專利名稱：前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒，用于前哨淋巴結(jié)的快速診斷方法，屬于 醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
前哨淋巴結(jié)(SLN)是指原發(fā)腫瘤區(qū)域引流的第一站淋巴結(jié)，是預(yù)測該腫瘤區(qū)域淋 巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況的重要指標(biāo)。SLN的存在，說明原發(fā)腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移是按可以預(yù)測的順 序經(jīng)淋巴管首先轉(zhuǎn)移至前哨淋巴結(jié)，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)端淋巴結(jié)。SLN作為有效的屏障可以 暫時(shí)阻止腫瘤細(xì)胞在淋巴道的進(jìn)一步擴(kuò)散。如果SLN無腫瘤轉(zhuǎn)移，理論上原發(fā)腫瘤引流區(qū) 域中其他淋巴結(jié)就不會發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移。乳腺癌SLNB的開展，使臨床醫(yī)生有可能選擇性地 切除那些最有可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，并根據(jù)前哨淋巴結(jié)的病理檢查結(jié)果，決定進(jìn)一 步的治療方案，使SLN陰性的患者免行乳腺癌腋淋巴結(jié)清掃術(shù)(ALND)。前哨淋巴結(jié)清掃術(shù) (SLNB)最終能否解決ALND的問題，還要看SLN是否能準(zhǔn)確地反映腋窩淋巴結(jié)的狀態(tài)。如 果SLN能夠準(zhǔn)確預(yù)測腋窩淋巴結(jié)的狀態(tài)(95% 100%)，那么SLNB就可以被廣泛的應(yīng)用。 SLNB作為判斷局部淋巴結(jié)狀態(tài)的診斷方法，在為臨床接受而成為一種有效方法之前，必須 明確其敏感性、特異性、陽性及陽性預(yù)測值、總準(zhǔn)確性以及假陰性率等問題。其中假陰性率 是最重要的一個(gè)因素，因?yàn)榧訇幮月士梢詫?dǎo)致治療上的錯(cuò)誤決定。免疫組化(IHC)是針對乳腺癌細(xì)胞中常見的突變蛋白，以其單克隆抗體與突變蛋 白結(jié)合達(dá)到檢測目的。但該項(xiàng)技術(shù)很難在臨床病理工作中推廣應(yīng)用快速病理切片較厚、染 色效果不佳，尚不能做到與常規(guī)石蠟病理完全相符合；常規(guī)的IHC染色需要很長的時(shí)間，不 能滿足手術(shù)需要。淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的臨床意義目前尚無定論。冰凍HE染色及CK-IHC的快速病理切片較厚、染色效果不佳，尚不能做到與常規(guī)石 蠟病理完全相符合；常規(guī)的IHC染色需要很長的時(shí)間，不能滿足手術(shù)需要。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒，通過免疫磁性分 離技術(shù)術(shù)中診斷前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，能夠快速、準(zhǔn)確地判斷出SLN陽性細(xì)胞。本發(fā)明的技術(shù)方案為
免疫磁性分離技術(shù)術(shù)中診斷運(yùn)用針對乳腺癌惡性腫瘤細(xì)胞特異性較強(qiáng)的大鼠抗人 moc-31單抗標(biāo)記乳腺癌前哨淋巴結(jié)中的惡性腫瘤細(xì)胞，而后用免疫磁珠分選系統(tǒng)富集前哨 淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液中的m0C-31+細(xì)胞，所富集得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，運(yùn)用 ⑶44v6、her-2以及mucin-1三種乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合標(biāo)記免疫磁性分 離所得到的細(xì)胞產(chǎn)品，以分析產(chǎn)物三種乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平，進(jìn) 而確定該前哨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況。前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒由四種抗體組成1.大鼠抗人moc-31抗體、2.大鼠抗 人CD44v6-FITC抗體、3.大鼠抗人her-2-percp抗體、4.大鼠抗人Mucinl-PE抗體；制備檢測方法如下 (l)SLN單細(xì)胞懸液的制備
1)所有操作均于超凈臺中進(jìn)行，將SLN置于干凈無菌的培養(yǎng)皿中，緩慢加入5-10ml 0. 9%生理鹽水，濕潤前哨淋巴結(jié)2分鐘；
2)用鑷子與培養(yǎng)皿中小心剝離淋巴結(jié)表面的脂肪及結(jié)締組織；
3)用無菌手術(shù)刀片將前哨淋巴結(jié)精確地分為四等份；
4)將其中兩部分分別進(jìn)行冰凍HE染色及CK-IHC染色；
5)剩余的兩部分行免疫磁珠分離；
6)將步驟5)中的兩部分置于1mm篩網(wǎng)上，下面置一無菌培養(yǎng)皿，用眼科剪小心將該兩 部分充分剪碎，置l_2mm小塊組織；
7)用研棒不停地研磨，并不時(shí)加入0.9%生理鹽水l_2ml，直至篩網(wǎng)上未見明顯組織；
8)收集培養(yǎng)皿中的單細(xì)胞懸液，并以0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗下層培養(yǎng)皿及篩網(wǎng)數(shù)次， 以盡可能收集較多的細(xì)胞；
9)將所收集的單細(xì)胞懸液過0.22// m的濾器除菌；
10)將濾過的單細(xì)胞懸液1500rpm、5min，離心一次；
11)棄上清，重懸于PH7.4的2 ml PBS磷酸鹽緩沖液中，并平均分配于兩個(gè)15ml離心 管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)；
12)將SLN單細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為107個(gè)/ml，備用。(2)免疫磁珠的預(yù)洗
1)根據(jù)靶細(xì)胞平均百分比確定靶細(xì)胞的數(shù)量；
2)按照每個(gè)靶細(xì)胞約4-8個(gè)磁珠的比例，加入適量的磁珠；
3)將所需的磁珠分別置于2個(gè)干凈無菌的2ml聚丙烯(EP)管中，將磁珠重懸于1ml 的TRIS-EDTA緩沖液中，混勻；
4)將兩個(gè)EP管分別置于磁性分離架(MPC-S)上分離lmin，可見磁珠貼壁；
5)用移液器小心吸取上層清液，注意此過程必須于磁場中進(jìn)行，且不能觸及壁上的 磁珠，以免影響磁珠的總量導(dǎo)致分離不充分；
6)將EP管中的磁珠重懸于1mlTRIS-EDTA緩沖液中，并按上述步驟沖洗兩遍；
7)將免疫磁珠重懸于lmlTRIS-EDTA緩沖液中，備用。(3)moc_31抗體的標(biāo)記
1)根據(jù)106個(gè)靶細(xì)胞Ing的量計(jì)算所需的moc-31抗體的量；
2)將所需量的moc-31抗體小心加入SLN的單細(xì)胞懸液中，4°C共育lOmin；
3)共育后，將上述步驟2)中的兩管單細(xì)胞懸液置于離心機(jī)上，800rpm，離心3分鐘， 吸棄上清，重懸下層沉淀于lml TRIS-EDTA緩沖液中；
4)重洗一遍，以除去殘留的moc-31，所得沉淀重懸于lmlTRIS-EDTA緩沖液中。(4)細(xì)胞分離
1)將所得SLN單細(xì)胞懸液加入預(yù)洗過的磁珠中，并用移液器充分混合；
2)將上述混合的SLN單細(xì)胞懸液避光、4°C共育15分鐘，此過程亦可置于冰盒上進(jìn) 行，以減少非特異性結(jié)合的比例；
3)將上述兩個(gè)EP管置于磁性分離架上細(xì)胞分離，磁珠與已標(biāo)記大鼠抗人moc-31抗
4體充分結(jié)合，在磁場中貼壁，每次兩分鐘；
4)在磁場中用移液器小心吸棄上清，并重懸磁珠于lmlTRIS-EDTA緩沖液中；
5)按上述步驟，細(xì)胞分離三次，使細(xì)胞分離最大化。(5)細(xì)胞洗脫
1)重配洗脫液在每管凍干的Dnase I中加入300" 1 Collection Releasing Buffer II，緩慢輕柔搖晃，溶解，混勻，分裝洗脫液于適當(dāng)容積，-20°C可保存9個(gè)月。使用 前解凍，解凍后于冰上使用；
2)將磁珠重懸于含F(xiàn)CS的buffer3中預(yù)處理3min，將4// 1分離緩沖液(Dnase I) 加入到各管樣品中，于冰盒上孵育lOmin。以100// 1-200// 1的移液器充分吹勻5_10次，使 細(xì)胞洗脫最大化；
3)將EP管置于磁性分離架上2min，將已洗脫的細(xì)胞上清液置于已預(yù)處理的EP管 中，將剩下的磁珠重懸于200// lbuffer3中；
4)重復(fù)上述洗脫步驟兩次，收集免疫磁珠分離富集的單細(xì)胞懸液，備用。(6)流式細(xì)胞分析
1)將免疫磁珠分離所富集的細(xì)胞產(chǎn)品重懸于200// 1 TRIS-EDTA緩沖液中，并置于 流式管中，每個(gè)SLN樣品各分實(shí)驗(yàn)管和對照管至少一管；
2)于實(shí)驗(yàn)管中同時(shí)加入鼠抗人⑶44V6-FITC單抗、鼠抗人her-2-percp單抗、大 鼠抗人Mucin 1-PE單抗各20" 1 ；
3)于對照管中加入三種相應(yīng)的同型對照抗體各20//1 ；
4)實(shí)驗(yàn)管于對照管均置于4°C共育10-20min，注意避光；
5)1200rpm/min離心5分鐘，棄上層清液；
6)將所得的細(xì)胞產(chǎn)品重洗一次，洗去殘余抗體；
7)將細(xì)胞重懸于500// 1 4%多聚甲醛或pH7. 40的PBS中，上流式儀檢測。本發(fā)明的有益效果為
傳統(tǒng)HE染色方法操作簡單、方便，用時(shí)少，但是其對前哨淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移敏感性較低， 尤其是其對前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移診斷的假陰性率較低已無法滿足現(xiàn)代乳腺外科學(xué)的要求。細(xì) 胞角蛋白免疫組化是近幾年的研究熱點(diǎn)，其由于增加了對比度，是前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移更容 易檢測出來。但是其操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，并且對人員的技術(shù)水平有較高的要求，限制了其 在臨床上的廣泛應(yīng)用。應(yīng)用特異性單抗免疫磁珠分離法術(shù)中診斷前哨淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況， 其操作較為方便，用時(shí)較少，整個(gè)過程能在60-70分鐘內(nèi)完成。并且其與傳統(tǒng)的術(shù)中冰凍HE 染色和CK-IHC相比，在前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷的敏感性和假陰性率方面有明顯的優(yōu)勢。三種 方法應(yīng)用價(jià)值的比較如表1所示
表1 三種前哨淋巴結(jié)術(shù)中診斷方法應(yīng)用價(jià)值的比較
冰凍HE染色CK-IHC磁珠分離法時(shí)間30-40min1-2天60-70min費(fèi)用780500250左右靈敏度68. 0%76. 0%96. 0%特異度100%100. 0%100%假陰性率32. 0%24. 0%4.0% 。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例前哨淋巴結(jié)的處理方式示意圖。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。原料來源
月中瘤標(biāo)志物:moc-31, CD44, her-2, Mucin—1
大鼠抗人moc-31抗體DAK0公司
大鼠抗人CD44v6-FITC抗體santa cruz公司
磁珠型號 Dynal beads M450, Invitrogen 公司
大鼠抗人her-2-percp抗體(使用常規(guī)抗體制備，標(biāo)記方法)
大鼠抗人Mucinl-PE抗體(使用常規(guī)抗體制備，標(biāo)記方法)
前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒由四種抗體組成1.大鼠抗人moc-31抗體、2.大鼠抗人 CD44v6-FITC抗體、3.大鼠抗人her-2-percp抗體、4.大鼠抗人Mucinl-PE抗體。制備及檢測方法
1、SLN單細(xì)胞懸液的制備
1)所有操作均于超凈臺中進(jìn)行，將SLN置于干凈無菌的培養(yǎng)皿中，緩慢加入5-10ml 0. 9%生理鹽水，濕潤前哨淋巴結(jié)2分鐘；
2)用鑷子與培養(yǎng)皿中小心剝離淋巴結(jié)表面的脂肪及結(jié)締組織；
3)用無菌手術(shù)刀片將前哨淋巴結(jié)精確地分為四等份，并按順時(shí)針方向依次標(biāo)記為A、B、 C、D四部分，如圖1所示，其中A、D部分行免疫磁珠分離。B、C兩部分行冰凍切片HE染色 及CK-IHC染色；
4)將對角線的B、C兩部分分別進(jìn)行冰凍HE染色及CK-IHC染色；
5)剩余A、D兩部分行免疫磁珠分離；
6)將A、D兩部分置于1mm篩網(wǎng)上，下面置一無菌培養(yǎng)皿，用眼科剪小心將該兩部分充 分剪碎，置l_2mm小塊組織；
7)用研棒不停地研磨，并不時(shí)加入0.9%生理鹽水l_2ml，直至篩網(wǎng)上未見明顯組織；
8)收集培養(yǎng)皿中的單細(xì)胞懸液，并以0.9%生理鹽水反復(fù)沖洗下層培養(yǎng)皿及篩網(wǎng)數(shù)次， 以盡可能收集較多的細(xì)胞；
9)將所收集的單細(xì)胞懸液過0.22 m的濾器除菌；
10)將濾過的單細(xì)胞懸液1500rpm、5min，離心一次；
11)棄上清，重懸于PH7.4的2 ml PBS磷酸鹽緩沖液中，并平均分配于兩個(gè)15ml離心 管中，細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)；
12)將SLN單細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為107個(gè)/ml，備用；
2、免疫磁珠的預(yù)洗
1)根據(jù)靶細(xì)胞平均百分比確定靶細(xì)胞的數(shù)量；
2)按照每個(gè)靶細(xì)胞約4-8個(gè)磁珠的比例，加入適量的磁珠；
3)將所需的磁珠分別置于2個(gè)干凈無菌的2ml聚丙烯(EP)管中，將磁珠重懸于1ml的TRIS-EDTA緩沖液中，混勻；
4)將兩個(gè)EP管分別置于MPC-S磁性分離架上分離lmin，可見磁珠貼壁；
5)用移液器小心吸取上層清液，注意此過程必須于磁場中進(jìn)行，且不能觸及壁上的磁 珠，以免影響磁珠的總量導(dǎo)致分離不充分；
6)將EP管中的磁珠重懸于lmlTRIS-EDTA緩沖液中，并按上述步驟沖洗兩遍；
7)將免疫磁珠重懸于lmlTRIS-EDTA緩沖液中，備用。3、moc_31抗體的標(biāo)記
1)根據(jù)106個(gè)靶細(xì)胞Ing的量計(jì)算所需的moc-31抗體的量；
2)將所需量的moc-31抗體小心加入SLN的單細(xì)胞懸液中，4°C共育lOmin；
3)共育后，將上述步驟2)中的兩管單細(xì)胞懸液置于離心機(jī)上，800rpm，離心3分鐘， 吸棄上清，重懸下層沉淀于lml TRIS-EDTA緩沖液中；
4)重洗一遍，以除去殘留的moc-31，所得沉淀重懸于lmlTRIS-EDTA緩沖液中。4、細(xì)胞分離
1)將所得SLN單細(xì)胞懸液加入預(yù)洗過的磁珠中，并用移液器充分混合；
2)將上述混合的SLN單細(xì)胞懸液避光、4°C共育15分鐘，此過程亦可置于冰盒上進(jìn)行， 以減少非特異性結(jié)合的比例；
3)將上述兩個(gè)EP管置于MPC-S磁性分離架上細(xì)胞分離，磁珠與已標(biāo)記大鼠抗人 moc-31抗體充分結(jié)合，在磁場中貼壁，每次兩分鐘；
4)在磁場中用移液器小心吸棄上清，并重懸磁珠于lml TRIS-EDTA緩沖液中；
5)按上述步驟，細(xì)胞分離三次，使細(xì)胞分離最大化。5、細(xì)胞洗脫
1)重配洗脫液在每管凍干的DnaseI中加入300" 1 Collection Releasing Buffer II，緩慢輕柔搖晃，溶解，混勻，分裝洗脫液于適當(dāng)容積，-20°C可保存9個(gè)月。使用 前解凍，解凍后于冰上使用；Buffer II 的配方RPMI-1640+1% FBS+lmM cacl2+4mM mgcl2 ；
2)將磁珠重懸于含F(xiàn)CS(Fetal calf serum)的Buffer3中預(yù)處理3min，將4" 1 分離緩沖液(Dnase I)加入到各管樣品中，于冰盒上孵育lOmin。以100// 1-200// 1的移 液器充分吹勻5-10次，使細(xì)胞洗脫最大化；Buffer 3配方PBS+0. 1%BSA ；
3)將EP管置于MPC-S磁性分離架上2min，將已洗脫的細(xì)胞上清液置于已預(yù)處理的 EP管中，將剩下的磁珠重懸于200 lbuffer3中；
4)重復(fù)上述洗脫步驟兩次，收集免疫磁珠分離富集的單細(xì)胞懸液，備用。6、流式細(xì)胞分析
1)將免疫磁珠分離所富集的細(xì)胞產(chǎn)品重懸于200// 1 TRIS-EDTA緩沖液中，并置于 流式管中，每個(gè)SLN樣品各分實(shí)驗(yàn)管和對照管至少一管；
2)于實(shí)驗(yàn)管中同時(shí)加入鼠抗人⑶44V6-FITC單抗、鼠抗人her-2-percp單抗、大 鼠抗人Mucin 1-PE單抗各20" 1 ；
3)于對照管中加入三種相應(yīng)的同型對照抗體各20//1 ；
4)實(shí)驗(yàn)管于對照管均置于4°C共育10-20min，注意避光；
5)1200rpm/min離心5分鐘，棄上層清液；
6)將所得的細(xì)胞產(chǎn)品重洗一次，洗去殘余抗體；7) 將細(xì)胞重懸于500// 1 4%多聚甲醛或pH7. 40的PBS中，上流式儀檢測。
最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒，其特征在于由大鼠抗人moc 31抗體、大鼠抗人CD44v6 FITC抗體、大鼠抗人her 2 percp抗體和大鼠抗人Mucin1 PE抗體四種抗體制備而成，其制備檢測方法如下(1)前哨淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液的制備將前哨淋巴結(jié)組織用生理鹽水濕潤，剝離淋巴結(jié)表面的脂肪及結(jié)締組織，將前哨淋巴結(jié)分為四份，將其中兩部分分別進(jìn)行冰凍HE染色及CK IHC染色，剩余的兩部分行免疫磁珠分離，并充分剪碎，研磨，沖洗，收集細(xì)胞，將所收集的單細(xì)胞懸液通過濾器除菌，離心，棄上清；(2)免疫磁珠的預(yù)洗按照每個(gè)靶細(xì)胞約4 8個(gè)磁珠的比例，加入適量的磁珠，置于無菌的聚丙烯管中，將磁珠重懸于TRIS EDTA 緩沖液中，混勻，將聚丙烯管分別置于磁性分離架上分離，吸取上層清液，將聚丙烯管中的磁珠重懸于緩沖液中沖洗；(3)moc 31抗體的標(biāo)記將所需量的moc 31抗體加入前哨淋巴結(jié)的單細(xì)胞懸液中，共育，然后離心，棄上清，重懸下層沉淀于 TRIS EDTA 緩沖液中；(4)細(xì)胞分離將所得前哨淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液加入預(yù)洗過的磁珠中，并混合，避光、共育，置于磁性分離架上進(jìn)行細(xì)胞分離，棄上清，并重懸磁珠于TRIS EDTA 緩沖液中；(5)細(xì)胞洗脫在每管凍干的Dnase I中加入CollectionReleasing Buffer II，溶解，混勻，分裝洗脫液，低溫保存，將磁珠重懸于含0.1% FCS(Fetal Calf Serum)的buffer 3(Buffer 3 配方PBS+0.1%BSA)中預(yù)處理，分離緩沖液加入到各管中，充分吹勻，使細(xì)胞洗脫最大化，磁性分離，將已洗脫的細(xì)胞上清液置于已預(yù)處理的聚丙烯管中，將剩下的磁珠重懸于buffer3中；(6)流式細(xì)胞分析將免疫磁珠分離所富集的細(xì)胞產(chǎn)品重懸于緩沖液中，并置于流式管中，加入鼠抗人CD44V6 FITC單抗、鼠抗人her 2 percp單抗、大鼠抗人Mucin 1 PE單抗，離心，棄上層清液，將所得的細(xì)胞重洗，洗去殘余抗體，將細(xì)胞重懸于多聚甲醛或PBS中，上流式儀檢測定量 。
全文摘要
本發(fā)明公開了前哨淋巴結(jié)快速診斷試劑盒，由大鼠抗人moc-31抗體、大鼠抗人CD44v6-FITC抗體、大鼠抗人her-2-percp抗體和大鼠抗人Mucin1-PE抗體四種抗體制備而成，其制備檢測方法包括前哨淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液的制備、免疫磁珠的預(yù)洗、moc-31抗體的標(biāo)記、細(xì)胞分離、細(xì)胞洗脫和流式細(xì)胞分析，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于操作較為方便，用時(shí)較少，整個(gè)過程能在60-70分鐘內(nèi)完成。并且其與傳統(tǒng)的術(shù)中冰凍HE染色和CK-IHC相比，在前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷的敏感性和假陰性率方面有明顯的優(yōu)勢。
文檔編號G01N33/532GK101975860SQ20101051272
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月20日
發(fā)明者嚴(yán)俊, 盧斌峰, 鞠景芳 申請人:江陰諾格生物科技有限公司