結(jié)果，這提示h印cidin基因存在 于Usf2-/_小鼠中并且它們沒(méi)有進(jìn)行大的重組。最后，該兩條帶也和從外顯子8延伸到外 顯子10的USF2探針雜交，說(shuō)明USF2的外顯子8到10的確是重復(fù)的。Hepcidin基因在Usf2-/_小鼠肝中是完全沉默的用Northern印跡分析測(cè)定h印cidin基因的表達(dá)水平。事實(shí)上，在Usf2-/_小鼠 肝中完全不能測(cè)到h印cidin mRNA(圖5A)。值得注意的是，與野生型小鼠比較，Usf2+/_小 鼠肝含有較少的h印cidin mRNA。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)HEPCl和HEPC2信使的特異水平，設(shè)計(jì) 了 HEPCl和HEPC2轉(zhuǎn)錄的特異引物。通過(guò)RT-PCR證實(shí)，兩個(gè)基因在野生型小鼠肝中都被活 躍地轉(zhuǎn)錄(圖5B-C)，而在Usf2-/_小鼠肝中完全缺失HEPCl和HEPC2基因的轉(zhuǎn)錄物(圖 5B-C)。圖5的圖例(A) 20微克來(lái)自野生型，Usf2+/-和Usf2-/_動(dòng)物(3個(gè)月和11個(gè)月大之間)的總 肝RNAs被電泳和印跡化。用32P標(biāo)記的HEPC探針(按“材料和方法”描述的制備)雜交 印跡，該探針最主要識(shí)別HEPCl和HEPC2轉(zhuǎn)錄物。(B)按材料和方法所描述的RT-PCR測(cè)定 特異的HEPCl和HEPC2水平。PCR后，將擴(kuò)增產(chǎn)物(171堿基對(duì)對(duì)HEPCl或HEPC2，及250堿 基對(duì)對(duì)β-actin)在1. 5%瓊脂糖凝膠上用電泳分離。HEPCl或HEPC2的特異引物都不能 重新擴(kuò)增HEPC2和HEPCl產(chǎn)物，相應(yīng)的，說(shuō)明每對(duì)引物的高特異性(沒(méi)有顯示)。HFE敲除小鼠和Usf 2-/_h印cidin缺失小鼠之間的鐵代謝改變的相似性提示 h印cidin可能作用于和HFE相同的調(diào)節(jié)途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HFE主要和十二指腸粘膜的隱窩細(xì) 胞的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相互作用(WAHEED 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96,1579-1584，1999)。 不被該理論所約束，可以假設(shè)這種相互作用調(diào)節(jié)了這些細(xì)胞內(nèi)鐵的水平，這反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)了 微絨毛頂部成熟細(xì)胞的頂端和基側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)的表達(dá)。H印cidin可能通 過(guò)與HFE/beta2微球蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物的直接相互作用而影響HFE活性。相同 地，hepcidin可能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵儲(chǔ)存。根據(jù)圖6的模型所示，成熟HFE蛋白的存在 和h印cidin表達(dá)的完全缺失可以造成腸道鐵吸收的增加和巨噬細(xì)胞鐵儲(chǔ)存的減少。在該模型中，h印cidin通過(guò)減少腸道細(xì)胞對(duì)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞儲(chǔ)存鐵 而預(yù)防鐵的負(fù)荷過(guò)量。在Usf2-/_小鼠，h印cidin的缺失可以造成腸道鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的增加和巨 噬細(xì)胞鐵儲(chǔ)存的減少。在這兩種情況下，血漿鐵克服了轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵聚集于不 同的組織，包括心臟和胰腺。依照h印cidin在鐵穩(wěn)態(tài)的預(yù)期作用，hepcidin的產(chǎn)生可能依賴(lài)于肝細(xì)胞的TFR2 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵的攝取。這可以解釋為什么TFR2缺失造成了一種人遺傳性血色病， 如果這種缺失導(dǎo)致了 h印cidin分泌的減少，這反過(guò)來(lái)造成鐵吸收的增加。通過(guò)測(cè)定TFR2 缺失患者或TFR2敲除小鼠血漿的h印cidin可以驗(yàn)證這種假說(shuō)。實(shí)施例2 過(guò)度表達(dá)h印cidin的轉(zhuǎn)基因小鼠的特點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的生產(chǎn)用以下引物擴(kuò)增小鼠的h印cl cDNA的全長(zhǎng)cDNA:
5' -GGGGGATATCAGGCCTCTGCACAGCAGAACAGAAGG-3' (SEQ ID No. 34)和5' -GGGGGATATCAGGCCTCTATGTTTTGCAACAGATACC-3' (SEQID No. 35)。兩個(gè)引物都包含StuI位點(diǎn)(下劃線部分)。將h印clPCR片段引入到小鼠甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TTR)啟動(dòng)子(包括第一外顯子，第 一內(nèi)含子和第二外顯子的絕大多數(shù))和SV40小-Tpoly (A)信號(hào)框之間。該構(gòu)建體攜帶有3 千堿基對(duì)的5，連接于帽位點(diǎn)的小鼠TTR DNA序列(YAN等，EMBO J.，9，869-879，1990)。通 過(guò)降解將4. 7千堿基對(duì)TTR-hepcl轉(zhuǎn)基因從質(zhì)粒序列中分離出來(lái)并用于生殖核的微注射。PCR及Southern印跡的基因分型根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行Southern印跡(SAMBR00K等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷 泉港實(shí)驗(yàn)出版社1989)。從尾部制備基因組DNA如下從每只小鼠上切下一段5毫米長(zhǎng)的 尾巴，并放置于 500 μ 1 降解混合物中(50mM Tris, pH 8/100mM EDTA/IOOmM NaCl/l%SDS) 加入蛋白酶K(200yg)并在55°C降解過(guò)夜。加入500 μ 1苯酚/氯仿/異表乙醇(1/24/25) 直接萃取樣品。渦旋和離心后，用等體積的異丙醇沉淀清亮的水相。對(duì)于southern印跡， 用BamHI降解DNA，該BamHI切割轉(zhuǎn)基因兩次。電泳后，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond-N+， Amersham)。探針針對(duì)于來(lái)自以往描述的TTR質(zhì)粒的1. 7千堿基對(duì)Bglll-HindIII片段 (YAN等，EMBO J.，9，869-878，1990)。利用商業(yè)可獲得的試劑盒(DNA標(biāo)記系統(tǒng)，Gibco)和 dCTP32P的隨機(jī)引物標(biāo)記探針。5. 3千堿基對(duì)標(biāo)記的片段對(duì)應(yīng)于內(nèi)源的TTR基因，而4. 7千 堿基對(duì)標(biāo)記的片段對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)基因。對(duì)于PCR反應(yīng)，將基因組DNA (0. 5-1 μ g)用于25μ 1反應(yīng)物，該反應(yīng)物包括兩種引 物利用引物擴(kuò)增TTR-h印cl轉(zhuǎn)基因-5' -CTTTTTGCACCATGCACCTTTC-3 ‘ (SEQ ID No. 36 ；退火于 TTR 的第一內(nèi)含子) 和-5' -AACAGATACCACACTGGGAA-3 ‘ (SEQ ID No. 37 ；退火于 h印cl cDNA)。如下進(jìn)行PCR反應(yīng)25個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)包括94°C 40秒，50°C 40秒及72°C 40 秒)和94°C初始變性步驟4分鐘及72°C終末延伸步驟5分鐘，反應(yīng)含有20mM Tris-HCl (pH 8.4)，50mM KC1,0. 05% ff-I,2mM MgCl2,0. 2mM 每種 dNTP，0· 2 μ M 每種引物，2 單位 Taq 聚合 酶(Gibco)。用相同大小的非特異片段擴(kuò)增612堿基對(duì)特異性產(chǎn)物。用10單位StuI降解 PCR產(chǎn)物2個(gè)小時(shí)產(chǎn)生268堿基對(duì)和344堿基對(duì)片段后提示轉(zhuǎn)基因的存在。在含有溴化乙 錠的1.5-2%瓊脂糖凝膠上分析反應(yīng)物。非特異片段的擴(kuò)增確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的缺失不能歸結(jié)于 基因組DNA的缺失或降解。發(fā)現(xiàn)用于小鼠基因分型的該P(yáng)CR方法給出了和Southern印跡 法一樣的結(jié)果。MMTTR-h印Cl轉(zhuǎn)基因小鼠的特點(diǎn)總共9只獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因首建小鼠(transgenic founder mice)都用經(jīng)典的線性構(gòu) 建體的微注射方法生成。圖7A圖示了該構(gòu)建體。圖7B顯示了不同首建小鼠的Southern印跡。三只轉(zhuǎn)基因首建小鼠(TH27，TH37和TH52)與它們的野生型同窩生小鼠無(wú)區(qū)別。 三只轉(zhuǎn)基因首建小鼠在出生時(shí)皮膚蒼白并在出生后幾個(gè)小時(shí)內(nèi)死亡(bb2，3和5)。最后，剩
15余的三只轉(zhuǎn)基因首建小鼠的表型是顯而易見(jiàn)的(TH5，35，和44)它們?nèi)頍o(wú)毛以及皮膚是 皺褶的)。在這些動(dòng)物上進(jìn)行血涂片，在有著皺褶皮膚的三只小鼠上發(fā)現(xiàn)了嚴(yán)重的異形紅細(xì) 胞(poikylocytosis)和低血紅蛋白的證據(jù)。 上述實(shí)施例突出表明了 hepcidin做為鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物的作用。預(yù)計(jì) hepcidin是一種新的候選基因，當(dāng)它突變時(shí)，能參與鐵代謝的異常調(diào)節(jié)和HH的發(fā)生。最后， 上述的新的鐵負(fù)荷過(guò)量疾病的小鼠模型表明是一種測(cè)試預(yù)防和糾正HH的鐵儲(chǔ)存的新的治 療方法以及了解鐵穩(wěn)態(tài)的合適的動(dòng)物模型。
權(quán)利要求
一種包含在第2，5，6，8，9，14，17和18位具有半胱氨酸殘基的具有20個(gè)氨基酸、并與SEQ ID No.1具有至少50％的相同性或60％的相似性、優(yōu)選地至少60％的相同性或至少70％的相似性的序列的多肽在制備用于減少鐵負(fù)荷過(guò)量的藥物中的用途。
2.hepcidin表達(dá)或h印cidin活性的抑制劑在制備用于增加鐵吸收的藥物中的用途。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述的藥物用于治療貧血。
4.一種產(chǎn)生基因敲除的非人類(lèi)動(dòng)物的方法，其步驟包括使hepcidin基因失活，所述基 因敲除的非人類(lèi)動(dòng)物不包括其中編碼轉(zhuǎn)錄因子USF2的基因也被失活的基因敲除小鼠。
5.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物的方法，其步驟包括在非人類(lèi)動(dòng)物中表達(dá)hepcidin的轉(zhuǎn)基因。
6.h印cidin基因已經(jīng)被失活的基因敲除的非人類(lèi)動(dòng)物在篩選用于減少鐵吸收的化合 物中的用途。
7.權(quán)利要求6方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人類(lèi)動(dòng)物在篩選能抑制hepcidin對(duì)鐵吸收的抑制 作用的化合物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及將hepcidin用于診斷和治療鐵穩(wěn)態(tài)疾病的用途，hepcidin能被用于治療鐵負(fù)荷過(guò)量引起的疾病，而hepcidin的抑制劑可用于治療貧血。
文檔編號(hào)G01N33/15GK101884780SQ20101023275
公開(kāi)日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2002年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者格爾·尼古拉, 索菲·沃隆特, 阿克塞爾·卡恩 申請(qǐng)人:國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院