專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物多肽的合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
糖尿病是繼心腦血管疾病、腫瘤之后的另一個(gè)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的慢性非傳染性疾病，近年來(lái)，隨著人們生活方式的改變，糖尿病患病率呈急劇上升趨勢(shì)。目前我國(guó)糖尿病患者已逾7000萬(wàn)，并且糖尿病患者增長(zhǎng)率是歐美國(guó)家的2倍。2型糖尿病(Type 2Diabetes, T2DM)是糖尿病的主體，占糖尿病患者的90%左右。T2DM是由遺傳和多種環(huán)境因素相互作用而引起胰島索分泌或作用缺陷。其患病率較高，尤以中老年人為多，并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。胰島口細(xì)胞數(shù)目減少或分泌功能障礙是導(dǎo)致T2DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。治療一般遵循生活方式干預(yù)(如飲食控制、運(yùn)動(dòng)治療等)、口服降糖藥和聯(lián)合使用胰島素等方式。傳統(tǒng)治療T2DM的藥物的副作用都較大，長(zhǎng)期使用會(huì)因胰島素分泌過(guò)度導(dǎo)致胰島口細(xì)胞功能衰竭。近年來(lái)胰高血糖素樣肽I(GLPl)和enendin — 4成為糖尿病治療研究的熱點(diǎn)。因?yàn)樗鼈兙哂性谘菨舛容^高的情況下促進(jìn)胰島素分泌的特性，而在血糖正常的情況下不發(fā)揮作用，不僅可使初治的2型糖尿病患者血糖恢復(fù)正常，而且對(duì)磺脲類(lèi)藥物治療失效者也有降血糖作用。Exendin-4是一條39個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，最初由南美巨蜥的唾液分離提取獲得。它的氨基酸殘基與哺乳動(dòng)物GLP-I序列有53%的同源性，并且生物學(xué)效應(yīng)也幾乎完全一致其與GLP-I的最大不同之處在于N端第2位的甘氨酸(Gly)耐血液中二肽基肽酶(DPP-IV)jGLP-I的相同位置則為極易被DPP-IV切斷的丙氨酸(Ala)，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期較長(zhǎng)(tl/2 E =9. 7h )。Exendin-4是一種強(qiáng)效GLP-I受體激動(dòng)劑，能模擬GLP-I這種內(nèi)源性多肽的糖調(diào)控作用，降低空腹和餐后血糖。艾塞那肽(Exenatide)的活性主要通過(guò)與人體胰臟GLP-I受體結(jié)合而介導(dǎo)，由環(huán)腺苷酸(cAMP)依賴(lài)和β細(xì)胞分化機(jī)制引發(fā)葡萄糖依賴(lài)的胰島素合成和分泌。因?yàn)镋xendin-4的氨基酸結(jié)構(gòu)及生物活性與GLP-I均具有相關(guān)性，故通常也被視為腸促胰島素的一種。由于Exendin-4的降糖作用時(shí)間較長(zhǎng)，延緩胃排空和抑制攝食沖動(dòng)對(duì)肥胖病人體重的有益作用又有別于傳統(tǒng)的降糖藥物，因此其作為2型糖尿病治療藥物開(kāi)發(fā)的潛力巨大。目前對(duì)Exendin-4進(jìn)行的藥物研究主要為制備工藝，作用機(jī)制，內(nèi)分泌代謝病臨床，分子藥理學(xué)和藥劑學(xué)研究。已上市的Exendin-4藥物(Exenatide)采用的是多肽合成法的制備工藝?；瘜W(xué)合成成本高(對(duì)原料氨基酸及儀器設(shè)備要求極高)、產(chǎn)量少，而利用基因工程生產(chǎn)Exendin — 4，不僅可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)、有效地降低生產(chǎn)成本，而且對(duì)環(huán)境影響小，產(chǎn)品品質(zhì)更安全。但用基因工程方法直接表達(dá)生產(chǎn)Exendin-4這樣的39肽，表達(dá)水平低，且容易降解，可采用與載體蛋白(如硫氧還蛋白等)連結(jié)融合表達(dá)的方法。但這種方法也存在融合蛋白分子中的目的多肽分子所占比例很小，產(chǎn)量很低，且融合蛋白裂解后多肽種類(lèi)很多，分離純化困難的問(wèn)題。行之有效的增加基因的表達(dá)產(chǎn)物的方法是構(gòu)建基因串聯(lián)體，根據(jù)目標(biāo)基因的特點(diǎn)和表達(dá)產(chǎn)物的特性，運(yùn)用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)操作技術(shù)將目的基因按一定的方式串聯(lián)在一起，置于表達(dá)載體啟動(dòng)子控制之下進(jìn)行表達(dá)，再將表達(dá)的串聯(lián)體產(chǎn)物用特定的物質(zhì)(酶或化學(xué)試劑)裂解，以獲得目標(biāo)肽單體。比如pET-31b ( + )是一個(gè)常用的生產(chǎn)多肽的質(zhì)粒，但是它用來(lái)生產(chǎn)多肽，當(dāng)初設(shè)計(jì)是為了避免多肽容易被大腸桿菌體內(nèi)的蛋白水解酶水解，所以讓目的多肽和KSI融合蛋白一起表達(dá)，形成了包涵體，這對(duì)生產(chǎn)Exendin-4來(lái)說(shuō)是個(gè)很大的缺點(diǎn)，如果讓Exendin-4先生成包涵體再?gòu)?fù)性會(huì)造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復(fù)，這已是重組艾塞那肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
本發(fā)明的重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，包括工程菌的構(gòu)建、工程菌的發(fā)酵表達(dá)和目的蛋白的純化，所述的工程菌的構(gòu)建是按下述步驟進(jìn)行的
(1)重組Exendin— 4多肽基因序列的人工合成根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性，設(shè)計(jì)編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No. I所示的目的基因；
(2)MAG2010質(zhì)粒取pET31b(+)質(zhì)粒，切割掉SEQID No. 2所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID No. 3所示的基因，刪除限制性內(nèi)切酶AlwnI酶切位點(diǎn)和蛋氨酸和后繼序列，取代以腸激酶酶切位點(diǎn)和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標(biāo)記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標(biāo)記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子；構(gòu)建的質(zhì)粒順序?yàn)榈鞍彼峋幋a序列+6XHis_tag編碼序列+ GB-I編碼序列+腸激酶酶切位點(diǎn)編碼序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸編碼+雙終止子；
(3)工程菌的構(gòu)建按照啟動(dòng)子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點(diǎn)-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經(jīng)切割好的MAG2010質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質(zhì)粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉(zhuǎn)化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌體，篩選陽(yáng)性克隆，作為重組Exendin-4融合表達(dá)的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。要使生物合成Exendin-4能進(jìn)行擴(kuò)大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用，關(guān)鍵之一是對(duì)發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化，最大可能的利用菌株Exendin-4高產(chǎn)能力，以最經(jīng)濟(jì)的方式進(jìn)行生產(chǎn)。一般來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)可溶性蛋白時(shí)不能采用高密度發(fā)酵的方法，因?yàn)檫@樣容易形成包涵體，目前國(guó)內(nèi)外利用的培養(yǎng)基大多為2XYT培養(yǎng)基或者LB培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，利用的大多是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)研究型的搖瓶法培養(yǎng)。本發(fā)明的工程菌的發(fā)酵表達(dá)包括下述步驟
(1)挑單菌落到裝有30mL目標(biāo)培養(yǎng)基中，3rc，200rpm活化過(guò)夜；
(2)將30mL菌液接到200mL 2XYT培養(yǎng)基中，32°C，200rpm培養(yǎng)約2. 6 hr ；
(3)以10%的接種量，接到5L MMBL培養(yǎng)基中，32°C，240rpm培養(yǎng)約3 hr ；
(4)接到60L發(fā)酵培養(yǎng)基中；
(5)控制生長(zhǎng)期pH為6.8 ;用攪拌速度及通氣量使DO ^ 10% ;待培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度降至O. 2g/L時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料；當(dāng)OD55tl達(dá)到10左右時(shí)加入13 mL IM IPTG誘導(dǎo)，終濃度為
0.2mM,把pH緩慢調(diào)至7. 00,繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)后結(jié)束。所述的目的蛋白的純化步驟采用離子交換層析-柱層析-三明治型的親和層析進(jìn)行分離和純化；該工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化得到的重組艾塞那肽的產(chǎn)量達(dá)到500毫克/升的產(chǎn)率。所述的三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下
(1)親和層析一采用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3個(gè)柱體積的50 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCI的緩沖液平衡柱子，然后用將用相同緩沖液透析過(guò)的蛋白質(zhì)上柱，用I倍體積上述緩沖液洗然后用5mM乙酸鈉，pH5. O的緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，接著用500mM乙酸鈉，pH5. O的緩沖液將目的蛋白洗脫下來(lái)，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7· 6 透析 12 小時(shí)；
(2)腸激酶處理1μ I的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20°C，20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6的條件下8h可以完全切割融合蛋白；
(3)親和層析二將上述處理過(guò)的重組Exendin-4結(jié)合在鎳柱上,先用起始緩沖液沖洗脫磷酸鹽緩沖液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍干燥，得到重組的艾塞那肽。由于艾塞那肽是一個(gè)分子量比較小的多肽，并不適合用大分子蛋白的體系進(jìn)行表達(dá)，所以我們采用專(zhuān)門(mén)用來(lái)改造后的生產(chǎn)多肽表達(dá)體系pET-31b ( + )質(zhì)粒和E. Coli(DE3) PlyS進(jìn)行生產(chǎn)，采用這個(gè)體系有以下優(yōu)點(diǎn)pET_31b ( + )是一個(gè)生產(chǎn)多肽的質(zhì)粒，目的多肽和KSI融合蛋白一起表達(dá)，形成了包涵體，可以避免生產(chǎn)的多肽被大腸桿菌體內(nèi)的蛋白水解酶水解，但是這對(duì)生產(chǎn)Exendin-4來(lái)說(shuō)是個(gè)很大的缺點(diǎn)，如果讓Exendin-4首先生成包涵體的形式然后再?gòu)?fù)性會(huì)造成純化成本的大大提高和活性的難以恢復(fù)，所以我們對(duì)pET-3Ib ( + )進(jìn)行了改造，將pET-31b ( + )中的KSI融合蛋白序列完全刪除，同時(shí)刪除蛋氨酸裂解位點(diǎn)(ALWN切割位點(diǎn))和C末端(多肽羧基端的)組氨酸標(biāo)記(His6-tag)以及終止子，在刪除的位置，取代以蛋氨酸+ His6-tag+GBl突變序列+腸激酶裂解序列，我們將改造的pET-3Ib ( + )形成的新質(zhì)粒重新命名為Mag2010,有了這個(gè)質(zhì)粒,我們首先取得Exendin-4的原始序列，然后按照大腸桿菌對(duì)于遺傳密碼子的偏好進(jìn)行了改造，采用適合大腸桿菌表達(dá)的遺傳序列，人工合成改造的Exendin-4的全序列,然后克隆島HJC57質(zhì)粒中進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的Exendin-4序列切割并純化，然后克隆到改造好的Mag2010質(zhì)粒中，并在C末端添加雙重終止子，這么做的好處是利用了 pET-31b(+)本身的可以大規(guī)模，高產(chǎn)量的生產(chǎn)多肽的優(yōu)點(diǎn)，保留了它的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子，克服了該質(zhì)粒容易形成包涵體的缺點(diǎn)，利用了腸激酶的切割特性在目的蛋白的N末端進(jìn)行切割，切割后的蛋白質(zhì)完全是具有天然序列的Exendin-4。利用大腸桿菌E. Coli BL21 (DE3)PlyS表達(dá)體系的原因在于Exendin-4沒(méi)有需要糖基化修飾等翻譯后修飾，DNA轉(zhuǎn)錄時(shí)也不需要轉(zhuǎn)錄后修飾，所以特別適合用大腸桿菌體系進(jìn)行生產(chǎn)，再加上我們克服了形成包涵體的問(wèn)題，而E. Coli BL21(DE3)PlyS的優(yōu)點(diǎn)在于可以大量表達(dá)外源蛋白，而且耐外源蛋白等毒素的干擾。本發(fā)明通過(guò)連接GBl標(biāo)記融合蛋白將艾塞那肽有90%的形成包涵體的可能性變成了 90%的形成可溶性蛋白。實(shí)驗(yàn)證明，絕大部分重組產(chǎn)生的艾塞那肽都處于可溶蛋白中。在國(guó)內(nèi)外進(jìn)行的艾塞那肽表達(dá)的體系中，很多人采用了 His6-Thioredoxin A(TrxA)融合蛋白和Exendin-4進(jìn)行融合表達(dá)，融合蛋白分子量為14. 7+4. 2=18. 9kd,exendin在融合蛋白中的比率為4. 2/18. 9=22. 2%.我們采用了自身分子量較小的GBl和Exendin-4進(jìn)行融合表達(dá),融合蛋白分子量為14. 7+4. 2=18. 9kd, exendin在融合蛋白中的比率為4. 2/11. 9=35. 3%。也就是說(shuō)，Exendin-4在融合蛋白中的比重大大增加了，在類(lèi)似的體系下，假如表達(dá)的融合蛋白總量相等，那么exendin-4在我們的體系中產(chǎn)量是其他體系的I. 59倍。本發(fā)明采用GBl和His-tag雙標(biāo)記的體系使得在純化過(guò)程中既可以采用鎳柱親和 層析，又可以采用GBl親和層析，相對(duì)于其他的純化方法，可以有更多的純化選擇方式。在現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道中，產(chǎn)量很低，最多的也就是28毫克/升的產(chǎn)量，利用本發(fā)明的發(fā)酵體系，我們可以達(dá)到500毫克/升的產(chǎn)率，這個(gè)產(chǎn)量為目前發(fā)酵工藝的20倍左右，所以規(guī)模化生產(chǎn)后可以大大降低成本。對(duì)于艾塞那肽類(lèi)的藥物成本價(jià)格降低和藥物的普及有著難以估量的意義，就像重組人胰島素開(kāi)發(fā)成功后對(duì)于胰島素的普及那樣有著重要的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝相對(duì)于目前的工藝有著顯著的特點(diǎn)產(chǎn)量可以達(dá)到500mg/升以上，比目前最先進(jìn)的工藝產(chǎn)量提高了 20倍，且均為可溶性蛋白，在生產(chǎn)過(guò)程中，我們采用了本公司獨(dú)特具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的的發(fā)酵工藝，產(chǎn)量大大提高，我們采用的雙重親和純化工藝，配合傳統(tǒng)的純化方法，純化效率有了極大的提高，前期粗提取的純化，減輕了后繼純化的壓力，降低了純化的成本。


圖I發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌生長(zhǎng)曲線圖。圖2是發(fā)酵過(guò)程參數(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果圖。圖3是質(zhì)粒的穩(wěn)定性分析結(jié)果圖。圖4是質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)含量圖。圖5是活性細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果圖。圖6是聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。一、工程菌的構(gòu)建
(I)重組Exendin — 4多肽基因序列的人工合成根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性，設(shè)計(jì)編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No. I所示的目的基因；合成后的基因克隆進(jìn)質(zhì)粒HJC57中，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 a中進(jìn)行擴(kuò)增,然后用EZ Bioresearch公司的質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行純化，切割后的目的基因出純化備用。(2)MAG2010 質(zhì)粒MAG2010 質(zhì)粒取 pET31b(+)質(zhì)粒，切割掉 SEQ ID No. 2 所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID No. 3所示的基因，刪除限制性內(nèi)切酶AlwnI酶切位點(diǎn)和蛋氨酸和后繼序列，取代以腸激酶酶切位點(diǎn)和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標(biāo)記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標(biāo)記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子；構(gòu)建的質(zhì)粒順序?yàn)榈鞍彼峋幋a序列+6XHis_tag編碼序列+ GB-I編碼序列+腸激酶酶切位點(diǎn)編碼序列+和目的蛋白的基因+甘氨酸編碼+雙終止子。
(3)工程菌的構(gòu)建按照啟動(dòng)子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點(diǎn)-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經(jīng)切割好的MAG2010質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質(zhì)粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉(zhuǎn)化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌體，篩選陽(yáng)性克隆，作為重組Exendin-4融合表達(dá)的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。亞克隆所用的質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，大腸桿菌DH5 a和BL21 (DE3)PlyS分別購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司公司和紅葉生物科技有限公司，所用的限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物(Takara)，腸激酶購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司(Sigma),質(zhì)粒提取試劑盒采用本公司銷(xiāo)售的美國(guó)EZ Bioresearch小量質(zhì)粒提取試劑盒。二、工程菌的發(fā)酵表達(dá)
I、種子活化
(I)種子活化取凍存的工程菌劃線在含lOOul/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。挑選生長(zhǎng)良好的單菌落，接種于20ml LB培養(yǎng)液中(含AmplOOul/ml )，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。(2)種子液制備取活化種子，按5%接種量接種于200ml 2XYT培養(yǎng)液中(含Ampl00ul/ml)，37°C培養(yǎng) 6 小時(shí)。(3) 5L發(fā)酵罐發(fā)酵將種子液按5%接種量接種于裝有MMBL培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，370C，控制pH在7. O左右，通過(guò)通氣及轉(zhuǎn)速控制溶氧在30%。0D600為20左右時(shí)，加入IPTG至終濃度為O. 2mM，誘導(dǎo)10小時(shí)后下罐。離心，收集菌體。2、培養(yǎng)基配方
(1)LB液體培養(yǎng)基(一級(jí)搖瓶)
權(quán)利要求
1.一種重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，包括工程菌的構(gòu)建、工程菌的發(fā)酵表達(dá)和目的蛋白的純化，其特征在于所述的工程菌的構(gòu)建是按下述步驟進(jìn)行的 (1)重組Exendin— 4多肽基因序列的人工合成根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性，設(shè)計(jì)編碼Exendin — 4的核苷酸序列，改造為如SEQ ID No. I所示的目的基因； (2)MAG2010質(zhì)粒取pET31b(+)質(zhì)粒，切割掉SEQID No. 2所示KSI融合基因片段，更換為SEQ ID No. 3所示的基因，刪除限制性內(nèi)切酶AlwnI酶切位點(diǎn)和蛋氨酸和后繼序列，取代以腸激酶酶切位點(diǎn)和目的蛋白的基因，切割掉組氨酸標(biāo)記序列，在GBl蛋白的前面添加組氨酸標(biāo)記，在目的蛋白的羧基末端添加雙終止子； (3)工程菌的構(gòu)建按照啟動(dòng)子-6X組氨酸-GBl-tag-腸激酶的裂解位點(diǎn)-exedin-4-雙終止密碼子的順序得到的基因片段，利用CloneEZ試劑盒連接到已經(jīng)切割好的MAG2010質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pET-31 (b+) -Exendin-4,將重組質(zhì)粒pET-31 (b+) -Exendin-4 以 CaCl2 法轉(zhuǎn)化受菌體 BL21 (DE3) plays,在 37 °C 下在 LB 培 養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌體，篩選陽(yáng)性克隆，作為重組Exendin-4融合表達(dá)的工程菌pET-31 (b+)-Exendin-4/ BL21 (DE3) plays。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的工程菌的發(fā)酵表達(dá)包括下述步驟 (1)挑單菌落到裝有30mL目標(biāo)培養(yǎng)基中，3rC，200rpm活化過(guò)夜； (2)將30mL菌液接到200mL 2XYT培養(yǎng)基中，32°C，200rpm培養(yǎng)約2. 6 hr ； (3)以10%的接種量，接到5L MMBL培養(yǎng)基中，32°C，240rpm培養(yǎng)約3 hr ； (4)接到60L發(fā)酵培養(yǎng)基中； (5)控制生長(zhǎng)期pH為6.8 ;用攪拌速度及通氣量使DO ^ 10% ;待培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度降至O. 2g/L時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料；當(dāng)OD55tl達(dá)到10左右時(shí)加入13 mL IM IPTG誘導(dǎo)，終濃度為O. 2mM,把pH緩慢調(diào)至7. 00,繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)后結(jié)束。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的目的蛋白的純化步驟采用離子交換層析-柱層析-三明治型的親和層析進(jìn)行分離和純化；該工程菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化得到的重組艾塞那肽的產(chǎn)量達(dá)到500毫克/升的產(chǎn)率。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的三明治型的親和層析包括親和層析一、酶裂解和親和層析二，具體步驟如下 (1)親和層析一采用GE公司的IgG-sepharose-fast flow column,首先用3個(gè)柱體積的50 mM Tris, pH 7. 5,150 mM NaCI的緩沖液平衡柱子，然后用將用相同緩沖液透析過(guò)的蛋白質(zhì)上柱，用I倍體積上述緩沖液洗然后用5mM乙酸鈉，pH5. O的緩沖液洗去未結(jié)合的雜質(zhì)，接著用500mM乙酸鈉，pH5. O的緩沖液將目的蛋白洗脫下來(lái)，收集、濃縮，用足量的20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl，ρΗ7· 6 透析 12 小時(shí)； (2)腸激酶處理1μ I的重組牛腸激酶輕鏈亞基在20°C，20mM Tris-HCl，IOOmM NaCl,pH7. 6的條件下8h可以完全切割融合蛋白； (3)親和層析二將上述處理過(guò)的重組Exendin-4結(jié)合在鎳柱上,先用起始緩沖液沖洗脫磷酸鹽緩沖液，保留洗脫組分，濃縮，冷凍干燥，得到重組的艾塞那肽。
全文摘要
一種重組艾塞那肽的生產(chǎn)工藝，通過(guò)對(duì)pET-31b(+)進(jìn)行了改造，將pET-31b(+)中的KSI融合蛋白序列完全刪除，同時(shí)刪除蛋氨酸裂解位點(diǎn)(ALWN切割位點(diǎn))和C末端(多肽羧基端的)組氨酸標(biāo)記(His6-tag)以及終止子,在刪除的位置，取代以蛋氨酸+His6-tag+GB1突變序列+腸激酶裂解序列，然后構(gòu)建工程菌pET-31(b+)-Exendin-4/BL21(DE3)plays。利用了pET-31b(+)本身的可以大規(guī)模，高產(chǎn)量的生產(chǎn)多肽的優(yōu)點(diǎn)，保留了它的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子，克服了目前其他生產(chǎn)工藝中該蛋白產(chǎn)物容易形成包涵體的缺點(diǎn)，利用了腸激酶的切割特性在目的蛋白的N末端進(jìn)行切割，切割后的蛋白質(zhì)完全是具有天然序列的Exendin-4。經(jīng)過(guò)工程菌的發(fā)酵表達(dá)和目的蛋白的純化后得到重組艾塞那肽。產(chǎn)量可以達(dá)到500mg/升以上，比目前最先進(jìn)的工藝產(chǎn)量提高了20倍，且均為可溶性蛋白。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102618552SQ20121009455
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月1日
發(fā)明者孟建軍, 張嚴(yán)冬, 李相魯 申請(qǐng)人:東莞市麥亙生物科技有限公司