專利名稱：一種艾塞那肽藥代動力學(xué)的測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種艾塞那肽藥代動力學(xué)的測試方法，屬于分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
艾塞那肽(Exendin-4)是人工合成的新一類降糖藥物，由39個(gè)氨基酸(His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2)組 成的多肽，與內(nèi)源性腸降血糖素的作用相似，用于治療2型糖尿病。2型糖尿病是一種進(jìn)展 性疾病，隨著病程的延長，患者血糖控制也愈加困難。研究證實(shí)，在使用固定劑量的前提下， 艾塞那肽的降糖作用能夠持續(xù)穩(wěn)定存在。艾塞那肽已被美國食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn) 用于2型糖尿病患者單藥起始治療，隨著艾塞那肽相關(guān)研究的開展，其治療適應(yīng)癥和劑型 也在不斷更新。因此研究艾塞那肽在人體血液中的藥代動力學(xué)行為極為重要，它對藥物劑 型的研究、對臨床醫(yī)生的合理用藥起重要的指導(dǎo)作用。人血漿中的濃度測定有文獻(xiàn)報(bào)道采用ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)，用美國LINCO試劑公司生產(chǎn)的試劑盒；ELISA試劑盒價(jià)格較昂貴，而 且存在穩(wěn)定性差等缺陷。本發(fā)明采用Se5pax-UCt生產(chǎn)的Styre Screen H2P柱，經(jīng)固相萃 取將血漿樣品濃縮后，采用HPLC分析血漿中艾塞那肽的濃度，用自編的藥物動力學(xué)定域模 型計(jì)算軟件PKLMC (Pharmacokinetics Local ModelCalculation)研究藥物在血液中的動 力學(xué)行為，計(jì)算動力學(xué)方程、速率常數(shù)、半衰期、藥-時(shí)曲線下的面積AUC、清除率CL、分布容 積等動力學(xué)參數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種艾塞那肽藥代動力學(xué)的測試方法，我們采用固相萃取將 人血漿樣品濃縮后采用高效液相色譜_紫外檢測器對色譜行為進(jìn)行了一系列的考察后，確 定了本發(fā)明方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種艾塞那肽藥代動力學(xué)的測試方法將人血漿樣本經(jīng)固相 萃取柱萃取濃縮后稀釋至合適的濃度，采用高效液相色譜_紫外檢測器對艾塞那肽進(jìn)行檢 測，步驟為(1)血漿樣本的提取采用固相萃取裝置VMF016GL，Sepax-uct 的Styre Screen H2P柱，先依次用 ImL 甲醇、ImL含質(zhì)量濃度0. 三氟乙酸的去離子水將柱子活化；吸取0. 5mL血漿樣本，以1 2mL/min的速度加入固相萃取柱，樣本富集后用ImL含質(zhì)量濃度0. 三氟乙酸的去離子水 淋洗，抽干；再用甲醇-含質(zhì)量濃度0. 三氟乙酸的去離子水溶液洗脫(甲醇含質(zhì)量濃 度0. 三氟乙酸的去離子水體積比75 25)，抽干；用氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑，冷凍干燥，待 測；(2) HPLC 測試
色譜條件確定為儀器WATERS 600型高效液相色譜儀，WATERS 2487紫外檢測 器，色譜柱S印ax昍-(18，5“111，4.6\250讓；流動相A 含質(zhì)量濃度0. 三氟乙酸的乙 腈，B 含質(zhì)量濃度0. 1 %三氟乙酸的去離子水；使用前流動相經(jīng)0. 45 μ m濾膜抽濾并脫氣， 流速0. 8mL/min ；樣品的進(jìn)樣體積10 μ L ；柱溫室溫；檢測波長210nm ；精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品 艾塞那肽作對照，用質(zhì)量濃度85%乙腈-去離子水配制成含艾塞那肽0. 05mg/mL的溶液，計(jì) 為Wwm ；0. 5mL血漿樣本經(jīng)步驟(1)提取凍干后的樣本，加50 μ L質(zhì)量濃度85%乙腈-去離 子水溶解作為被測樣本W(wǎng)#s ；經(jīng)HPLC測試對照品的色譜峰面積分別為SWM，被測樣本的色 譜峰面積為S#s，按外標(biāo)法計(jì)算被測樣本中艾塞那肽的含量為ff#p= (S樣品/S對照)W對照，單位為mg/mL，血漿中艾塞那肽的含量為Wtis X 50/0. 5X 106pg/mL。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種經(jīng)固相萃取將人血漿艾塞那肽樣品富集 在Styre Screen H2P柱上，經(jīng)洗脫血漿中艾塞那肽的回收率接近80% ；用高效液相色 譜_紫外檢測器檢測人血漿中艾塞那肽的濃度的方法，顯示主成分峰與雜質(zhì)峰分離良好， 在5 160 μ g/mL試驗(yàn)范圍內(nèi)呈線性；用藥物動力學(xué)定域模型計(jì)算軟件PKLMC計(jì)算出了艾 塞那肽在人血漿中的動力學(xué)方程、速率常數(shù)、半衰期、藥_時(shí)曲線下的面積AUC、清除率CL、 分布容積等動力學(xué)參數(shù)。本發(fā)明用液相色譜分析人血漿中艾塞那肽的含量，方法簡便、可 靠。為臨床用藥提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1血漿樣品的提取采用StyreScreen H2P柱(固相萃取裝置 VMF016GL，Sepax-uct)，先依次用 ImL甲醇、ImL去離子水(含0. 三氟乙酸)將柱子活化；吸取0. 5mL血漿樣本，以1 2mL/min的速度加入固相萃取柱，樣品富集后用ImL去離子水(含0. 三氟乙酸)淋洗， 抽干；再用甲醇-含0.1%三氟乙酸的去離子水(體積比75 25)溶液洗脫，抽干；用氮?dú)?吹干有機(jī)溶劑，冷凍干燥，待測。實(shí)施例2色譜條件的選擇色譜柱S印ax昍_(18，5“111，4.6\250讓；流動相4:乙腈(0.1%1卩六)，8:水 (0. 1% TFA)；流速0. 8mL/min ；樣品的進(jìn)樣體積=IOyL ；柱溫室溫；檢測波長:210nm。梯度程序的優(yōu)化0 20min，80% A 20% A ;20 25min，20% A 20% A，色譜 分離能達(dá)到理想的分離效果，血漿中的各組份與艾塞那肽分離較好，不影響艾塞那肽的分 析。其他梯度情況下，分離度減小或色譜峰發(fā)生分叉。實(shí)施例3線性范圍和檢測限試驗(yàn)精確稱取一定量的艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動相溶解并稀釋成濃度分別為5、 10、20、40、80、16(^8/!^的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣10 μ L，用積分面積對樣品量作圖。所得回 歸方程為ι = 84703x+3917165, R2 = 0. 9999，線性范圍為5 160 μ g/mL。最小檢出量為 1. 5ng(S/N ≥ 3)。實(shí)施例4精密度試驗(yàn)精確稱取一定量的艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動相溶解稀釋，配制10、20、80μ g/ mL的高、中、低3種濃度的艾塞那肽質(zhì)控溶液，在確定的色譜條件下于同一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，根據(jù)峰面積計(jì)算精確度。
表 1 實(shí)施例5血漿樣本艾塞那肽提取回收率的測定稱取一定量的艾塞那肽標(biāo)準(zhǔn)品適量，使其在血漿中的濃度為10、20、80μ g/mL，按 實(shí)施例1方案提取血漿中的艾塞那肽，經(jīng)HPLC測定艾塞那肽的濃度，測定值除以理論值即 得艾塞那肽提取回收率。經(jīng)Styre Screen H2P固相萃取柱血漿中艾塞那肽平均提取回 收率接近80% ；用⑶C18、CEC18固相萃取柱血漿中艾塞那肽提取回收率僅40%左右，文獻(xiàn) 報(bào)道的方法血漿中艾塞那肽提取回收率接近50%。實(shí)施例6血漿樣品濃度測定精密稱取標(biāo)準(zhǔn)艾塞那肽對照品，用(85% )乙腈-水配制成含艾塞那肽0.05mg/ mL的溶液，計(jì)為W5i ；健康志愿者(10個(gè))分別于給藥前(Oh)及給藥后(皮下注射，劑量 5 μ g/kg) 0. 25,0. 5、0. 75、1、1. 25、1. 5、2、2. 5、3、4h不同時(shí)間點(diǎn)采血約5mL置于無菌干燥抗 凝試管中，3000rpm、4°C離心分離后將上清液置于另一無菌干燥試管中，-80°C冷凍保存。取 0. 5mL血漿，經(jīng)實(shí)施例1方案提取凍干后加50μ L(85% )乙腈-去離子水溶解，超聲振蕩， 過濾作為被測樣本W(wǎng)#s。經(jīng)HPLC測試對照品的色譜峰面積分別為S5i ，被測樣本的色譜 峰面積為S#s，按外標(biāo)法計(jì)算被測樣本中艾塞那肽的含量為W#S= (S#s/SM)WM (mg/ mL)，血漿中艾塞那肽的含量為Wtis X 50/0. 5X 106pg/mL。
表2 實(shí)施例7用藥物動力學(xué)定域模型計(jì)算軟件PKLMC (Pharmacokinetics LocalModel Calculation)研究藥物在血液中的動力學(xué)行為，計(jì)算動力學(xué)方程、速率常數(shù)、半衰期、 藥-時(shí)曲線下的面積AUC、清除率CL、分布容積等動力學(xué)參數(shù)。輸入數(shù)據(jù)給藥方式、給藥劑量、采樣時(shí)間點(diǎn)t、t時(shí)刻血漿中測得的艾塞那肽濃 度，運(yùn)行PKLMC軟件，軟件計(jì)算獲得以下計(jì)算結(jié)果。計(jì)算結(jié)果表 3 從上述計(jì)算結(jié)果可見，吸收速率常數(shù)為1.491/h、消除速率常數(shù)為0.661/h、吸收 相半衰期、&為0. 46h、分布相半衰期t1/2a為0. 52h，而消除相半衰期、/20為1. 12h，表明 該藥物在肌肉注射進(jìn)入體內(nèi)后，很快進(jìn)入血液循環(huán)，吸收快、消除慢，有利發(fā)揮其治療作用。 藥物濃度_時(shí)間曲線下面積AUC為218. 79ng/L*h，表明該藥物在血液中能在一定的時(shí)間內(nèi) 維持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛?，其降糖作用能夠持續(xù)穩(wěn)定存在，有利于治療。達(dá)峰時(shí)間tmax和峰值Cmax 表明該藥物在0. 97h時(shí)達(dá)到最高濃度74. 64ng/L。動力學(xué)研究表明艾塞那肽在體內(nèi)具有良 好的動力學(xué)行為，對藥物的用量、對臨床醫(yī)生的合理用藥起重要的指導(dǎo)作用。
權(quán)利要求
一種艾塞那肽藥代動力學(xué)的測試方法，其特征在于將人血漿樣本經(jīng)固相萃取柱萃取濃縮后稀釋至合適的濃度，采用高效液相色譜 紫外檢測器對艾塞那肽進(jìn)行檢測，步驟為(1)血漿樣本的提取采用固相萃取裝置VMF016GL，Sepax uct的柱，先依次用1mL甲醇、1mL含質(zhì)量濃度0.1％三氟乙酸的去離子水將柱子活化；吸取0.5mL血漿樣本，以1～2mL/min的速度加入固相萃取柱，樣本富集后用1mL含質(zhì)量濃度0.1％三氟乙酸的去離子水淋洗，抽干；再用甲醇 含質(zhì)量濃度0.1％三氟乙酸的去離子水溶液洗脫，甲醇含質(zhì)量濃度0.1％三氟乙酸的去離子水體積比75∶25，抽干；用氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑，冷凍干燥，待測；(2)HPLC測試色譜條件確定為儀器WATERS 600型高效液相色譜儀，WATERS 2487紫外檢測器，色譜柱Sepax HP C18，5μm，4.6×250mm；流動相A含質(zhì)量濃度0.1％三氟乙酸的乙腈，B含質(zhì)量濃度0.1％三氟乙酸的去離子水；使用前流動相經(jīng)0.45μm濾膜抽濾并脫氣，流速0.8mL/min；樣品的進(jìn)樣體積10μL；柱溫室溫；檢測波長210nm；精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品艾塞那肽作對照，用質(zhì)量濃度85％乙腈 去離子水配制成含艾塞那肽0.05mg/mL的溶液，計(jì)為W對照；0.5mL血漿樣本經(jīng)步驟(1)提取凍干后的樣本，加50μL質(zhì)量濃度85％乙腈 去離子水溶解作為被測樣本W(wǎng)樣品；經(jīng)HPLC測試對照品的色譜峰面積分別為S對照，被測樣本的色譜峰面積為S樣品，按外標(biāo)法計(jì)算被測樣本中艾塞那肽的含量為W樣品＝(S樣品/S對照)W對照，單位為mg/mL，血漿中艾塞那肽的含量為W樣品×50/0.5×106pg/mL。FSA00000205873400011.tif
全文摘要
一種艾塞那肽藥代動力學(xué)的測試方法，屬于分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將人血漿樣本經(jīng)固相萃取柱萃取濃縮后稀釋至合適的濃度，采用高效液相色譜-紫外檢測器對艾塞那肽進(jìn)行檢測；用質(zhì)量濃度85％乙腈-去離子水配制成含艾塞那肽0.05mg/mL的溶液，計(jì)為W對照；0.5mL血漿樣本經(jīng)固相萃取凍干后的樣本，加50μL質(zhì)量濃度85％乙腈-去離子水溶解作為被測樣本W(wǎng)樣品；經(jīng)HPLC測試對照品的色譜峰面積分別為S對照，被測樣本的色譜峰面積為S樣品，按外標(biāo)法計(jì)算被測樣本中艾塞那肽的含量為W樣品＝(S樣品/S對照)W對照，血漿中艾塞那肽的含量為W樣品×50/0.5×106pg/mL；本發(fā)明用液相色譜分析人血漿中艾塞那肽的含量，方法簡便、可靠、為臨床用藥提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
文檔編號G01N30/06GK101900712SQ201010237160
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月21日
發(fā)明者劉英濤, 周杏琴, 孔艷艷, 曹國憲, 蔡剛明, 欽曉峰 申請人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所