專利名稱：抑制膜蛋白受體聚集的抗癌藥物鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制膜蛋白受體聚集的抗癌藥物鑒定方法。
技術(shù)背景
癌癥一直是人類健康的最大殺手。細(xì)胞的過(guò)度增殖是癌癥發(fā)生和發(fā)展的原因，而 且細(xì)胞的過(guò)度增殖一般都與配體誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路尤其是生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的過(guò)度激活 有關(guān)。因此抑制這種細(xì)胞信號(hào)通路的過(guò)度激活，成為治療癌癥的重要途徑。生長(zhǎng)因子細(xì)胞 信號(hào)通路的激活首先是通過(guò)配體與其膜蛋白受體在細(xì)胞膜上結(jié)合，使受體產(chǎn)生自聚或異聚 而被激活。然后通過(guò)激活的受體再磷酸化下游通路的蛋白，使其下游蛋白被激活，從而激活 整個(gè)信號(hào)通路。因此，篩選出能截?cái)嗉せ钚盘?hào)通路的任一環(huán)節(jié)的化合物就能發(fā)展治療癌癥 的藥物。
目前抗癌藥物分子的主要篩選方法之一是首先通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬從化合物庫(kù)中找 出一些能與信號(hào)通路相關(guān)蛋白結(jié)合的候選物，然后對(duì)這些候選物分子進(jìn)行細(xì)胞水平的實(shí) 驗(yàn)，檢測(cè)其是否能夠抑制其配體誘導(dǎo)的下游蛋白的磷酸化水平，通過(guò)重復(fù)這些生化實(shí)驗(yàn)來(lái) 達(dá)到抗癌藥物篩選的目的，再進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。但是在篩選過(guò)程中普遍存在周期長(zhǎng)，操 作復(fù)雜，花費(fèi)高的問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便快捷的藥物篩選。因此，有必要發(fā)展一種簡(jiǎn)單快捷的 藥物篩選方法。
單分子熒光方法是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)。該方法不僅有極高的靈 敏度，而且還能展現(xiàn)出大量分子檢測(cè)時(shí)所掩蓋下單個(gè)分子的行為，已日益廣泛地應(yīng)用于細(xì) 胞水平對(duì)生物分子結(jié)構(gòu)和功能的動(dòng)態(tài)變化、分子間相互作用和生化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程的研 究。但目前還未見(jiàn)有利用該方法鑒定抗癌藥物的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抑制膜蛋白受體聚集的抗癌藥物鑒定方法。
本發(fā)明提供的藥物鑒定方法，包括如下步驟
1)向離體的癌癥細(xì)胞中轉(zhuǎn)入靶標(biāo)膜蛋白受體的基因，所述靶標(biāo)膜蛋白受體的基因 被熒光蛋白標(biāo)記，得到重組癌癥細(xì)胞；
2)將所述步驟1)所得重組癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育，孵育完畢后再加入 所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育，孵育完畢后將所述重組癌癥細(xì)胞進(jìn)行固定，得到待 檢測(cè)細(xì)胞樣品I ；
3)將步驟2、得到的待檢測(cè)細(xì)胞樣品I置于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡上進(jìn)行單分子 熒光成像，得到所述待檢測(cè)細(xì)胞樣品I的細(xì)胞圖像，進(jìn)而得到各個(gè)熒光點(diǎn)的漂白步數(shù)B
4)將所述步驟1)所得重組癌癥細(xì)胞和所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育，孵 育完畢后將所述重組癌癥細(xì)胞進(jìn)行固定，得到待檢測(cè)細(xì)胞樣品II，將所述待檢測(cè)細(xì)胞樣品 II按照與步驟；3)完全相同的步驟進(jìn)行單分子熒光成像，得到各個(gè)熒光點(diǎn)的漂白步數(shù)A ；
幻如果所述漂白步數(shù)B中的兩步漂白所得二聚體的比例小于所述漂白步數(shù)A中兩步漂白所得二聚體的比例，則所述待鑒定物質(zhì)為候選的抗癌藥物。
上述方法的步驟1)中，所述癌癥細(xì)胞均為離體的，并經(jīng)過(guò)孵育的。所述離體的癌 癥細(xì)胞為Hela細(xì)胞或MCF7細(xì)胞，優(yōu)選Hela細(xì)胞；所述靶標(biāo)膜蛋白的受體為T β RII，所述 靶標(biāo)膜蛋白受體的配體為TGFi3 1 ；所述熒光蛋白為GFP ；所述靶標(biāo)膜蛋白受體的基因是通 過(guò)T β RII-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述離體的癌癥細(xì)胞中；所述孵育步驟中，溫度為37°C，優(yōu)選37°C， 時(shí)間為18-30小時(shí)，優(yōu)選M小時(shí)。所述孵育步驟是在培養(yǎng)基中進(jìn)行的。各種能夠孵育該癌 癥細(xì)胞的培養(yǎng)基均適用，如可為胎牛血清體積百分比為10%的DMEM培養(yǎng)基。所述孵育步驟 中，孵育后的細(xì)胞覆蓋度為70-90 %，優(yōu)選80 %。
所述步驟2)將所述步驟1)所得重組癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育步驟中， 溫度為37°C，時(shí)間為30分鐘；再加入所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育步驟中，溫度為 37°C，時(shí)間為15-30分鐘，優(yōu)選15分鐘；固定步驟中，各種常用的固定劑均適用，如可選自多 聚甲醛的PBS緩沖液、丙酮溶液和乙醇溶液中的至少一種，優(yōu)選質(zhì)量百分濃度為4%的多聚 甲醛的PBS溶液，該緩沖液pH值為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，溫度為2_8°C，優(yōu)選4°C，時(shí)間為15-45 分鐘，優(yōu)選30分鐘。所述待鑒定物質(zhì)為式I所示柚皮素或式II所示白藜蘆醇。
權(quán)利要求
1.一種抗癌藥物的鑒定方法，包括如下步驟1)向離體的癌癥細(xì)胞中轉(zhuǎn)入靶標(biāo)膜蛋白受體的基因，所述靶標(biāo)膜蛋白受體的基因被熒 光蛋白標(biāo)記，得到重組癌癥細(xì)胞；2)將所述步驟1)所得重組癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育，孵育完畢后再加入所述 靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育，孵育完畢后將所述重組癌癥細(xì)胞進(jìn)行固定，得到待檢測(cè) 細(xì)胞樣品I ；3)將步驟幻得到的待檢測(cè)細(xì)胞樣品I置于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡上進(jìn)行單分子熒光 成像，得到所述待檢測(cè)細(xì)胞樣品的細(xì)胞圖像，進(jìn)而得到各個(gè)熒光點(diǎn)的漂白步數(shù)B;4)將所述步驟1)所得重組癌癥細(xì)胞和所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育，孵育完 畢后將所述重組癌癥細(xì)胞進(jìn)行固定，得到待檢測(cè)細(xì)胞樣品II，將所述待檢測(cè)細(xì)胞樣品II按 照與步驟幻完全相同的步驟進(jìn)行單分子熒光成像，得到各個(gè)熒光點(diǎn)的漂白步數(shù)A ；5)如果所述漂白步數(shù)B中的兩步漂白所得二聚體的比例小于所述漂白步數(shù)A中兩步漂 白所得二聚體的比例，則所述待鑒定物質(zhì)為候選的抗癌藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述離體的癌癥細(xì)胞是 經(jīng)過(guò)孵育的；所述離體的癌癥細(xì)胞為Hela細(xì)胞或MCF7細(xì)胞，優(yōu)選Hela細(xì)胞；所述熒光蛋白為GFP。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)孵育步驟中，溫度為37°C，時(shí) 間為18-30小時(shí)，優(yōu)選M小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述靶標(biāo)膜蛋白的受體為Tβ RII， 所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體為TGF3 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻將步驟1)所得重組 癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育步驟中，溫度為37°C，時(shí)間為30分鐘；再加入所述靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育步驟中，溫度為37°C，時(shí)間為15-30分鐘；所述固定步驟中，固定劑為質(zhì)量百分濃度為4%的多聚甲醛的PBS緩沖液，所述固定劑 的PH值為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4，溫度為2_8°C，優(yōu)選4°C，時(shí)間為15-45分鐘，優(yōu)選30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述靶標(biāo)膜蛋白 受體的基因是通過(guò)T β RII-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入所述離體的癌癥細(xì)胞中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述熒光點(diǎn)均為 像素小于或等于5X5的熒光點(diǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述漂白步數(shù)A中 兩步漂白所得二聚體的比例與所述漂白步數(shù)B中的兩步漂白所得二聚體的比例之差不小 于5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于將所述待檢測(cè)細(xì)胞樣品I和II置 于全內(nèi)反射顯微鏡的物鏡上進(jìn)行單分子熒光成像步驟之前，所述抗癌藥物的鑒定方法還包 括如下步驟分別將所述待檢測(cè)細(xì)胞樣品I和II用緩沖液洗滌；所述緩沖液均選自磷酸鹽緩沖液； 所述磷酸鹽緩沖液的PH值均為7. 2-7. 6，優(yōu)選7. 4。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述候選的抗癌藥物為能夠抑制所述靶標(biāo)膜蛋白的受體聚集的抗癌藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制膜蛋白受體聚集的抗癌藥物鑒定方法。該方法包括如下步驟1)向離體的癌癥細(xì)胞中轉(zhuǎn)入靶標(biāo)膜蛋白受體的基因，所述靶標(biāo)膜蛋白受體的基因被熒光蛋白標(biāo)記，得到重組癌癥細(xì)胞；2)將重組癌癥細(xì)胞和待鑒定物質(zhì)進(jìn)行孵育，孵育完畢后再加入靶標(biāo)膜蛋白受體的配體進(jìn)行孵育，孵育完畢后加入多聚甲醛的PBS溶液將重組癌癥細(xì)胞進(jìn)行固定，得到待檢測(cè)細(xì)胞樣品I；3)將待檢測(cè)細(xì)胞樣品I單分子熒光成像，得到細(xì)胞圖像，進(jìn)而得到各個(gè)熒光點(diǎn)的漂白步數(shù)，分析圖像統(tǒng)計(jì)其熒光點(diǎn)的漂白步數(shù)，以判斷該待鑒定物質(zhì)是否對(duì)膜蛋白受體聚集具有抑制作用。該方法具有操作簡(jiǎn)便，快捷，鑒定周期短，花費(fèi)小，可以鑒定各種抑制膜蛋白受體聚集的藥物。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102033056SQ201010514699
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者張偉, 方曉紅, 楊勇, 梁偉 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所