一種基于sers技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光譜學(xué)和生物分析領(lǐng)域，具體涉及一種基于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置的設(shè)計(jì)及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著環(huán)境問(wèn)題的日益嚴(yán)重，我們所處在一個(gè)極易被病毒感染的環(huán)境中。非典、流感、MERS等病毒讓人人自危，大部分病毒都是存在于血液當(dāng)中，如何檢測(cè)血清中的某種病毒含量的方法在早期診斷和曝光后治療診斷有著重要作用。已知利用抗原抗體反應(yīng)用于測(cè)量血清病毒細(xì)胞的檢測(cè)手段有免疫熒光顯微鏡法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)，但存在一定缺陷。免疫熒光顯微鏡成本高，用于定量測(cè)試有一定困難，且技術(shù)程序較復(fù)雜。酶聯(lián)免疫測(cè)定法較難尋找合適的酶催化底物，使其在應(yīng)用上有一定困難，而且顯示對(duì)比存在較大的誤差。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)手段困難，對(duì)儀器設(shè)備要求過(guò)高，操作繁瑣，價(jià)格昂貴。這些缺點(diǎn)限制了這些手段的應(yīng)用，只能用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
[0003]表面增強(qiáng)拉曼散射(簡(jiǎn)稱為SERS)是指在粗糙的金屬(如金、銀、銅)的表面或溶膠體系中，由于樣品表面或近表面的電磁場(chǎng)的增強(qiáng)導(dǎo)致分子的拉曼散射信號(hào)較普通拉曼散射信號(hào)大大增強(qiáng)的現(xiàn)象。近年來(lái)，SERS已經(jīng)成為一種成熟的分子振動(dòng)光譜技術(shù)，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、材料和生命科學(xué)等領(lǐng)域。SERS所得到的拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)度比常規(guī)拉曼光譜信號(hào)強(qiáng)度高出16以上的數(shù)量級(jí)，為痕量物質(zhì)檢測(cè)開(kāi)拓了一個(gè)新的技術(shù)方向。微流體技術(shù)是指流體在微米級(jí)別的通道中對(duì)其操控的技術(shù)，通過(guò)對(duì)微流體系統(tǒng)所需的器件包括栗、閥、混合器、過(guò)濾器等的加工，將裝置加工成一塊芯片大小。微流控裝置具有液體流動(dòng)可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度成十倍上百倍地提高等特點(diǎn)。近年來(lái)微流體技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)在化學(xué)、醫(yī)藥及生命科學(xué)等領(lǐng)域上造成革命性的沖擊。利用微流技術(shù)與SERS技術(shù)手段聯(lián)用，可以在生物分子檢測(cè)和痕量樣品檢測(cè)應(yīng)用上開(kāi)啟一個(gè)新的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提出一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置。該裝置通過(guò)對(duì)人體血清中某些病毒細(xì)菌的特異性抗原含量的測(cè)定，可以判斷人體血清中這些病毒細(xì)菌的含量是否超過(guò)人體健康標(biāo)準(zhǔn)。待測(cè)試人體血清樣本、結(jié)合了特異性抗體的免疫磁珠溶液、結(jié)合待測(cè)血清抗原的核殼結(jié)構(gòu)金納米粒子溶液分別通過(guò)其對(duì)應(yīng)的微流通道入口注入到微流裝置中，通過(guò)安裝在入口處的微流栗控制微流通道中的流速。在微流裝置中，血清中的病毒抗原和金納米顆粒攜帶的抗原與磁珠攜帶的抗體發(fā)生免疫復(fù)合反應(yīng)，生成的免疫復(fù)合物鍵合在磁珠上。在微流裝置末端，通過(guò)控制SERS檢測(cè)單元上的通電螺線管來(lái)吸附鍵合了特異性抗原抗體復(fù)合物的磁珠，聚合物吸附在離SERS檢測(cè)單元最近的微流通道處。對(duì)磁珠攜帶的免疫復(fù)合物進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試，并對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，最終得到血清中待測(cè)抗原的濃度。
[0005]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)人體血清中特異性抗原的微流裝置，主要由待測(cè)血清樣品通道入口(I)、結(jié)合了特異性抗體的免疫磁珠通道入口
(2)、結(jié)合了待測(cè)血清抗原的核殼結(jié)構(gòu)金納米粒子通道入口(3)、微流裝置通道出口(4)、SERS檢測(cè)單元(5)、傳感控制器(6)組成。該微流裝置為三明治結(jié)構(gòu)，最下層為基底層，中間層為微流通道層，上層為封裝層。每個(gè)微流通道入口與相應(yīng)的微流導(dǎo)管相連；待測(cè)血清樣品通道口(I)、免疫磁珠通道口(2)、金納米粒子通道口(3)處安裝了控制通道中流速的微流栗。微流通道采用螺線管形狀設(shè)計(jì)。在微流裝置底部，分布著SERS檢測(cè)單元(5)和微流裝置傳感控制器(6)，二者均貼片放置在封裝層上。
[0006]進(jìn)一步地，在本發(fā)明中，該微流通道底層和封裝層為使用石英層或聚乙烯構(gòu)成的透明結(jié)構(gòu)；微流通道層使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料加工形成方形通道，所有通道為200-250 μm 寬、80-100 μm 高。
[0007]進(jìn)一步地，在本發(fā)明中，SERS檢測(cè)單元包含一個(gè)可控制開(kāi)關(guān)的通電螺線管，通過(guò)開(kāi)關(guān)來(lái)控制SERS檢測(cè)單元對(duì)免疫復(fù)合物的聚集。
[0008]進(jìn)一步地，在本發(fā)明中，傳感控制器包含中心控制芯片、顯示流速的LED顯示屏、微流栗組成，傳感控制器通過(guò)控制微流栗的轉(zhuǎn)速使得微流通道入口處三種液體流速一致，達(dá)到最佳免疫反應(yīng)條件。
[0009]—種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置，使用方法包括以下步驟:
[0010]I)微流裝置制備:以石英玻璃為底層，在上面涂抹一層光刻膠，用軟光刻技術(shù)在光刻膠上刻出微流通道形狀，使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)處理生成微流通道層，加熱固化底層和中間層，所有微流通道為200-250 μm寬、80-100 μm高，通過(guò)熱壓法對(duì)微流通道層和相應(yīng)的最上層進(jìn)行封裝，在微流裝置封裝層上貼片放置SERS檢測(cè)單元和傳感控制器；
[0011]2)制備結(jié)合了待測(cè)抗原的核殼結(jié)構(gòu)的金納米粒子:通過(guò)氯金酸鹽和檸檬酸鈉水溶液法得到粒徑為50nm左右的金納米粒子，然后得到金膠體納米粒子與正硅酸乙酯(TEOS)和氨水反應(yīng)，生成具有金核二氧化硅殼的納米粒子，二氧化硅殼厚度約為2nm ;使用物理或化學(xué)方式對(duì)納米粒子處理，使其表面修飾待測(cè)血清中的抗原；
[0012]3)制備結(jié)合了特定抗體的免疫磁珠:I μ m大小磁珠通過(guò)購(gòu)買獲得，對(duì)磁珠進(jìn)行生物保護(hù)處理，在其表面包裹一層生物免疫膜，如鏈霉親和素，用生物方法使特定抗體修飾在磁珠表面，制備磁珠保存在生理溶液中；
[0013]4)打開(kāi)傳感控制器開(kāi)關(guān)，分別在各個(gè)微流通道入口通入相對(duì)應(yīng)的微流液，微流液在微流通道內(nèi)流動(dòng)I分鐘后調(diào)控傳感控制來(lái)控制好微流液流速，打開(kāi)SERS檢測(cè)單元開(kāi)關(guān)，當(dāng)離SERS檢測(cè)單元最近的微流通道內(nèi)聚集大量黑色磁性復(fù)合物，關(guān)閉傳感控制器停止微流液的流動(dòng)；將微流裝置置于拉曼光譜儀的樣品池中，對(duì)聚集的復(fù)合物進(jìn)行不同位置的信號(hào)測(cè)試；
[0014]5)數(shù)據(jù)處理，得到結(jié)果:通過(guò)得到的SERS光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，得到該檢測(cè)特異性抗原的濃度。
[0015]本發(fā)明的有益效果如下:
[0016]I)本發(fā)明設(shè)計(jì)的一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置，整個(gè)裝置大小約為一個(gè)火柴盒大小，便于測(cè)試和攜帶，可直接置于拉曼樣品池中檢測(cè)。通過(guò)在待測(cè)區(qū)域?qū)γ庖邚?fù)合物進(jìn)行SERS光譜測(cè)試，可以獲得高重復(fù)高特異性的SERS信號(hào)，為生物分子檢測(cè)開(kāi)拓了一個(gè)新思路。
[0017]2)通過(guò)SERS技術(shù)與微流技術(shù)聯(lián)用，用于檢測(cè)血清中特異性抗原，利用本裝置檢測(cè)，具有檢測(cè)耗時(shí)少，檢測(cè)樣品少，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，微流裝置可重復(fù)利用的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置的平面結(jié)構(gòu)圖；
[0019]圖2為一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置的3維圖；
[0020]圖3為一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置檢測(cè)抗原流程圖；
[0021]圖4為待測(cè)抗原、免疫磁珠、金納米粒子發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)過(guò)程；
[0022]圖1中，I為待測(cè)血清樣品通道入口 ；2為結(jié)合了特定抗體的免疫磁珠通道入口 ；3為結(jié)合了待測(cè)抗原的核殼結(jié)構(gòu)金納米粒子通道入口 ；4為微流通道出口 ；5為SERS檢測(cè)單元；6為傳感控制器；61、62、63為傳感控制器內(nèi)的微流栗。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合微流裝置圖對(duì)本發(fā)明結(jié)構(gòu)原理和工作原理作更進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0024]如圖1和圖2，一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置，主要由待測(cè)血清樣品通道口 1、與特定抗體結(jié)合的免疫磁珠通道口 2、與檢測(cè)抗原結(jié)合的核殼結(jié)構(gòu)金納米粒子通道口 3、微流通道出口 4、SERS檢測(cè)單元5，傳感控制器6組成。
[0025]圖3為一種基于SERS技術(shù)檢測(cè)血清中特異性抗原的微流裝置檢測(cè)抗原流程圖，首先打開(kāi)傳感控制器開(kāi)關(guān)，各微流通道入口流入相對(duì)應(yīng)的微流液，傳感控制器控制好各微流通道入口微流液的流速，微流液在微流通道內(nèi)流動(dòng)I分鐘后，打開(kāi)SERS檢測(cè)單元開(kāi)關(guān)，發(fā)現(xiàn)離SERS檢測(cè)單元最近的微流通道內(nèi)聚集了一層黑色的免疫復(fù)合物，當(dāng)免疫復(fù)合物肉眼觀察不在增多時(shí)，關(guān)閉傳感控制器停止微流液的流動(dòng)；將微流裝置置于拉曼光譜儀的樣品池中，對(duì)聚集的復(fù)合物進(jìn)行不同位置的信號(hào)測(cè)試，通過(guò)對(duì)SERS光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，得出待測(cè)血清中特異性抗原的濃度。
[0026]傳感控制器6通過(guò)微流栗61、62、63來(lái)控制好各微流通道內(nèi)微流液速度，檢測(cè)樣品血清通過(guò)I通道入口進(jìn)入微流裝置，結(jié)合了特定抗體免疫磁珠通過(guò)2通道入口進(jìn)入微流裝置，使得二者混合一段時(shí)間，初步發(fā)生抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，待測(cè)血清中的特異性抗原吸附在免疫磁珠上。反應(yīng)一定程度的免疫磁珠和與結(jié)合了待測(cè)血清抗原的核殼結(jié)構(gòu)金納米粒子進(jìn)一步免疫復(fù)合反應(yīng)，三者反應(yīng)形成一個(gè)聚集在一起的磁性免疫復(fù)合物，免疫復(fù)合反應(yīng)如圖4所示。當(dāng)微流液流經(jīng)微流裝置底部，微流液中的磁性免疫復(fù)合物由SERS檢測(cè)單元5分離，通過(guò)磁性吸附作用，使磁性免疫復(fù)合物聚集在離SERS檢測(cè)單元最近