專利名稱：基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物納米檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種抗體檢測(cè)方法，借助于熒光共 振能量轉(zhuǎn)移過(guò)程的信號(hào)放大作用，通過(guò)構(gòu)建具有不同功能結(jié)構(gòu)域的聚合物，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)抗體 的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，已有多種納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得以應(yīng)用。磁性納 米顆粒就是一種很有應(yīng)用前景的材料，其已在醫(yī)學(xué)診斷和治療方面表現(xiàn)出諸多特性。由于 磁性納米顆粒能受外加磁場(chǎng)作用，使其在檢測(cè)、純化、排毒和給藥等方面具有廣泛應(yīng)用。
焚光共振會(huì)邑量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是 一個(gè)光物理過(guò)程，在此過(guò)程中能量從處于激發(fā)態(tài)的一個(gè)熒光團(tuán)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)上 (MethodsMo 1. Biol.，2006，335，243-255)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移只有在兩個(gè)熒光團(tuán)距離接近 且兩個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜相互重疊的情況下才會(huì)發(fā)生。分析學(xué)家利用這種現(xiàn)象 開(kāi)發(fā)出各種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法，其中最為普遍的便是應(yīng)用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈 擴(kuò)增技術(shù)當(dāng)中(Real Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)。實(shí)時(shí)聚合酶鏈擴(kuò)增利 用激發(fā)和發(fā)射光譜相互重疊的兩種熒光團(tuán)(報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán))標(biāo)記于核酸探針的兩端 而人為地制造熒光能量共振轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，在聚合酶鏈擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中聚合酶剪切探針從而釋 放出被淬滅的熒光團(tuán)，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，釋放出來(lái)的熒光團(tuán)越來(lái)越多，按靶分子比例增 加的熒光信號(hào)就可以對(duì)被擴(kuò)增的靶分子進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)聚合酶鏈擴(kuò)增最大的魅力就在于 其獨(dú)特的信號(hào)放大體系以及達(dá)到數(shù)個(gè)拷貝靶核酸分子的靈敏度(Eur. Food Res. Technol., 2007,226,1438-2377)。盡管實(shí)時(shí)聚合酶鏈擴(kuò)增最初是用于定量分析核酸分子，但這種獨(dú)特 的信號(hào)放大體系使得研究人員將其創(chuàng)造性地設(shè)計(jì)成超靈敏的抗體檢測(cè)方法-定量免疫聚 合酶鏈擴(kuò)增(quantitative Immuno-PCR, qlPCR)，使其靈敏度較之傳統(tǒng)的ELISA試驗(yàn)提高 7 10到1000倍(Nat. Protoc.，2007，2，1918-1930)。但該法的缺點(diǎn)也很明顯，主要體現(xiàn)在 檢測(cè)步驟過(guò)多(多達(dá)沈個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟)和檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。
許多研究者已成功利用熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)了生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)(Anal. Chem.，2006，78， 1104-1106 ；Anal. Chem.，2008，80，7996-8001 ；Nanoscale Res. Lett.，2009，4，1469-1474)， 但是這些技術(shù)幾乎都依賴于對(duì)不同的確定量的熒光信號(hào)進(jìn)行分析或?qū)Σ东@探針的熒光信 號(hào)進(jìn)行分析，沒(méi)有對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行任何的放大，使得樣品中微量物質(zhì)的檢測(cè)仍存在較大的難度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè) 方法，通過(guò)構(gòu)建具有不同功能結(jié)構(gòu)域的聚合物，完成對(duì)目標(biāo)分子的捕捉，并借助于熒光共振 能量轉(zhuǎn)移過(guò)程對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行放大，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)樣品中微量抗體的檢測(cè)。
多功能聚合物至少包括一個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?？贵w結(jié)合結(jié)構(gòu)域能與抗體結(jié)合，形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵。共價(jià)鍵是化學(xué)鍵的一種，兩個(gè)或多個(gè)原子共 同使用它們的外層電子，在理想情況下達(dá)到電子飽和的狀態(tài)，由此組成比較穩(wěn)定和堅(jiān)固的 化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)簡(jiǎn)單的成酯、成醚或還原反應(yīng)等化學(xué)過(guò)程就能使抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與抗體共 價(jià)結(jié)合，所形成的共價(jià)鍵，如但不僅限于，酰胺鍵、尿鍵、酯鍵、硫醚鍵、腙鍵、肟鍵和二硫鍵 等。非共價(jià)鍵并不依賴電子間的共享，而是依賴正負(fù)電荷間的吸引力，如但不僅限于，氫 鍵、疏水相互作用、范德華力和離子鍵等。例如葡萄球菌蛋白A(Pr0tein Α)能與抗體的Fc 片段非共價(jià)結(jié)合。
抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由一種或多種單體分子依次相連并能與抗體結(jié)合的分子，其可 以通過(guò)人工方式制備，如但不僅限于，化學(xué)合成，基因工程克隆表達(dá)和酶工程將不同分子 片段連接等方式，或非人工方式制備，如從生物體直接分離得到?；蚬こ讨亟M表達(dá)是 一種可選擇的，通過(guò)人工制備得到抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方式。即將與不同或相同抗體識(shí)別 表位相對(duì)應(yīng)的DNA序列連接于表達(dá)載體上(如表達(dá)質(zhì)粒)，再轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化入基因工程菌 后，再由發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)等方式進(jìn)行表達(dá)，最后經(jīng)過(guò)分離和純化步驟得到。組成目標(biāo)抗原 的基因數(shù)量不同，所適用的表達(dá)載體亦有不同。不同的表達(dá)載體也適用于不同的菌種或菌 株。常用的基因工程表達(dá)體系如大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和動(dòng)物細(xì)胞等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)教科書、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、設(shè)備手冊(cè)(如 GE Healthcare為AKTA系列純化系統(tǒng)配置的純化指導(dǎo)手冊(cè)或光盤)、試劑手冊(cè)和相應(yīng)的載 體設(shè)計(jì)軟件(如=DNAMAN和Vector NTI Suite)及其使用說(shuō)明就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗體結(jié)合 結(jié)構(gòu)域的制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，一個(gè)具備一般生物學(xué)常識(shí)的技術(shù)人員根據(jù)“《分子 克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002” 一書所記載的各種方法，就能夠?qū)崿F(xiàn)基因工 程領(lǐng)域的分子生物學(xué)各項(xiàng)操作和相應(yīng)的分離純化。
一種抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是由一種或多種氨基酸，如但不僅限于，色氨酸、蛋氨酸、 蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、 甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天(門)冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺，通過(guò)酰胺 鍵依次相連而形成的蛋白質(zhì)或多肽，其能夠與抗體結(jié)合。以蛋白質(zhì)或多肽為表現(xiàn)形式的抗 體結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)噬菌體展示(Phage Display)或組合化學(xué)等高通量篩選技術(shù)獲得， 并對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行優(yōu)化，還可以借助計(jì)算機(jī)軟件(如=AcceIrys公司開(kāi)發(fā)的各類系列軟件)， 對(duì)與特定抗體結(jié)合的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行預(yù)測(cè)與優(yōu)化。
核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域是具有核酸酶特性，能對(duì)核酸底物進(jìn)行酶切的物質(zhì)，能使核酸 底物分成兩段獨(dú)立的核酸片段。核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?yàn)樽匀唤缰幸汛嬖诘奶烊缓怂醿?nèi)切酶的 氨基酸全序列或其同源序列或部分序列或其同源序列。部分序列是取自于天然核酸內(nèi)切酶 的一段連續(xù)的氨基酸序列或其同源序列，也可以是將取自于天然核酸內(nèi)切酶不同部分的幾 段氨基酸序列互相連接形成的序列或其同源序列。將各個(gè)片段互相連接的方式包括但不 僅限于，各類聚合酶鏈擴(kuò)增(Polymerase Chain Reaction, PCR)技術(shù)，分子克隆技術(shù)，以及 表達(dá)和純化技術(shù)等，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)單獨(dú)或綜合運(yùn)用這些技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)各個(gè)片段互相 連接。本發(fā)明核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域優(yōu)先從天然限制性核酸內(nèi)切酶的全序列當(dāng)中進(jìn)行選擇。本 發(fā)明優(yōu)先從Mbo I限制性內(nèi)切酶(D13968，Genbank)序列中確定核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。本發(fā) 明進(jìn)一步優(yōu)先選擇的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域如SEQ ID No. 1所示。
通常情況下，需要一種連接子將多個(gè)不同功能的結(jié)構(gòu)域互相連接起來(lái)形成多功能聚合物。連接子與不同功能的結(jié)構(gòu)域之間形成共價(jià)鍵，如但不僅限于，酰胺鍵、尿鍵、酯鍵、 硫醚鍵、腙鍵、肟鍵和二硫鍵，各個(gè)結(jié)構(gòu)域與連接子之間的共價(jià)鍵可以相同或不同。
連接子是由若干重復(fù)結(jié)構(gòu)單位(structural unit)或單體(monomer)通過(guò)共價(jià) 鍵連接而成的分子，如但不僅限于，聚乙二醇(Adv. Drug deliv. Rev. ,28,275-299 ；Adv. Drug deliv. Rev.，54，453-609 ；Adv. Drug deliv. Rev.，60，1-88)、聚氨基酸、聚核苷酸、聚 乳酸、聚賴氨酸(Rev Mol Biotechnol.，2002，90，195-2 )、聚亞胺(Clin. Chem.，1994，40， 1845-1849 J. Immuno. Method.，1996，196，17-32)和10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵形成的多聚 糖(polysaccharide)，如但不僅限于，淀粉及其水解產(chǎn)物、纖維素、甲殼素或葡聚糖。連接 子的分子形狀為直線型(linear)、分枝型(branch/multi-arm)或分叉型(dendrimer)。一 種連接子，是由2-100個(gè)氨基酸形成的多肽或蛋白質(zhì)，通常選擇長(zhǎng)度為4-40個(gè)氨基酸的多 肽，優(yōu)先選擇長(zhǎng)度為4-30個(gè)氨基酸的多肽。組成這些多肽和蛋白質(zhì)的氨基酸指既具有共價(jià) 連接氨基又共價(jià)連接羧基的不對(duì)稱中心碳原子的有機(jī)分子。文獻(xiàn)ftOtein Eng. ,2001,14, 529-532中提供并詳細(xì)描述了多種用于多肽或蛋白連接的連接子，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可 以據(jù)此選擇適合的連接子。本發(fā)明優(yōu)先選擇的連接子為由25個(gè)氨基酸組成的多肽，如SEQ ID No. 2 所示。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物為雙鏈DNA，含有一條熒光共振能量轉(zhuǎn)移過(guò)程所需要 的核酸探針鏈。探針的5’端和3’端分別結(jié)合有熒光共振能量轉(zhuǎn)移過(guò)程所需要的報(bào)告基 團(tuán)(如FAM)和淬滅基團(tuán)(如EclipSe)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物還含有一段與所 選用的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，使得多功能聚合物對(duì)核酸底物進(jìn)行酶切后， 報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生熒光信號(hào)。例如多功能聚合物的蛋白核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域選擇SEQID No 1 所示的序列，熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸探針鏈優(yōu)先選擇SEQ ID No 6所示的序列，淬滅基團(tuán) Eclipse (最大吸收峰為522nm)結(jié)合于核酸探針鏈3’端，報(bào)告基團(tuán)FAM(最大發(fā)射波長(zhǎng)為 520nm)結(jié)合于核酸探針鏈5’端。
本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，先將第一 抗原固定于磁性納米顆粒形成磁性抗原顆粒，然后與含有目標(biāo)抗體的待測(cè)樣品共混，使第 一抗原與目標(biāo)抗體結(jié)合，之后向待測(cè)樣品中加入多功能聚合物，使多功能聚合物中的抗體 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與目標(biāo)抗體結(jié)合，形成形式為磁性抗原顆粒-目標(biāo)抗體-多功能聚合物的復(fù)合 物，最后加入熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物，使多功能聚合物中的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)晒?共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物進(jìn)行酶切，使得待測(cè)樣品中產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。隨著底物的增 加，其熒光信號(hào)也不斷增強(qiáng)，待測(cè)抗體的檢測(cè)信號(hào)的也被隨之放大。
本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其核酸內(nèi) 切酶結(jié)構(gòu)域優(yōu)選適用SEQ ID No. 1所示的序列或其同源序列。
本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其抗體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選適用SEQ ID No. 3所示的序列或其同源序列。
本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，優(yōu)選適用 SEQ ID No. 2所示的序列或其同源序列作為連接子。
本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，多功能聚 合物優(yōu)選適用SEQ ID No. 4所示的序列或其同源序列。與SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列 相應(yīng)的核酸序列如SEQ ID No. 5所示。
另一種本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，先 將第一抗原固定于磁性納米顆粒形成磁性抗原顆粒，然后與含有目標(biāo)抗體的待測(cè)樣品共 混，使第一抗原與目標(biāo)抗體結(jié)合，之后向待測(cè)樣品中加入如SEQ ID No.4所示的多功能聚合 物，使多功能聚合物中的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No. 3)與目標(biāo)抗體結(jié)合，形成形式為磁性 抗原顆粒-目標(biāo)抗體-多功能聚合物的復(fù)合物，最后加入含有SEQ ID No. 6的熒光共振能 量轉(zhuǎn)移核酸底物，使多功能聚合物中的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移核酸底物進(jìn) 行酶切，使得待測(cè)樣品中產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光信號(hào)。
本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果
本發(fā)明提供的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)并得 到了同時(shí)具有抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的多功能聚合物。當(dāng)結(jié)合有熒光共振能 量轉(zhuǎn)移的報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的核酸底物被核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域酶切后，報(bào)告基團(tuán)即產(chǎn)生熒 光信號(hào)。隨著核酸底物的不斷向待測(cè)樣品中加入，其熒光信號(hào)也不斷增強(qiáng)，待測(cè)抗體的檢測(cè) 信號(hào)的也被隨之放大。
與ELISA “夾心法”檢測(cè)相比，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法所用的檢測(cè)總時(shí)間低于2. 5 小時(shí)，而所能實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)限度為0. lng/ml，顯著提高了微量樣品的檢測(cè)能力和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明所涉及的術(shù)語(yǔ)與其一般概念相同。
所述的“抗原”是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖M(jìn)入機(jī)體后，可刺 激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測(cè)定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)?？乖?反應(yīng)性取決于抗原決定簇(antigenic determinant)，亦稱表位(印itope)。一個(gè)抗原分子 可帶有不同的決定簇。此外，還可以通過(guò)基因工程或化學(xué)連接的方式對(duì)表位進(jìn)行拼接。
所述的“抗體”是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immimoglobulin，Ig)。Ig 分五類，即IgG, IgA, IgM, IgD和IgE0與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM0
所述的“同源序列”是與天然序列之間具有40%以上同源性的序列，優(yōu)先選擇具有 70%以上同源性的序列，更優(yōu)先選擇具有90%以上同源性的序列，更優(yōu)先選擇具有95%以 上同源性的序列?！巴葱浴笔欠磻?yīng)兩個(gè)或多個(gè)蛋白/多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列之 間的關(guān)系，通過(guò)比較這些序列而確定。通常，同源性指所比較的序列長(zhǎng)度上兩個(gè)多核苷酸或 兩個(gè)蛋白/多肽序列，它們的核苷酸與核苷酸或者氨基酸與氨基酸之間的對(duì)應(yīng)是完全一 樣的。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，兩個(gè)或多個(gè)序列同源性的比較方法已為他們所熟知， 例如BLAST和FASTA程序。本發(fā)明中，所述的40 %、50 %、60 %、70 %、80 %和90 %均為同 源性百分比。
本發(fā)明“同源序列”是在天然序列基礎(chǔ)上采用“保守性”取代方式進(jìn)行。保守性氨 基酸取代可包括一組內(nèi)的同義氨基酸取代，同組氨基酸內(nèi)的氨基酸具有足夠相似的生理生 化特性，該組成員之間的取代將保留該分子的生物功能(kience，1974，185，862-4)。在上 述序列中也可進(jìn)行氨基酸的插入或/和缺失而不改變其功能，特別是如果這種插入或缺失 只涉及少數(shù)氨基酸時(shí)，如30個(gè)以下，最好為10個(gè)以下，而且不除去或取代對(duì)功能性構(gòu)型起 關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。這類缺失或/和插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬 于本發(fā)明范圍。
優(yōu)先選擇的，本發(fā)明同義氨基酸對(duì)SEQ ID No 1、SEQ ID No 3和SEQ ID No 4進(jìn)行保守性取代的方式。
權(quán)利要求
1.一種基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，先將第一抗原固定于 磁性納米顆粒形成磁性抗原顆粒，然后與含有目標(biāo)抗體的待測(cè)樣品共混，使第一抗原與目 標(biāo)抗體結(jié)合，之后向待測(cè)樣品中加入多功能聚合物，使所述的多功能聚合物與目標(biāo)抗體結(jié) 合，形成形式為磁性抗原顆粒-目標(biāo)抗體-多功能聚合物的復(fù)合物，最后加入熒光共振能量 轉(zhuǎn)移核酸底物，使得待測(cè)樣品中產(chǎn)生可被檢測(cè)的熒光信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的多功能聚合物至少包括一個(gè)抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是SEQ ID No. 3所示的序列或其同源序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)λ龅臒晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移核酸底物進(jìn)行酶切。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域是SEQ ID No. 1所示的序列或其同源序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的多功能聚合物至少包括一個(gè)連接子，所述的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述的核酸 內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域分別與連接子連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的連接子是SEQ ID No. 2所示的序列或其同源序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的多功能聚合物是SEQ ID No. 4所示的序列或其同源序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，其 特征在于所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物含有SEQ ID No 6所示的熒光共振能量轉(zhuǎn)移核 酸探針鏈。
10.一種基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，先將第一抗原固定 于磁性納米顆粒形成磁性抗原顆粒，然后與含有目標(biāo)抗體的待測(cè)樣品共混，使第一抗原與 目標(biāo)抗體結(jié)合，之后向待測(cè)樣品中加入多功能聚合物，使所述的多功能聚合物與目標(biāo)抗體 結(jié)合，形成形式為磁性抗原顆粒-目標(biāo)抗體-多功能聚合物的復(fù)合物，最后加入熒光共振能 量轉(zhuǎn)移核酸底物，使得待測(cè)樣品中產(chǎn)生可被檢測(cè)的熒光信號(hào)；所述的多功能聚合物是SEQ ID No. 4所示的序列或其同源序列；所述的熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物含有SEQ ID No 6所示的熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸探 針鏈。
全文摘要
一種基于多功能聚合物和熒光共振能量轉(zhuǎn)移的抗體檢測(cè)方法，先將第一抗原固定于磁性納米顆粒形成磁性抗原顆粒，然后與含有目標(biāo)抗體的待測(cè)樣品共混，使第一抗原與目標(biāo)抗體結(jié)合，之后向待測(cè)樣品中加入多功能聚合物，使所述的多功能聚合物與目標(biāo)抗體結(jié)合，形成形式為磁性抗原顆粒-目標(biāo)抗體-多功能聚合物的復(fù)合物，最后加入熒光共振能量轉(zhuǎn)移核酸底物，使得待測(cè)樣品中產(chǎn)生可被檢測(cè)的熒光信號(hào)。與ELISA“夾心法”檢測(cè)相比，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法所用的檢測(cè)總時(shí)間低于2.5小時(shí)，而所能實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)限度為0.1ng/ml，顯著提高了微量樣品的檢測(cè)能力和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102033057SQ20101054799
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月17日
發(fā)明者崔大祥, 楊浩, 胡恒瑤 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 蘇州康立達(dá)納米生物工程有限公司