專(zhuān)利名稱(chēng)：采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種試劑盒及其制備方法，具體來(lái)說(shuō)是一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒。
背景技術(shù)：
舌形蟲(chóng)病是動(dòng)物源性人獸共患病。全球已知舌形蟲(chóng)約118種，寄生人體的舌形蟲(chóng)主要有6個(gè)屬10個(gè)種，分別為鋸齒舌形蟲(chóng)(Linguatula serrata)、腕帶蛇舌狀蟲(chóng)(Armillifer armillatus)、尖吻蝮蛇舌狀蟲(chóng)(A. aggkistrodontis)、串珠蛇舌狀蟲(chóng)(A. moniliformis)、 大蛇舌狀蟲(chóng)(A. grandis)、蜥虎賴(lài)?yán)嘞x(chóng)(Raillietiella hemidactyli)、辛辛那提萊佩舌蟲(chóng)(Leiperia cincinnalis)、口向尾蛇孑L 頭舌蟲(chóng)(Poroc印halus crotali)、瑟皮舌蟲(chóng) (P. Sebekia)和臺(tái)灣孔頭舌蟲(chóng)(P. taiwana)等。我國(guó)記載寄生人體的舌形蟲(chóng)有鋸齒舌形蟲(chóng)、 尖吻蝮蛇舌狀蟲(chóng)和臺(tái)灣孔頭舌蟲(chóng)。近年來(lái)，在我國(guó)臺(tái)灣、浙江、廣西都曾發(fā)現(xiàn)有多例尖吻蝮蛇舌狀蟲(chóng)感染人體的報(bào)道。盡管舌形蟲(chóng)病例數(shù)較少，但由于有疫源地的存在，人們各異的進(jìn)食習(xí)慣，為本病的感染建立了自然條件，人可成為尖吻蝮蛇舌狀蟲(chóng)的中間宿主，主要是由于人們飲用了被感染性蟲(chóng)卵污染的水源或生飲蛇血、蛇膽而感染。表現(xiàn)為幼蟲(chóng)寄生人體腸系膜和肝、脾、腎等臟器，引起多臟器彌漫性損傷，特別是肝、脾等重要的臟器，危害十分重大。 加上近20年來(lái)舌形蟲(chóng)病疫區(qū)的擴(kuò)大，新致病種的發(fā)現(xiàn)和致命病例的增加，使舌形蟲(chóng)這一罕見(jiàn)寄生蟲(chóng)病的診斷提出了新的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，所述的這種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒要解決現(xiàn)有技術(shù)中無(wú)法檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病現(xiàn)癥感染的方法。本發(fā)明提供了一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，其特征在于包括兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體。進(jìn)一步的，所述的試劑盒還包括硝酸纖維薄膜、1 %小牛血清白蛋白的PBST溶液、 PBST洗滌液、底物顯色液、陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本組成和聚乙烯反應(yīng)板。進(jìn)一步的，所述的1 %小牛血清白蛋白的PBST溶液由小牛血清白蛋白和PBST洗滌液組成，所述的小牛血清白蛋白和PBST洗滌液的重量比為1 99。進(jìn)一步的，所述的PBST洗滌液由氯化鈉、KH2PO4, Na2HPO4, KC1、吐溫-20和水組成，在配制PBST洗滌液的過(guò)程中，先配制一個(gè)基液的步驟，所述的基液由氯化鈉、ΚΗ2Ρ04、 Na2HPO4^KCl和水組成，所述的氯化鈉在所述的基液中的重量百分比為0. 8%，所述的KH2PO4 在所述的基液的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在所述的基液中的重量百分比為 0. 29%,所述的KCl在所述的基液中的重量百分比為0. 02%，余量為水，配制好基液后，再加入吐溫-20，每100ml中加入0. 5ml吐溫-20，所述的PBST洗滌液的pH值為7. 4。
進(jìn)一步的，所述的底物顯色液由顯色液A液、顯色液B液和顯色液C液組成，所述的顯色液A液由3-3- 二氨基鄰苯胺、氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、KCl和水組成，所述的3_3_ 二氨基鄰苯胺在顯色液A液中的重量百分比為0. 1%，所述的氯化鈉在顯色液A液中的重量百分比為0. 8 %，所述的KH2PO4在顯色液A液中的重量百分比為0. 02 %，所述的Na2HPO4在顯色液A液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在顯色液A液中的重量百分比為0. 02%，余量為顯色液A液中的水，所述的顯色液B液由4-氯-1-萘酚、甲醇、氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、 KCl和水組成，所述的4-氯-1-萘酚在顯色液B液中的重量百分比為0. 05%，所述的甲醇在顯色液B液中的重量百分比為20%，所述的氯化鈉在顯色液B液中的重量百分比為0.8%， 所述的KH2PO4在顯色液B液中的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在顯色液B液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在顯色液B液中的重量百分比為0. 02%，余量為顯色液 B液中的水；所述的顯色液C液為過(guò)氧化氫的水溶液，所述的過(guò)氧化氫在水溶液中的重量百分比濃度為30%。進(jìn)一步的，所述的底物顯示液由第一試劑和第二試劑組成，第一試劑為 4-氯-1-萘酚試劑，第二試劑為3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺試劑。本發(fā)明還提供了上述的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，包括一個(gè)制備抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的步驟，一個(gè)制備兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟，一個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟。進(jìn)一步的，在一個(gè)制備抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的步驟中，從感染尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)蟲(chóng)卵3-5個(gè)月的小鼠腹部分離取幼蟲(chóng)，研磨后超聲粉碎，制備幼蟲(chóng)可溶性抗原。進(jìn)一步的，在一個(gè)制備兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟中，用尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后對(duì)家兔進(jìn)行3次免疫，收取兔血清，提取并純化多抗。進(jìn)一步的，在一個(gè)制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟中，采用ELISA法或雙擴(kuò)散法檢測(cè)兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的效價(jià)，用過(guò)碘酸鹽標(biāo)記法標(biāo)酶。進(jìn)一步的，所述的陽(yáng)性對(duì)照樣本為尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病病人血清，所述的陰性對(duì)照樣本為正常人血清。本發(fā)明的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的原理是將兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體(兔抗-Aag-IgG)點(diǎn)于硝酸纖維薄膜上，即特異性抗體結(jié)合到固相載體(硝酸纖維薄膜)上形成固相抗體，加待檢血清，多抗與待檢血清中的相應(yīng)抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物，洗滌后加酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)多克隆抗體 (HRP-Aag-IgG)，酶標(biāo)記的抗體(HRP-Aag-IgG)與免疫復(fù)合物中抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗體-抗原-固相抗體復(fù)合物，加底物顯色，判斷抗原含量。尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗原免疫家兔獲得了抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體 (Aag-IgG)，用多抗檢測(cè)小鼠血清中循環(huán)抗原，證實(shí)小鼠在感染后第2周即可檢測(cè)到其體內(nèi)的循環(huán)抗原，可作為檢測(cè)現(xiàn)癥感染、療效考核、及藥物篩選的依據(jù)。本發(fā)明用多克隆抗體(Aag-IgG)測(cè)定循環(huán)抗原具有以下優(yōu)點(diǎn)⑴在抗體出現(xiàn)前， 已可測(cè)出抗原，有利于做出早期診斷。(2)循環(huán)抗原的含量與宿主體內(nèi)寄生蟲(chóng)數(shù)量成正比，
5有助于預(yù)后的判定。(3)當(dāng)體內(nèi)蟲(chóng)體死亡后，循環(huán)抗原迅速消失，可用于療效考核。本發(fā)明應(yīng)用特異性抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)的多克隆抗體，研制dot-ELISA法檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原試劑盒。該試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速；敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好。本發(fā)明適合醫(yī)院檢驗(yàn)科、疾病防控中心、社康中心、私人診所等部門(mén)用于尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病的臨床現(xiàn)癥感染的輔助診斷、療效考核和藥物篩選，具有很高的實(shí)用價(jià)值和可觀的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。本發(fā)明的采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒應(yīng)用尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)抗原免疫家兔獲得多克隆抗體，檢測(cè)患者血清中循環(huán)抗原(CAg)的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(dot-ELISA)，可作為檢測(cè)現(xiàn)癥感染和療效考核的依據(jù)，本發(fā)明建立的 dot-ELISA法敏感性高、特異性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病的快速診斷、藥物篩選和療效考核。


圖1是采用本發(fā)明的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病的原理圖。
具體實(shí)施例方式試劑和材料來(lái)源小牛血清白蛋白(購(gòu)白上海生物制品所)。實(shí)施例1 一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒本發(fā)明提供了一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒包括兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體(兔抗-Aag-IgG)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)多克隆抗體(HRP-Aag-IgG)、硝酸纖維薄膜、小牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液、PBST洗滌液、底物顯色液、陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本組成和96孔聚乙烯反應(yīng)板。進(jìn)一步的，所述的1 %小牛血清白蛋白的PBST溶液由小牛血清白蛋白和PBST洗滌液組成，所述的小牛血清白蛋白和PBST洗滌液的重量比為1 99。進(jìn)一步的，所述的PBST洗滌液由氯化鈉、KH2P04、Nei2HP04、KC1、吐溫-20和水組成， 在配制PBST洗滌液的過(guò)程中，包括一個(gè)先配制基液的步驟，所述的基液由氯化鈉、KH2PO4, Na2HPO4^KCl和水組成，所述的氯化鈉在所述的基液中的重量百分比為0. 8%，所述的KH2PO4 在所述的基液的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在所述的基液中的重量百分比為 0. 29%,所述的KCl在所述的基液中的重量百分比為0. 02%，余量為水，配制好基液后，再加入吐溫-20，每IOOml中加入0. 5ml吐溫-20，所述的PBST洗滌液的PH值為7. 4。進(jìn)一步的，所述的底物顯色液由顯色液A液、顯色液B液和顯色液C液組成，所述的顯色液A液由3-3- 二氨基鄰苯胺、氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、KCl和水組成，所述的3_3_ 二氨基鄰苯胺在顯色液A液中的重量百分比為0. 1%，所述的氯化鈉在顯色液A液中的重量百分比為0. 8 %，所述的KH2PO4在顯色液A液中的重量百分比為0. 02 %，所述的Na2HPO4在顯色液A液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在顯色液A液中的重量百分比為0. 02%，余量為顯色液A液中的水，所述的顯色液B液由4-氯-1-萘酚、甲醇、氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、 KCl和水組成，所述的4-氯-1-萘酚在顯色液B液中的重量百分比為0. 05%，所述的甲醇在顯色液B液中的重量百分比為20%，所述的氯化鈉在顯色液B液中的重量百分比為0.8%，
6所述的KH2PO4在顯色液B液中的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在顯色液B液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在顯色液B液中的重量百分比為0. 02%，余量為顯色液 B液中的水；所述的顯色液C液為過(guò)氧化氫的水溶液，所述的過(guò)氧化氫在水溶液中的重量百分比濃度為30%。具體的，采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，取A液+B液等量混合后，每100毫升混合液中加C液40ul混合后使用。進(jìn)一步的，所述的底物顯示液由第一試劑和第二試劑組成，第一試劑為 4-氯-1-萘酚試劑，第二試劑為3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺試劑。使用時(shí)4-氯-1-萘酚試劑與 3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺試劑等量混合使用。進(jìn)一步的，所述的陽(yáng)性對(duì)照樣本為尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病病人血清，所述的陰性對(duì)照樣本為正常人血清。實(shí)施例2本發(fā)明還提供了一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，包括一個(gè)制備抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的步驟，一個(gè)制備兔抗-Aag-IgG的步驟，一個(gè)酶標(biāo)記的抗體(HRP-Aag-IgG)的步驟，還包括一個(gè)在試劑盒中放置硝酸纖維薄膜、小牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液、PBST洗滌液、底物顯色液、陽(yáng)性對(duì)照樣本、陰性對(duì)照樣本、聚乙烯反應(yīng)板的步驟。進(jìn)一步的，在一個(gè)制備尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的步驟中，從感染尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)蟲(chóng)卵3-5個(gè)月的小鼠腹部分離取幼蟲(chóng)，制備幼蟲(chóng)可溶性抗原。進(jìn)一步的，在一個(gè)制備兔抗-Aag-IgG的步驟中，用尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原(AagA)與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后對(duì)家兔進(jìn)行3次免疫，收取兔血清，純化多抗(兔抗-Aag-IgG)。進(jìn)一步的，在一個(gè)制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟中，采用ELISA法或雙擴(kuò)散法檢測(cè)兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的效價(jià)，用過(guò)碘酸鹽標(biāo)記法標(biāo)酶(HRP-兔抗-Aag-IgG)。具體的1.尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的制備和兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼多克隆抗體 (Aag-IgG)的收集步驟如下從感染尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)蟲(chóng)卵4個(gè)月的小鼠腹部分離取幼蟲(chóng)，制備幼蟲(chóng)可溶性抗原，測(cè)得蛋白含量為7. 58mg/ml。用尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原(AagA) IOOyg與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后對(duì)家兔進(jìn)行背多點(diǎn)免疫，4周后用AagA抗原與等體積弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫一次，劑量同上。一共進(jìn)行三次免疫。ELISA法測(cè)得家兔免疫后的抗體水平為 1 320000。采用鹽析法純化多抗(兔抗-Aag-IgG)，ELISA測(cè)得多抗的效價(jià)為1 80000， 雙擴(kuò)散法為1 128，經(jīng)飽和硫酸胺提純，用二乙氨基乙基纖維素(DEA^纖維素離子交換柱層析純化，得到抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)的多克隆抗體(Aag-IgG)。(1)飽和硫酸銨溶液的配制500g硫酸銨加入500ml蒸餾水中，加熱至完全溶解， 室溫過(guò)夜，析出的結(jié)晶任其留在瓶中。臨用前取所需的量，用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.8。(2)鹽析吸取IOml兔血清(兔抗-PW-IgG)移入小燒杯中，在攪拌下，滴加飽和硫酸銨溶液5. Oml ；繼續(xù)緩慢攪拌30min ； 10000r/min離心15min ；棄去上清液，沉淀物用1/3飽和度硫酸銨懸浮，攪拌作用30min，同法離心；重復(fù)前一步1 2次；沉淀物溶于1. 5ml PBS (0. 01mol/L pH7. 2)或 Tris-HCl 緩沖液中。(3)脫鹽將鹽析樣品過(guò)kphadex G_50層析柱，以PBS或Tris-HCl緩沖液作為平衡液和洗脫液，流速lml/min。第一個(gè)蛋白峰即為脫鹽的抗體溶液。透析法是將透析袋于2% NaHC03, lmmol/L EDTA溶液中煮lOmin，用蒸餾水清洗透析袋內(nèi)外表面，再用蒸餾水煮透析袋lOmin，冷至室溫即可使用(并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4°C保存?zhèn)溆?。將鹽析樣品裝入透析袋中，對(duì)50 100倍體積的PBS或Tris-HCl緩沖液透析) 12 M小時(shí)，其間更換5次透析液，用萘氏試劑(碘化汞11. 5g，碘化鉀8g，加蒸餾水50ml，待溶解后， 再加20% NaOH 50ml)檢測(cè)，直至透析外液無(wú)黃色物形成為止。(4)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定(Pr) (mg/ml) = (1. 45X0D280-0. 74X0D260) X 稀釋倍數(shù)；或(Pr) = 0D280X稀釋倍數(shù)/32.酶標(biāo)記兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼多克隆抗體(HRP-Aag-IgG)制備采用過(guò)碘酸鹽標(biāo)記法標(biāo)酶(HRP-兔抗-PW-IgG)。所述的標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體的常用方法是過(guò)碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過(guò)碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG 氨基結(jié)合，形成khiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化鈉穩(wěn)定^^1 氏堿。其操作步驟如下①將5mg HRP 溶于 0. 5ml 0. lmol/L NaHC03 溶液中；加 0. 5mll0mmol/L NaI04 溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)；②加0. 75ml 10. lmol/L Na2C03 混勻；③加入0. 75ml兔血清(多抗)，混勻；④稱(chēng)取kphadex G25干粉0. 3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用(避光)3小時(shí)或4°C過(guò)夜；⑤用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加V20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30min ；再加入3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)(或4°C 過(guò)夜)；⑥將交聯(lián)物過(guò)kphadex G200或kpharose 6B O. 5 X 50cm)層析純化，分管收集第一峰；⑦酶結(jié)合物質(zhì)量鑒定酶活性和抗體活性的測(cè)定，應(yīng)用ELISA法、免疫擴(kuò)散、 DAB-H202顯色反應(yīng)測(cè)定酶結(jié)合物的酶活性，抗體活性及效價(jià)、特異性；⑧HRP抗體結(jié)合物的保存加入等量甘油后，小量分裝_20°C存放，防止反復(fù)凍融； 或加入等量60%甘油4°C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會(huì)影響酶活性，必要時(shí)還可以?xún)龈杀４?，以BSA或脫脂牛奶作保護(hù)劑。實(shí)施例3本發(fā)明的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的操作步驟如下(原理如圖1所示)a)將兔抗-Aag-IgG稀釋成200 μ g/ml，用點(diǎn)樣器吸取1 μ 1抗體于硝酸纖維薄膜上，室溫包被10分鐘。
b)封閉將包被好的膜片浸入小牛血清白蛋白(BSA)的PBST溶液。37°C，15 分鐘。c)洗滌將封好的膜用用洗滌液洗3次，每次3分鐘涼干，即為“快診膜”。d)被檢抗原“快診膜”按方格剪下，光面向上，放入96孔聚乙烯反應(yīng)板孔內(nèi)，每孔加被檢血清的血清100 μ 1，同時(shí)設(shè)空白(PBS)、陰性和陽(yáng)性樣品對(duì)照。370C Ih0e)洗滌同(3)f)酶標(biāo)記HRP-Aag-IgG 將酶標(biāo)抗體1 100稀釋后，每孔加100 μ 1，37°C Ih0g)洗滌同(3)h)底物取底物顯色液A液5ml、底物顯色液B液5ml、底物顯色液C液如1，混合后每個(gè)反應(yīng)孔加IOOul，室溫避光lOmin，蒸餾水終止反應(yīng)。)判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)顯色反應(yīng)有無(wú)或顏色深淺，進(jìn)行定性或半定量；斑點(diǎn)呈現(xiàn)黃蘭色斑點(diǎn)判斷為陽(yáng)性，不出現(xiàn)顏色則為陰性。+++斑點(diǎn)呈深黃蘭色++斑點(diǎn)呈黃蘭色+斑點(diǎn)呈淡黃蘭色-無(wú)可見(jiàn)斑點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，其特征在于包括兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒， 其特征在于還包括硝酸纖維薄膜、小牛血清白蛋白的PBST溶液、PBST洗滌液、底物顯色液、陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本組成和聚乙烯反應(yīng)板。
3.如權(quán)利要求1所述特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，其特征在于所述的小牛血清白蛋白的PBST溶液由小牛血清白蛋白和PBST洗滌液組成，所述的小牛血清白蛋白和PBST洗滌液的重量比為1 99。
4.如權(quán)利要求1或3所述特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，其特征在于所述的PBST洗滌液由氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、KCl、吐溫-20和水組成，在配制PBST洗滌液的過(guò)程中，先配制一個(gè)基液的步驟，所述的基液由氯化鈉、KH2PO4, Na2HPO4, KCl和水組成，所述的氯化鈉在所述的基液中的重量百分比為0. 8%，所述的KH2PO4在所述的基液的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在所述的基液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在所述的基液中的重量百分比為0. 02%，余量為水，配制好基液后，再加入吐溫-20，每IOOml 中加入0. 5ml吐溫-20，所述的PBST洗滌液的pH值為7. 4。
5.如權(quán)利要求2所述特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中的底物顯色液由顯色液A液、顯色液B液和顯色液C液組成，所述的顯色液A液由3-3- 二氨基鄰苯胺、氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、KCl和水組成，所述的3_3_ 二氨基鄰苯胺在顯色液A液中的重量百分比為0. 1%，所述的氯化鈉在顯色液A液中的重量百分比為0. 8%，所述的KH2PO4在顯色液A液中的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在顯色液 A液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在顯色液A液中的重量百分比為0. 02%，余量為顯色液A液中的水，所述的顯色液B液由4-氯-1-萘酚、甲醇、氯化鈉、KH2P04、Na2HP04、KCl 和水組成，所述的4-氯-1-萘酚在顯色液B液中的重量百分比為0. 05%，所述的甲醇在顯色液B液中的重量百分比為20%，所述的氯化鈉在顯色液B液中的重量百分比為0.8%， 所述的KH2PO4在顯色液B液中的重量百分比為0. 02%，所述的Na2HPO4在顯色液B液中的重量百分比為0.四％，所述的KCl在顯色液B液中的重量百分比為0. 02%，余量為顯色液 B液中的水；所述的顯色液C液為過(guò)氧化氫的水溶液，所述的過(guò)氧化氫在水溶液中的重量百分比濃度為30%。
6.如權(quán)利要求2所述的特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于所述的底物顯示液由第一試劑和第二試劑組成，第一試劑為4-氯-1-萘酚試劑，第二試劑為3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺試劑。
7.權(quán)利要求1所述的特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法， 其特征在于包括一個(gè)制備抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的步驟，一個(gè)制備兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟，一個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于在一個(gè)制備抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原的步驟中，從感染尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)蟲(chóng)卵3-5個(gè)月的小鼠腹部分離取幼蟲(chóng)，研磨后超聲粉碎，制備幼蟲(chóng)可溶性抗原。
9.如權(quán)利要求7所述的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于在一個(gè)制備兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟中，用尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)可溶性抗原與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后對(duì)家兔進(jìn)行3次免疫，收取兔血清，提取并純化多抗。
10.如權(quán)利要求7所述的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于在一個(gè)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的步驟中，采用ELISA法或雙擴(kuò)散法檢測(cè)兔抗尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)幼蟲(chóng)多克隆抗體的效價(jià)， 用過(guò)碘酸鹽標(biāo)記法標(biāo)酶。
11.如權(quán)利要求7所述的一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照樣本為尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病病人血清，所述的陰性對(duì)照樣本為正常人血清。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒，包括兔抗-Aag-IgG、酶標(biāo)記的抗體(HRP-Aag-IgG)、硝酸纖維薄膜、1％小牛血清白蛋白的PBST溶液、PBST洗滌液、底物顯色液、陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本組成和聚乙烯反應(yīng)板。本發(fā)明還提供了一種采用特異性多抗檢測(cè)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)循環(huán)抗原的試劑盒的制備方法。本發(fā)明采用多克隆抗體測(cè)定循環(huán)抗原有利于做出早期診斷，有助于預(yù)后的判定。當(dāng)體內(nèi)蟲(chóng)體死亡后，循環(huán)抗原迅速消失，可用于療效考核。本發(fā)明的試劑盒敏感性高、特異性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)尖吻蝮蛇舌形蟲(chóng)病的快速診斷、藥物篩選和療效考核。
文檔編號(hào)G01N33/544GK102288754SQ20101050238
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者周曉農(nóng), 張永年, 李 浩, 陳家旭, 陳韶紅 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所